Summary
Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.
Abstract
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser um grande problema de saúde, apesar da introdução da terapia antirretroviral combinada (cART) em meados da década de 1990. Embora a terapia antirretroviral reduza eficientemente a carga viral sistêmica e restaure a contagem normal de células T CD4+ T, ela não reconstitui um sistema imunológico completamente funcional. Um sistema imunológico disfuncional em indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART pode ser caracterizado por ativação imunológica, envelhecimento precoce de células imunes ou inflamação persistente. Essas condições, juntamente com fatores comórbidos associados à infecção pelo HIV, adicionam complexidade à doença, que não pode ser facilmente reproduzida em modelos celulares e animais. Para investigar os eventos moleculares subjacentes à disfunção imunológica nesses pacientes, um sistema para cultura e manipular monócitos primários humanos in vitro é apresentado aqui. Especificamente, o protocolo permite a cultura e transfecção do CD14 primário+ monócitos obtidos a partir de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART, bem como de controles HIV-negativos. O método envolve isolamento, cultura e transfecção de monócitos e macrófagos derivados de monócitos. Embora kits e reagentes comercialmente disponíveis estejam empregados, o protocolo fornece dicas importantes e condições otimizadas para aadesão bem-sucedida e transfecção de monócitos com miRNA imitadores e inibidores, bem como com siRNAs.
Introduction
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) causa disfunção imunológica grave, o que pode levar a infecções oportunistas e à síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Embora os pacientes infectados pelo HIV submetidos a CART sejam caracterizados por baixas cargas virais e contagens normais de células T CD4+ T, o funcionamento do sistema imunológico pode ser comprometido nesses indivíduos, levando a uma resposta imune disfuncional que tem sido associada a um risco aumentado de desenvolver câncer1. Os mecanismos de disfunção imunológica em pacientes com HIV em cART permanecem em grande parte desconhecidos. Portanto, caracterizar as células imunes derivadas do paciente e investigar sua biologia e função é um componente crítico da pesquisa atual sobre HIV.
Monócitos e macrófagos são reguladores-chave das respostas imunes e desempenham papéis fundamentais na infecção pelo HIV2,3,4,5. Heterogêneo e plástico na natureza, macrófagos podem ser amplamente classificados em ativado classicamente (M1) ou ativado alternativamente (M2). Embora essa classificação geral seja necessária na criação de condições experimentais, o status de polarização dos macrófagos pode ser revertido por uma variedade de citocinas6,7,8,9. Embora vários estudos tenham investigado os efeitos da infecção pelo HIV em monócitos e células dendríticas, detalhes moleculares de respostas mediadas por monócito são em grande parte desconhecidos6,7,10,12,12,14,15,16,17,18,19. Entre os fatores envolvidos na regulação e função das células imunes, microRNAs (miRNAs), RNAs curtos não codificadores que regulam a expressão gênica pós-transcritoria, têm demonstrado desempenhar um papel importante no contexto das principais vias celulares (ou seja, crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose)20. Estas moléculas têm sido descritas como importantes reguladores de fatores de transcrição essenciais para ditar a polarização funcional dos macrófagos21. O papel potencial dos miRNAs em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART tem sido investigado, mas o progresso no campo requer muito mais trabalho22,23,24,25,26. Este artigo discute um método otimizado para transfect miRNAs e siRNAs em monócitos humanos primários de pacientes infectados pelo HIV e controles.
Este protocolo baseia-se em reagentes e kits comercialmente disponíveis, uma vez que a continuidade no procedimento técnico ajuda a eliminar variáveis experimentais desnecessárias ao trabalhar com amostras clínicas. No entanto, o método fornece dicas importantes (ou seja, o número de células banhadas ou breve incubação com mídia livre de soro para promover a adesão das células à placa). Além disso, as condições de polarização utilizadas neste protocolo são derivadas do trabalho publicado27,28,29.
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Protocol
Todos os métodos descritos abaixo foram aprovados pelo Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Todo o sangue foi coletado após a obtenção de consentimento informado.
NOTA: Todo o procedimento é realizado em condições estéreis em uma instalação de nível 2 de biossegurança (BSL2) para que o cuidado seja usado para lidar com materiais biológicos. Em particular, cada etapa é realizada usando técnicas estéreis um armário de biossegurança. Após cada etapa envolvendo sangue, produtos sanguíneos, células ou tubulação de produtos celulares, é importante enxaguar todo o material plástico (ou seja, pipetas sorológicas, pontas de pipetas e tubos) com 10% de lixívia de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte adequado.
1. Isolamento de monócitos humanos primários por seleção negativa imunomagnética
- Colete 40 mL de sangue integral humano fresco (de um HIV+ paciente ou controle saudável) em quatro tubos de vácuo etilediaminatetraáticos (EDTA) de 10 mL( 10 mL de sangue por tubo). Usando técnicas estéreis um armário de biossegurança, transfira todos os 40 mL do sangue em um tubo cônico do propileno de 50 mL.
- Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de isolamento monócito humano selecionado(Mesa de Materiais),adicione 2 mL de coquetel de isolamento monócito, fornecido no kit, ao tubo de sangue. Vortex contas magnéticas, também fornecido no kit, para 30 s, e adicionar 2 mL para o tubo de sangue.
- Se menos de 40 mL de sangue estiver disponível, reduza os reagentes adicionados. Para misturar a solução, pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Separe a mistura de sangue igualmente em quatro tubos de 50 mL e adicione 30 mL de soline estéril tampão de fosfato (PBS) contendo 1 mM EDTA para cada tubo. Misture por pipetting cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL.
- Coloque os tubos em suportes de ímã por 10 min para remover as contas magnéticas conjugadas com anticorpos. Use quatro suportes do ímã simultaneamente, um para cada tubo, para permitir tempos consistentes da incubação e da isolação para cada amostra de sangue.
- Elabore o conteúdo do centro de cada tubo, usando uma pipeta, enquanto eles ainda estão nos suportes do ímã. Tenha cuidado para não elaborar glóbulos vermelhos (não mais do que 10% do volume inicial de 10 mL), e coloque o conteúdo em um dos quatro novos tubos de 50 mL.
- Adicione 500 μL de contas magnéticas vórticeas a cada tubo de 50 mL. Pipeta para cima e para baixo com uma pipeta de 25 mL e incubar em RT para 5 min. Em seguida, coloque os tubos em suportes de ímã por 5 min.
- Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo enquanto ainda está em suportes de ímã para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Coloque diretamente cada novo tubo de 50 mL nos suportes de ímã por 5 min.
- Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Gire todos os novos tubos de 50 mL a 300 x g por 5 minutos. Aspirar o supernatant e resuspender todas as quatro pelotas celulares em um total de 10 mL de PBS estéril.
- Conte as células por exclusão azul trypan usando um hemocytometer.
NOTA: 8-20 x 106 células são geralmente obtidas a partir de 40 mL de sangue inteiro.
2. Culturing de monócitos humanos primários
- Usando um banho de água 37 °C, a mídia RPMI 1640 sem soro quente complementada com 1% penicilina-estreptomicina (caneta/estreptococo), e (continuando a usar técnicas estéreis um armário de biossegurança) resuspende os monócitos isolados nesta mídia a uma concentração de 1 x 106 células/mL.
- Adicione 1 mL de células resuspensas a cada poço de uma placa de 6 poços ou em um prato de 35 mm (o número final de células deve ser 1 x 106 células/placa), e coloque em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2. Espere 0,5-1,0 h para as células a aderir.
- Usando um banho de água 37 °C, calor quente inativado (HI) soro fetal bovino (FBS). Adicione 100 μL (10% de concentração final) da FBS a cada placa. Adicionar fatores de crescimento para as células para promover a diferenciação de macrófagos.
- Macrófagos prime para um fenótipo m1-like, adicionando 25 ng /mL de granulocito-macrófago colônia de estímulo fator (GM-CSF) para a mídia. Macrófagos prime para um fenótipo m2-like, adicionando 50 ng /mL de macrófago colônia de estímulo fator (M-CSF) para a mídia28.
NOTA: Tanto gm-CSF e M-CSF permitir diferenciação monócito para um fenótipo de macrófago geral (M0), enquanto as células priming para M1 ou M2, respectivamente7,28,30.
- Macrófagos prime para um fenótipo m1-like, adicionando 25 ng /mL de granulocito-macrófago colônia de estímulo fator (GM-CSF) para a mídia. Macrófagos prime para um fenótipo m2-like, adicionando 50 ng /mL de macrófago colônia de estímulo fator (M-CSF) para a mídia28.
3. Transfecting monocytes humanos preliminares na cultura
- Monócitos transfect com miRNA imita ou inibidores ou siRNA usando um kit contendo um reagente de transfecção à base de polímero(Mesa de Materiais).
- Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transfecção (e continuando o uso de técnicas estéreis um armário de biossegurança), diluir pela primeira vez os imitadores/inibidores de miRNA selecionados ou siRNAs no buffer para uma concentração final de 1,83 μM. Prepare 10 μL de mi-inibidor diluído por transfecção de 1 x 106 células.
- Prepare o reagente de transfecção adicionando 1 μL do polímero fornecido a um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL, seguido imediatamente adicionando 90 μL de buffer fornecido (para um total de 91 μL de reagente por transfecção). Vórtice por 3-5 s.
- Pipette 90 μL de solução de transfecção no tubo contendo 10 μL de miRNA diluído mimic/inibidor ou siRNA. Misture por pipetting suave e incubar por 15 min em RT.
- Adicione 100 μL de complexo de transfecção a um poço (ou prato) de 1 x 106 monócitos banhados. As células incubadas por 4 h a 37 °C, em seguida, substituir o meio com 3 mL de mídia completa (RPMI 1640 complementado com 1% penicilina-estreptomicina e 10% fbs inativado de calor) contendo GM-CSF ou M-CSF.
4. M1/M2 diferenciação e ativação
- Os monócitos começam imediatamente a diferenciar-se aos macrófagos M0 largos em cima do revestimento na cultura. No terceiro dia após o revestimento, continue usando técnicas estéreis um armário de biossegurança e substitua a mídia por 3 mL de novos meios de comunicação RMPI 1640 (complementado com 1% de penicilina-estreptomicina, 10% FBS inativado pelo calor e 25 ng/mL GM-CSF para promover a polarização semelhante à M1 ou 50 ng/mL M-CSF para promover a polarização semelhante à M2). Cultura as células nestas condições para um total de 6 dias a partir de revestimento inicial em uma incubadora em 37 °C, 5% CO2.
- Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de macrófago M1-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS inativada pelo calor de 5%, 1% caneta/estreptococo, 100 ng/mL E. coli-lipopolissaccharide derivado (LPS) e 20 gamma interferon ng/mL (IFN-γ).
- Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de m2-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS 5% inativada pelo calor, 1% caneta/estreptococo, 10 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL interleucina 4 (IL-4).
- Após 24 h, colher as células para análises de RNA, proteína ou citometria de fluxo.
- Quando as células estão prontas para coleta, lave as células no prato 2x com PBS (em RT para extração de RNA ou refrigerados no gelo para extração de proteínas). Como os macrófagos diferenciados estão agora firmemente ligados às placas, lyse as células em placas diretamente para obter material para análises de RNA e proteínas.
- Para a coleta de material para citometria de fluxo, adicione PBS contendo 2 mM EDTA para o prato, incubar as células por 10 min em 37 °C, raspar suavemente as células do prato, e recolher o conteúdo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL antes de prosseguir com protocolos padrão.
5. Citometria flow
- Lave as células em PBS para remover o meio de cultivo. Desça 100.000 células (por cada condição de citometria de fluxo) e resuspenda a pelota em 100 μL de PBS contendo 2 μL de inibidor de ligação HuFcR. Incubar em RT por 15 min.
- Adicione 50 μL de buffer de coloração e os anticorpos desejados (aqui, CD80, CD83, CD163 e CD209 foram usados) nas quantidades recomendadas.
- Misture suavemente e incubar a 4 °C no escuro por 30 min.
- Lave 2x com PBS e resuspenda as células manchadas em 150 μL de PBS antes de executar a amostra em um citofluorímetro.
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Representative Results
Usando o procedimento descrito, os monócitos humanos preliminares dos indivíduos HIV-contaminados e os doadores saudáveis foram isolados. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de HIV+ sujeitos submetidos a cART com baixa (<20 cópias/mL) ou cargas virais indetectáveis e contagens normais de células T CD4+ T. Imediatamente após o isolamento, as células foram manchadas, e citometria de fluxo foi realizada para confirmar a pureza das populações celulares. Os resultados mostraram que >97% das células manchadas positivas para CD14 (dados não mostrados). Para polarização de macrófagos, um protocolo publicado foi utilizado28. Os monócitos humanos primários foram cultivados na presença de GM-CSF ou M-CSF por 6 dias. No sexto dia, as células foram ativadas para macrófagos M1 ou M2. Vinte e quatro horas após a ativação, as células foram colhidas e manchadas para análise de citometria de fluxo de marcadores de células de macrófagos.
A Figura 1 mostra histogramas representativos de controle ativado por M1 -(Figura 1A)e células derivadas do paciente(Figura 1B)com aumento dos níveis de CD80 e CD83 e diminuição dos níveis de CD163 quando comparados às células T0 não ativadas, bem como células ativadas por M2 com níveis aumentados de CD163 e CD209. O painel C em mostra expressão de CD80, CD83, CD163 e CD209 em células polarizadas M1 e M2. O gráfico representa os dados médios obtidos de três conjuntos de células derivados do HIV e de controle. Como esperado, os níveis de expressão de CD80 e CD83 aumentaram em M1 em comparação com as células polarizadas por M2, enquanto cd209 e CD163 foram mais altamente expressos em M2 em comparação com células polarizadas M1. Curiosamente, CD80 e CD83 pareciam ser mais altamente expressos em células derivadas de controle em comparação com as células derivadas do HIV. No entanto, as diferenças potenciais na capacidade de polarizar e/ou expressão de marcadores de polarização nas células derivadas do HIV em comparação com os controles requer uma investigação mais aprofundada. Embora gm-csf, m-csf, lps, e ifn-γ foram escolhidos como tratamentos, outras combinações de fatores de crescimento, citocinas, ou estimuladores podem ser usados com este protocolo28.
Depois que as experiências preliminares mostraram que o procedimento da isolação era bem sucedido, os monocytes recentemente coletados foram chapeados em 6 placas bem e contaminados com um miRNA mexido, próximo-infravermelho-etiquetado para determinar a eficiência da transfecção. As células foram imagemdas 24 h pós-transfecção por microscopia confocal fluorescente. Com este método, foi alcançada a eficiência da transfecção e a eficiência confocal de 90%, conforme determinado pela citometria de fluxo(Figura 2A)e microscopia confocal (Figura 2B).
Em seguida, a viabilidade das células após a transfecção foi determinada. A Figura 3 mostra a viabilidade das células, determinada com um ensaio colorimétrico como uma média de células derivadas de dois pacientes(Figura 3A)e dois controles(Figura 3B)transfecídos no dia 1(Figura 3A)ou dia 4 ( Figura3B)e colhidos no dia 7. Para este experimento, 50.000 células foram banhadas em uma placa de 96 multi-poços e transfetidas seguindo o protocolo. Em geral, a transfecção não reduziu significativamente a viabilidade das células, independentemente do estágio de maturação das células e das condições de transfecção (ou seja, mock, scrambled siRNA/miRNA, ou siRNA/miRNA). Note-se que a Figura 3 representa dados obtidos de células derivadas do paciente (painel A) e células derivadas de controle (painel B). Isso foi necessário, uma vez que não foram necessárias células suficientes para realizar o experimento completo (viabilidade e mancha ocidental para transfecções do dia 1 e 4 do dia 4, em seis condições diferentes por transfecção) com uma única amostra puderam ser obtidas. No entanto, o número fornece resultados representativos obtidas com células derivadas de controle ou paciente.
Em seguida, a eficácia da transfecção de siRNA no mRNA alvo foi avaliada através da avaliação da expressão proteica. Os resultados na Figura 4 mostram uma inregulação eficaz do EIF4EBP1, um regulador translacional altamente abundante nessas células, após a transfecção com um siRNA específico em ambos os dias 1(Figura 4A)e dia 4 (Figura 4C). O mesmo regulador também manteve a expressão as várias condições de controle (ou seja, não transacionadas, zombar, siRNA embaralhada e SiRNA EIF4EBP1 sem reagente de transfecção: siR*). Quantificação de experimentos de borrão ocidental para o dia 1 e dia 4 transfecção são mostrados na Figura 4B e Figura 4D, respectivamente. Além disso, os níveis de expressão de miR-146a-5p após a transfecção no dia 1 ou dia 4 por RT-qPCR de células derivadas do HIV foram determinados(Figura 4E). Células transinfectadas com miRNA mimic mostraram um aumento de 48 a 72 vezes na expressão de miRNA sobre células não transinfectadas, enquanto todos os controles de transfecção não mostram alterações apreciáveis.
Figura 1: Macrófagos derivados de monocyte são polarizados e ativados com sucesso para fenótipos de macrófagos M1 ou M2. Os resultados da análise de citometria do fluxo de células derivadas de um controle saudável (A) e uma amostra de células derivadas do HIV (B) mostram níveis de CD80, CD83, CD163 e CD209. O experimento foi repetido com dois controles adicionais e duas amostras hiv-positivas adicionais com resultados semelhantes. A população celular de interesse foi fechada com base em parâmetros de dispersão para a frente e para o lado, seguidos de discriminação dupla. (C) Gráfico da barra que mostra CD80, CD83, CD163, e CD209 em pilhas polarizadas M1 e M2. O gráfico representa os dados médios e os desvios padrão obtidos de três conjuntos de células de controle (Ctrl) e três células derivadas do HIV (Pts). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: As células CD14+ humanos primários são eficientemente transecidas com miRNAs. (A) Análise de citometria de fluxo de monócitos primários derivados de controles saudáveis, 24 h pós-transfecção, mostrando eficiência de transfecção >90%. (B) Imagem confocal representativa tirada 24 h pós-transfecção mostra que todas as células do campo expressam o miRNA conjugado com um tineto infravermelho próximo (em branco). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Viabilidade das células transfeccionadas. As barras gráficas representam a viabilidade média celular de dois pacientes HIV+ (A) e dois controles saudáveis (B) determinados usando um ensaio colorimétrico, após a transfecção com miR-146a-5p ou siRNA para EIF4EBP1 (siRNA) e os controles apropriados no dia 1 (A) ou dia 4 (B), todos testados no dia 7. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Downregulation eficiente de níveis da proteína em cima do siRNA/miRNA transfecção borne-isolação de CD14+ monocytes. Os monócitos derivados do controle e do HIV (1 x 106 células) foram transinfectados no dia 1 (A) ou no dia 4 (C) após o isolamento, usando siRNA contra o MRNA EIF4EBP1. Os painéis (B) e (D) representam a quantificação da expressão eIF4EBP1 em comparação com gapdh e é expresso como a porcentagem sobre mock para paciente (Pt) ou controle (Ctrl) (A) ou não transacionado para paciente ou controle (B). (E) Gráfico de barra representativo de dois experimentos mostrando expressão miR-146a-5p em células derivadas do HIV transfected no dia 4 (barras 1-4) ou dia 1 (barra direita) e colhido no dia 7. A alteração da dobra é calculada sobre a amostra não transizada (siR = siRNA). siR* ou miR-145a-5p* indicam incubação das células com siRNA ou miR-146a-5p sem o reagente de transfecção. O experimento foi repetido 2x com células derivadas de controle e produziu essencialmente os mesmos resultados (dados não mostrados). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O protocolo apresentado demonstra o uso de células primárias de indivíduos infectados pelo HIV como modelo para o estudo de monócitos e macrófagos. HIV+ pacientes submetidos a cART vivem com infecção por vários anos e também podem ter outras co-infecções relacionadas a um sistema imunológico comprometido. Para estudar a imunomodulação na presença de infecção crônica do HIV, as células foram colhidas diretamente dos pacientes. Como miRNAs têm demonstrado desempenhar papéis importantes no desenvolvimento celular e diferenciação, o protocolo se concentra na capacidade de manipular a expressão miRNA nessas células primárias (Figura 2, Figura 3, Figura 4). Utilizando o mesmo procedimento, este protocolo também funciona muito bem para siRNAs (Figura 3, Figura 4). Devido à potencial atividade fagocítica dos macrófagos maduros, além de simular e embaralhar controles de siRNA, um controle é usado (indicado como siR* ou miR* na Figura 3 e Figura 4),em que o reagente de transfecção é omitido. Os dados confirmam que o reagente de transfecção é necessário para a entrega adequada de siRNA/miRNA nas células, como sem o reagente, as células não captam espontaneamente o miRNA ou siRNA, mesmo quando já estão diferenciadas em macrófagos (dia 4 após o revestimento e polarização, Figura 3 e Figura 4).
Ao usar kits comercialmente disponíveis para isolamento e transfecção de CD14+ monócitos primários humanos, há etapas-chave otimizadas para tornar o procedimento reproduzível e bem-sucedido. Especificamente, 1) o número de células banhadas é fundamental para a sua sobrevivência e diferenciação, e 1 x 106 células/35 mm prato foi encontrado para funcionar melhor. 2) As células CD14+ recém-isoladas não se ligam uniformemente ao prato de cultura se semeadas na presença da FBS. Como conseqüência, ao substituir o 4h médio após a transfecção, todas as células desanexadas serão removidas, tornando as condições de placa para placa altamente variáveis. 3) Verificou-se que a substituição do meio 4 h após a transfecção, reduz a toxicidade devido à transfecção de reagentes, sem afetar a eficiência da transfecção. 4) As condições de transfecção foram otimizadas para exigir menos siRNA ou miRNA (15 nM) do que as concentrações recomendadas pelo fabricante (25 nM). 5) Devido à natureza altamente aderente das células, adicionar o amortecedor de líse diretamente à placa melhora muito a concentração de proteínas ou RNA colhidos. No entanto, se for necessário remover as células da placa (ou seja, para análise de citometria de fluxo), é melhor usar PBS com EDTA e raspar suavemente as células. Este método reduz o número de células coletadas em aproximadamente 20%-30%, por isso é importante planejar experimentos de acordo para obter números celulares suficientes para análise mais aprofundada.
Quando seguido corretamente, este procedimento demonstra a obtenção de CD14 altamente puro+ população de monócitos, transfecção de siRNAs e pequenos RNAs, como miRNAs, condições de cultura e diferenciação em macrófagos M1 ou M2. Este método pode ser aplicado para estudar doenças complexas ou infecções diferentes do HIV.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Núcleo biorepositório clínico/tumoral do HIV por fornecer amostras de pacientes e o Núcleo de Metabolismo de Imunologia Celular por fornecer análise de citometria de fluxo. Este projeto foi financiado pelo NIH P20GM121288e e P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
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