Summary
Præsenteret her er en optimeret protokol til isolering, culturing, transfficerende, og differentiere menneskelige primære monocytter fra HIV-inficerede individer og sunde kontroller.
Abstract
Humant immundefektvirus (HIV) er fortsat et stort sundhedsproblem på trods af indførelsen af kombineret antiretroviral terapi (cART) i midten af 1990 ' erne. Mens antiretroviral behandling effektivt sænker systemisk viral belastning og genopretter normale CD4+ T- celletal, er det ikke rekonstruere et helt funktionelt immunsystem. Et dysfunktionelt immunsystem i HIV-inficerede individer gennemgår cART kan være karakteriseret ved immun aktivering, tidlig aldring af immunceller, eller vedvarende inflammation. Disse betingelser, sammen med comorbiditet faktorer forbundet med HIV-infektion, tilføje kompleksitet til sygdommen, som ikke let kan gengives i cellulære og animalske modeller. For at undersøge de molekylære hændelser underliggende immun dysfunktion hos disse patienter, et system til kultur og manipulere menneskelige primære monocytter in vitro præsenteres her. Specifikt, protokollen giver mulighed for kultur og transfektering af primære CD14+ monocytter opnået fra HIV-inficerede personer gennemgår cART samt fra hiv-negative kontroller. Metoden involverer isolation, kultur og transfektering af monocytter og monocyt-afledte makrofager. Mens kommercielt tilgængelige kits og reagenser er ansat, protokollen giver vigtige tips og optimerede betingelser for vellykket overholdelse og transfektering af monocytter med Mirna efterligner og hæmmere samt med sirnas.
Introduction
Human immundefektvirus-1 (HIV-1) infektion forårsager alvorlig immun dysfunktion, hvilket kan føre til opportunistiske infektioner og erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Selv om HIV-inficerede patienter gennemgår cART er karakteriseret ved lav viral belastninger og normale CD4+ T celletal, funktion af immunsystemet kan blive kompromitteret i disse individer, fører til en dysfunktionel immunrespons, der har været forbundet med en øget risiko for at udvikle kræft1. Mekanismerne i immun dysfunktion hos HIV-patienter på vognen er stort set ukendte. Derfor er karakterisering af patient-afledte immunceller og undersøge deres biologi og funktion er en kritisk komponent i den nuværende HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er centrale lovgivere af immunrespons og spille grundlæggende roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogene og plast i naturen, kan makrofager bredt klassificeres i klassisk aktiveret (M1) eller alternativt aktiveret (m2). Denne generelle klassifikation er nødvendig ved opstilling af forsøgsbetingelser, men makro Fages polariserings status kan vendes af en række cytokiner6,7,8,9. Selv om flere undersøgelser har undersøgt virkningerne af hiv-infektion på monocytter og dendritiske celler, molekylære detaljer af monocyte-medierede svar er stort set ukendte6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blandt de faktorer, der er involveret i immuncelle regulering og funktion, microRNAs (miRNAs), korte ikke-kodning RNAs at post-transkriptivt regulere genekspression, har vist sig at spille en vigtig rolle i forbindelse med større cellulære veje (dvs. vækst, differentiering, udvikling, og apoptose)20. Disse molekyler er blevet beskrevet som vigtige regulatorer af transkriptionsfaktorer, der er afgørende for at diktere den funktionelle polarisering af makrofager21. Den potentielle rolle Mirnas i monocytter fra HIV-inficerede personer gennemgår cART er blevet undersøgt, men fremskridt på området kræver meget mere arbejde22,23,24,25,26. Dette papir diskuterer en optimeret metode til transficere Mirnas og sirnas til primære humane monocytter fra HIV-inficerede patienter og kontrol.
Denne protokol er baseret på kommercielt tilgængelige reagenser og kits, da kontinuitet i den tekniske procedure hjælper med at eliminere unødvendige eksperimentelle variabler, når der arbejdes med kliniske prøver. Ikke desto mindre, metoden giver vigtige tips (dvs. antallet af celler belagt eller kort inkubation med serum-fri medier til at fremme tilslutningen af celler til pladen). Desuden er de polariserings betingelser, der anvendes i denne protokol, afledt af offentliggjort arbejde27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt af Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutionel revisions tavle. Alt blod blev indsamlet efter at have indhentet informeret samtykke.
Bemærk: hele proceduren udføres under sterile forhold i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) anlæg, så forsigtighed anvendes til at håndtere biologiske materialer. Især udføres hvert trin ved hjælp af sterile teknikker under et biosikkerheds kabinet. Efter hvert trin, der involverer blod, blodprodukter, celler eller celle produkt pipettering, er det vigtigt at skylle alt plastmateriale (dvs. serologiske pipetter, pipettespidser og rør) med 10% blegemiddel fra en affaldsbeholder inde i emhætten inden korrekt bortskaffelse.
1. isolering af primære humane monocytter ved immunomagnetisk negativt valg
- 40 mL frisk, humant fuldblod (fra enten en HIV+ patient eller en sund kontrol) i 4 10 ml vakuumslanger af ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) (10 ml blod pr. tube). Ved hjælp af sterile teknikker under et biosikkerheds kabinet overføres alle 40 mL blod til 1 50 mL konisk propylen slange.
- Efter producentens protokol for den valgte humane monocyt isolation Kit (tabel over materialer), tilsættes 2 ml monocyt isolation cocktail, forudsat i sættet, til røret af blod. Vortex magnetiske perler, også leveres i sættet, for 30 s, og tilsæt 2 mL til røret af blod.
- Hvis der findes mindre end 40 mL blod, skalerer de tilsatte reagenser ned. For at blande opløsningen skal du pipette op og ned med en 25 mL serologisk pipette af plast og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Blod blandingen adskilles ligeligt i 4 50 mL-rør, og der tilsættes 30 mL steril phosphatbufferet saltvand (PBS) med 1 mM EDTA til hvert rør. Bland ved pipettering op og ned med en 25 mL serologisk pipette af plast.
- Placer rørene i magnet holdere i 10 minutter for at fjerne de antistof-konjugeret magnetiske perler. Brug fire magnet holdere samtidigt, én for hvert rør, for at give mulighed for konsekvent inkubation og isolations tider for hver blodprøve.
- Træk indholdet op fra midten af hvert rør ved hjælp af en pipette, mens de stadig er i magnet holderne. Vær omhyggelig med ikke at tegne røde blodlegemer (højst 10% af 10 mL startvolumen), og Placer indholdet i et af fire nye 50 mL rør.
- Tilsæt 500 μl vortexes magnetiske perler til hvert 50 ml rør. Pipetten op og ned med en 25 mL pipette og Inkuber ved RT i 5 min. Placer derefter rørene i magnet holdere i 5 minutter.
- Overfør forsigtigt indholdet fra midten af hvert rør, mens du stadig er i magnet holdere i et af fire nye 50 mL-rør. Anbring hvert nyt 50 mL-rør i magnet holderne i 5 minutter.
- Overfør forsigtigt indholdet fra midten af hvert rør til et af fire nye 50 mL rør. Spin alle nye 50 mL rør ved 300 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og resuspender alle fire celle piller i alt 10 ml sterilt PBS.
- Tæl celler ved trypan og et blå udelukkelse ved hjælp af en hemocytometer.
Bemærk: 8-20 x 106 celler er generelt fremstillet af 40 ml fuldblod.
2. dyrkning af primære humane monocytter
- Ved hjælp af et 37 °c vandbad, varm serum-fri rpmi 1640 medier suppleret med 1% penicillin-streptomycin (pen/STREP), og (samtidig med at bruge sterile teknikker under et biosikkerhed kabinet) resuspendere de isolerede monocytter i dette medie i en koncentration på 1 x 106 celler/ml.
- Der tilsættes 1 mL resuspenderede celler til hver brønd af en 6-brønd plade eller til en 35 mm skål (det endelige antal celler skal være 1 x 106 celler/plade) og placeres i en 37 °c-inkubator med 5% Co2. Vent 0,5-1,0 h for celler til at klæbe.
- Ved hjælp af et 37 °C vandbad, varm varme inaktiveret (HI) føtal kvægserum (FBS). Tilsæt 100 μL (10% endelig koncentration) af FBS til hver plade. Tilføj vækstfaktorer til cellerne for at fremme makrofag differentiering.
- Prime makrofager for en M1-lignende fænotype ved at tilføje 25 ng/mL granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til medierne. Primære makrofager til en m2-lignende fænotype ved at tilføje 50 ng/mL makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF) til Media28.
Bemærk: både GM-CSF og M-CSF gør det muligt at differentiere monocytter til en generel makrofag fænotype (m0), mens de priming celler for M1 eller m2, henholdsvis7,28,30.
- Prime makrofager for en M1-lignende fænotype ved at tilføje 25 ng/mL granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til medierne. Primære makrofager til en m2-lignende fænotype ved at tilføje 50 ng/mL makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF) til Media28.
3. transfficerende primære menneskelige monocytter i kulturen
- Transfect monocytter med Mirna efterligner eller hæmmere eller siRNA ved hjælp af et kit, der indeholder et polymer-baseret transfektering reagens (tabel over materialer).
- Efter fabrikantens protokol for transfektering Kit (og fortsat anvendelse af sterile teknikker under et biosikkerhedskabinet), fortyndes først den valgte Mirna efterligner/hæmmere eller sirnas i bufferen til en endelig koncentration på 1,83 μM. klargør 10 μl fortyndet Mimic/inhibitor pr. transfektering på 1 x 106 celler.
- Transfektering Reagenset fremstilles ved tilsætning af 1 μl af den medfølgende polymer til et nyt 1,5 ml mikrocentrifuge glas, umiddelbart efterfulgt af tilsætning af 90 μl af den medfølgende buffer (for i alt 91 μl reagens pr. transfektering). Vortex til 3-5 s.
- Der afpipetteres 90 μl transfektering opløsning i røret, som indeholder 10 μl fortyndet Mirna Mimic/hæmmer eller siRNA. Bland med blid pipettering og Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Tilsæt 100 μl transfektering kompleks til en brønd (eller skål) på 1 x 106 belagte monocytter. Inkubér cellerne i 4 timer ved 37 °C, og Udskift derefter mediet med 3 mL komplette medier (RPMI 1640 suppleret med 1% penicillin-streptomycin og 10% varme inaktiverede FB'ER), der indeholder enten GM-CSF eller M-CSF.
4. differentiering og aktivering af M1/M2
- Monocytter begynder straks at differentiere til brede M0 makrofager ved plating i kulturen. På den tredje dag efter plating, Fortsæt med at bruge sterile teknikker under et biosikkerheds kabinet og Udskift medier med 3 mL friske RMPI 1640-medier (suppleret med 1% penicillin-streptomycin, 10% varme inaktiverede FB'ER og enten 25 ng/mL GM-CSF for at fremme M1-lignende polarisering eller 50 ng/mL M-CSF for at fremme m2-lignende polarisering). Dyrkning cellerne i disse tilstande i alt 6 dage fra første plating i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
- For at fremme polariseringen af primede celler til M1-makrofag fænotype, aktiver celler på dag 6 i inkubation ved at udskifte celle medier med nye medier, der indeholder 5% varme inaktiverede FB'ER, 1% pen/STREP, 100 ng/mL E. coli-afledt lipopolysaccharid (LPS) og 20 ng/ml interferon gamma (IFN-γ).
- At fremme polarisering af primede celler til m2-makrofag fænotype, aktivere celler på dag 6 af inkubation ved at erstatte celle medier med nye medier, der indeholder 5% varme inaktiverede FBS, 1% pen/STREP, 10 ng/mL M-CSF, og 20 ng/mL interleukin 4 (IL-4).
- Efter 24 h, høst cellerne for RNA, protein, eller flow cytometri analyser.
- Når cellerne er klar til opsamling, vaskes cellerne i skålen 2x med PBS (ved RT til RNA-ekstraktion eller kølet på is til proteinekstraktion). Fordi de differentierede makrofager nu er solidt fastgjort til pladerne, lysere cellerne i plader direkte for at opnå materiale til RNA-og proteinanalyser.
- Til opsamling af materiale til strømnings cytometri tilsættes PBS indeholdende 2 mM EDTA til skålen, Inkuber cellerne i 10 min ved 37 °C, skraber forsigtigt cellerne fra skålen og samler indholdet i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, før der fortsættes med standardprotokoller.
5. strømnings cytometri
- Skyl cellerne i PBS for at fjerne dyrkningsmediet. Spin ned 100.000 celler (pr. hver strømnings cytometri-tilstand) og resuspension af pellet i 100 μL PBS, der indeholder 2 μL HuFcR-bindings hæmmer. Inkuber ved RT i 15 min.
- Der tilsættes 50 μL farvnings buffer og de ønskede antistoffer (her, CD80, CD83, CD163 og CD209) i de anbefalede mængder.
- Bland forsigtigt og Inkuber ved 4 °C i mørke i 30 minutter.
- Der vaskes 2x med PBS, og de farvede celler opslæmmes i 150 μL PBS, før prøven køres på et cytofluorimeter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde blev primære humane monocytter fra HIV-inficerede individer og raske donorer isoleret. Alle data, der præsenteres her, er indhentet fra HIV+- patienter, som gennemgår en kurv med lav (< 20 kopier/ml) eller ikke-detekterbare virale belastninger og normale CD4+ T- celletal. Umiddelbart efter isolation, celler blev farvet, og flow flowcytometri blev udført for at bekræfte renheden af cellepopulationer. Resultaterne viste, at > 97% af cellerne farves positive for CD14 (data ikke vist). Til polarisering af makrofager blev der anvendt en offentliggjort protokol28. Primære humane monocytter blev dyrket i nærværelse af GM-CSF eller M-CSF i 6 dage. På den sjette dag blev cellerne aktiveret mod enten M1 eller m2 makrofager. Fireogtyve timer efter aktivering, celler blev høstet og plettet til flow flowcytometri analyse af makrofag celle markører.
Figur 1 viser repræsentative histogrammer af M1-aktiveret kontrol-(figur 1A) og patient-afledte (figur 1B) celler med FORHØJEDE niveauer af CD80 og CD83 og nedsat niveau af CD163 sammenlignet med ikke-aktiverede t0 celler, samt m2-aktiverede celler med forhøjede niveauer af CD163 og CD209. Panel C i viser udtryk for CD80, CD83, CD163, og CD209 i M1 og m2 polariserede celler. Grafen repræsenterer de gennemsnitlige data opnået fra tre kontrol-og tre HIV-afledte sæt af celler. Som forventet steg ekspressions niveauerne for CD80 og CD83 i M1 sammenlignet med m2 polariserede celler, mens CD209 og CD163 var mere højt udtrykt i m2 sammenlignet med M1-polariserede celler. Interessant, CD80 og CD83 syntes at være mere højt udtrykt i kontrol-afledte celler i forhold til HIV-afledte celler. Men, potentielle forskelle i evnen til at polarisere og/eller ekspression niveauer af polariserings markører i HIV-afledte celler i forhold til kontrol kræver yderligere undersøgelse. Selvom GM-CSF, M-CSF, LPS og IFN-γ blev valgt som behandlinger, kan der anvendes andre kombinationer af vækstfaktorer, cytokiner eller Stimulatorer sammen med denne protokol28.
Efter indledende eksperimenter viste, at isolations proceduren var vellykket, blev nyindsamlede monocytter belagt i 6 brønd plader og transficeret med en forvrænget, nær-infrarød-mærket Mirna til at bestemme transfektering effektivitet. Celler blev afbildet 24 h post-transfection af fluorescerende Konfokal mikroskopi. Med denne metode blev der opnået > 90% effektivitet af transfektering, som bestemmes af flowcytometri (figur 2A) og konfokal mikroskopi (figur 2B).
Derefter blev cellernes levedygtighed efter transfektering fastlagt. Figur 3 viser cellernes levedygtighed, fastlagt ved hjælp af en kolorimetrisk analyse som et gennemsnit af celler afledt af to patienter (figur 3a) og to kontroller (figur 3b), der er transficeret på dag 1 (figur 3a) eller dag 4 (figur 3b) og høstet på dag 7. Til dette eksperiment blev 50.000 celler belagt på en 96 multi-brønd plade og transficeret efter protokollen. Generelt reducerer transfektering ikke cellernes levedygtighed væsentligt, uanset cellernes modning og transftionsforholdene (f. eks. mock, røræg siRNA/Mirna eller siRNA/Mirna). Det skal bemærkes, at figur 3 repræsenterer data indhentet fra patient afledte celler (panel A) og kontrol-afledte celler (panel B). Dette var nødvendigt, da ikke nok celler til at udføre det fulde eksperiment (både levedygtighed og Western blot for dag 1 og dag 4 transfections, i seks forskellige betingelser pr transfection) med en enkelt prøve var i stand til at blive opnået. Ikke desto mindre, figuren giver repræsentative resultater opnåelige med enten kontrol-eller patient-afledte celler.
Derefter blev virkningen af siRNA transfektering på Target mRNA vurderet ved at evaluere protein ekspression. Resultater i figur 4 viser effektiv nedregulering af EIF4EBP1, en translationel regulator meget rigelige i disse celler, ved transfektering med en specifik siRNA på både dag 1 (figur 4a) og dag 4 (figur 4C). Samme regulator opretholdt også udtryk under de forskellige kontrolbetingelser (dvs. utransfected, mock, røræg siRNA og EIF4EBP1 siRNA uden transfektering reagens: Sir *). Kvantificering af de vestlige blot eksperimenter for dag 1 og dag 4 transfektering er vist i henholdsvis figur 4B og figur 4D. Desuden blev der fastsat ekspressionsniveauer for miR-146a-5p efter transfektering på dag 1 eller dag 4 ved rt-qPCR af hiv-afledte celler (figur 4E). Celler transficeret med Mirna efterligne viste en 48-til 72-fold stigning i Mirna udtryk over utransfected celler, mens alle transfektering kontrol viser ingen mærkbare ændringer.
Figur 1: de monocytter-afledte makrofager er med succes polariseret og aktiveret mod M1 eller m2 makrofag fænotyper. Flow cytometri analyseresultater af celler afledt af en sund kontrol (A) og en hiv-afledt celleprøve (B) viser niveauer af CD80, CD83, CD163 og CD209. Forsøget blev gentaget med to yderligere kontroller og to yderligere HIV-positive prøver med lignende resultater. Cellepopulation af interesse blev gated på grundlag af fremad og side scatter parametre, efterfulgt af Doublet diskrimination. C) søjlediagram, der viser CD80, CD83, CD163 og CD209 i de polariserede celler i M1 og m2. Grafen repræsenterer den gennemsnitlige data og standardafvigelser opnået fra tre Control-(CTRL) og tre HIV-afledte (PTS) sæt af celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: primære humane CD14+ celler transficeret effektivt med Mirnas. A) flowcytometri-analyse af primære monocytter afledt af sunde Kontroller, 24 timer efter transftion, der viser > 90% transfektering effektivitet. B) repræsentativt Konfokal billede taget 24 h post-transfection viser, at alle celler i marken udtrykker Mirna konjugeret med et nær-infrarødt farvestof (i hvidt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: levedygtigheden af transficeret celler. Graf søjler repræsenterer den gennemsnitlige cellelevedygtighed for to hiv+- patienter (A) og to raske Kontroller (B) bestemmes ved hjælp af en kolorimetrisk analyse, efter transfektering med miR-146a-5p eller siRNA til EIF4EBP1 (siRNA) og passende kontrol på dag 1 (A) eller dag 4 (b), alle testet på dag 7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: effektiv downregulation af protein niveauer ved siRNA/Mirna transfektering efter isolering af CD14+ monocytter. Kontrol og hiv-afledte monocytter (1 x 106 celler) blev transficeret på dag 1 (A) eller dag 4 (C) efter isolation ved hjælp af siRNA mod EIF4EBP1 mRNA. Paneler (B) og (D) repræsenterer kvantificering af EIF4EBP1 udtryk sammenlignet med gapdh og udtrykkes som procentdelen over mock for patient (PT) eller Control (CTRL) (A) eller utransficeret til patient eller kontrol (B). E) repræsentativ bjælke graf over to eksperimenter, der viser miR-146a-5p-ekspression i hiv-afledte celler, der transfteres på dag 4 (bars 1-4) eller dag 1 (højre bjælke) og høstes på dag 7. Fold ændringen beregnes over den utransfected prøve (siR = siRNA). Sir * eller Mir-145A-5p * indikerer inkubation af cellerne med siRNA eller Mir-146a-5p uden transfektering reagens. Eksperimentet blev gentaget 2x med kontrol-afledte celler og producerede stort set de samme resultater (data ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol viser brugen af primære celler fra HIV-inficerede forsøgspersoner som en model til at studere monocytter og makrofager. HIV+ patienter gennemgår cART lever med infektion i flere år og kan også have andre co-infektioner relateret et kompromitteret immunsystem. For at studere immunmodulerende i nærværelse af HIV kronisk infektion, celler blev høstet fra patienter direkte. Da miRNAs har vist sig at spille en større rolle i celle udvikling og differentiering, fokuserer protokollen på evnen til at manipulere miRNA-ekspression i disse primære celler (figur 2, figur 3, figur 4). Ved hjælp af samme procedure, denne protokol fungerer også meget godt for siRNAs (figur 3, figur 4). På grund af den potentielle fagocytiske aktivitet af modne makrofager, ud over mock og scramble siRNA kontrol, en kontrol anvendes (angivet som Sir * eller miR * i figur 3 og figur 4), hvor transfektering reagens er udeladt. Data bekræfter, at transfektering reagens er nødvendig for korrekt siRNA/Mirna levering i cellerne, som uden reagens, celler ikke spontant optagelse af Mirna eller siRNA, selv når de allerede er differentieret i makrofager (dag 4 efter plating og polarisering, figur 3 og figur 4).
Mens du bruger kommercielt tilgængelige kits til isolation og transfektering af human Primary CD14+ monocytter, der er vigtige trin optimeret til at gøre proceduren reproducerbare og vellykket. Specifikt, 1) antallet af celler belagt er afgørende for deres overlevelse og differentiering, og 1 x 106 celler/35 mm parabol blev fundet for at fungere bedst. 2) frisk isolerede CD14+ celler ikke ensartet vedhæfte til kulturen skålen, hvis seedet i nærværelse af FBS. Som en konsekvens, når udskiftning af medium 4 h efter transfection, alle løsgængere celler vil blive fjernet, gør plade-til-plade betingelser meget variabel. 3) det blev konstateret, at udskiftning af medium 4 h efter transfection, reducerer toksicitet på grund af transfficerende reagenser, mens der ikke påvirker effektiviteten af transfection. 4) transfection betingelser blev optimeret til at kræve mindre siRNA eller miRNA (15 nM) end koncentrationer anbefalet af fabrikanten (25 nM). 5) på grund af den meget klædige natur af cellerne, tilføjer lysis buffer direkte til pladen forbedrer koncentrationen af proteiner eller RNA høstet. Men hvis det er nødvendigt at fjerne celler fra pladen (dvs. til flow cytometri analyse), er det bedst at bruge PBS med EDTA og forsigtigt skrabe cellerne. Denne metode reducerer antallet af indsamlede celler med ca. 20%-30%, så det er vigtigt at planlægge eksperimenter i overensstemmelse hermed for at opnå tilstrækkelige cellenumre til yderligere analyse.
Når det følges korrekt, viser denne procedure opnåelse af meget ren CD14+ population af monocytter, transfektering af sirnas og små RNAs såsom Mirnas, dyrkningsbetingelser og differentiering i M1 eller m2 makrofager. Denne metode kan anvendes til at studere komplekse sygdomme eller infektioner bortset fra HIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke hiv-kliniske/tumor biorepositive kerne for at give patientprøver og cellulær immunologi metabolisme kerne for at give flow flowcytometri analyse. Dette projekt blev finansieret af NIH P20GM121288 og P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
