Summary
Presenteras här är ett optimerat protokoll för att isolera, odling, transfecting, och differentiera mänskliga primära monocyter från HIV-infekterade individer och friska kontroller.
Abstract
Humant immunbristvirus (HIV) är fortfarande ett stort hälsoproblem trots införandet av kombinerad antiretroviral behandling (cART) i mitten av 1990-talet. Medan antiretroviral behandling effektivt sänker systemisk virusbelastning och återställer normala CD4+ T-celler räknas, det inte rekonstituerar ett helt funktionellt immunförsvar. Ett dysfunktionellt immunsystem i HIV-infekterade individer som genomgår cART kan kännetecknas av immunförsvaret aktivering, tidigt åldrande av immunceller, eller ihållande inflammation. Dessa villkor, tillsammans med comorbida faktorer förknippade med HIV-infektion, lägga komplexitet till sjukdomen, som inte lätt kan återges i cellulära och djurmodeller. För att undersöka molekylära händelser underliggande immun dysfunktion hos dessa patienter, ett system för att kultur och manipulera mänskliga primära monocyter in vitro presenteras här. Specifikt tillåter protokollet för kulturen och transfektion av primära CD14+ monocyter som erhållits från hiv-infekterade personer som genomgår cART samt från hiv-negativa kontroller. Metoden innebär isolering, kultur, och transfektion av monocyter och monocyte-härledda makrofager. Medan kommersiellt tillgängliga kit och reagens används, ger protokollet viktiga tips och optimerade förutsättningar för framgångsrik följsamhet och transfektion av monocyter med Mirna härmar och hämmare samt med sirnas.
Introduction
Humant immunbristvirus-1 (HIV-1) infektion orsakar svår immun dysfunktion, vilket kan leda till opportunistiska infektioner och förvärvade immunbristsyndrom (AIDS). Även om HIV-infekterade patienter som genomgår cART kännetecknas av låg virusbelastning och normala CD4+ T-celler räknas, kan funktionen hos immunförsvaret äventyras hos dessa individer, vilket leder till en dysfunktionell immunsvar som har kopplats till en ökad risk att utveckla cancer1. Mekanismerna för immun dysfunktion hos HIV-patienter i cART är fortfarande i stort sett okända. Därför är att karakterisera patient-derived immunceller och undersöka deras biologi och funktion är en kritisk komponent i nuvarande HIV-forskning.
Monocyter och makrofager är viktiga regulatorer av immunsvar och spela grundläggande roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogena och plast i naturen, makrofager kan grovt klassificeras i klassiskt aktiverad (M1) eller alternativt aktiverad (m2). Även om denna allmänna klassificering är nödvändig när man ställer upp experimentella tillstånd, kan polarisation status av makrofager vändas genom en mängd olika cytokiner6,7,8,9. Även om flera studier har undersökt effekterna av hiv-infektion på monocyter och dendritiska celler, molekylära detaljer i monocyte-medierade svar är i stort sett okända6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Bland de faktorer som är involverade i immun cells reglering och funktion, microRNAs (miRNAs), korta icke-kodning RNAs att post-transkriptionellt reglera genuttryck, har visat sig spela en viktig roll i samband med stora cellulära vägar (dvs. tillväxt, differentiering, utveckling, och apoptos)20. Dessa molekyler har beskrivits som viktiga regulatorer av transkriptionsfaktorer avgörande för diktera funktionell polarisering av makrofager21. Den potentiella roll mirnas i monocyter från hiv-infekterade personer som genomgår cART har undersökts, men framsteg inom området kräver mycket mer arbete22,23,24,25,26. Denna uppsats diskuterar en optimerad metod för att transfect miRNAs och siRNAs i primära humana monocyter från HIV-infekterade patienter och kontroller.
Detta protokoll bygger på kommersiellt tillgängliga reagenser och byggsatser, eftersom kontinuiteten i det tekniska förfarandet hjälper till att eliminera onödiga experimentella variabler vid arbete med kliniska prover. Icke desto mindre, metoden ger viktiga tips (dvs, antalet celler pläterad eller kort inkubation med serum-fria medier för att främja efterlevnaden av celler till plattan). Dessutom kommer de polariserings förhållanden som används i detta protokoll att härledas från publicerat arbete27,28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs nedan har godkänts av Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutionella Review Board. Allt blod samlades in efter att ha erhållit informerat samtycke.
Anmärkning: hela proceduren utförs under sterila förhållanden i en biosäkerhet Level 2 (BSL2) anläggning så att försiktighet används för att hantera biologiska material. I synnerhet utförs varje steg med steril teknik under ett biosäkerhetsskåp. Efter varje steg som involverar blod, blodprodukter, celler eller pipettering av cellprodukter är det viktigt att skölja allt plastmaterial (dvs. serologiska pipetter, pipettspetsar och rör) med 10% blekmedel från en avfallsbehållare inuti huven före korrekt kassering.
1. isolering av primära humana monocyter genom immunomagnetiska negativa val
- Samla 40 mL färskt, humant helblod (från antingen en HIV+ patient eller frisk kontroll) i 4 10 ml etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vakuumrör (10 ml blod per rör). Med hjälp av sterila tekniker under ett biosäkerhetsskåp, överför alla 40 mL blod till 1 50 mL koniskt propylenrör.
- Efter tillverkarens protokoll för den valda Human monocyt isolering Kit (tabell över material), tillsätt 2 ml monocyt isolering cocktail, som finns i satsen, till röret av blod. Vortex magnetiska pärlor, som också finns i satsen, för 30 s, och tillsätt 2 mL till röret av blod.
- Om mindre än 40 mL blod är tillgängligt, skala ner reagenser till. För att blanda lösningen, Pipettera upp och ned med en 25 mL serologisk pipett i plast och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Separera blod blandningen lika i 4 50 mL-rör och tillsätt 30 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 1 mM EDTA till varje tub. Blanda genom att Pipettera upp och ner med en 25 mL serologisk pipett i plast.
- Placera rören i Magnethållare i 10 min för att ta bort de antikroppskonjugerade magnetiska pärlorna. Använd fyra Magnethållare samtidigt, en för varje tub, för att möjliggöra konsekventa inkubations-och isolerings tider för varje blodprov.
- Dra upp innehållet från mitten av varje tub, med hjälp av en pipett, medan de fortfarande är i magnet hållarna. Var noga med att inte dra upp röda blodkroppar (inte mer än 10% av 10 mL startvolym), och placera innehållet i en av fyra nya 50 mL rör.
- Tillsätt 500 μL vortexed magnetiska pärlor till varje 50 mL tub. Pipettera upp och ned med en 25 mL pipett och inkubera vid RT i 5 min. Placera sedan rören i Magnethållare i 5 minuter.
- Överför försiktigt innehållet från mitten av varje tub medan den fortfarande är i Magnethållare till en av fyra nya 50 mL-rör. Placera varje ny 50 mL-tub direkt i magnet hållarna i 5 minuter.
- Överför försiktigt innehållet från mitten av varje tub till en av fyra nya 50 mL-rör. Snurra alla nya 50 mL rör på 300 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera alla fyra cell pellets i totalt 10 ml steril PBS.
- Räkna celler med trypan blå uteslutning med hjälp av en hemocytometer.
Anmärkning: 8-20 x 106 celler erhålls i allmänhet från 40 ml helblod.
2. odling av primära humana monocyter
- Med hjälp av en 37 ° c vattenbad, varm serum fria RPMI 1640 Media kompletteras med 1% penicillin-streptomycin (penna/STREP), och (samtidigt fortsätta att använda sterila tekniker under ett biosäkerhetsskåp) Omsuspendera cellerna under isolerade monocyter i detta media vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 1 mL återsuspenderade celler till varje brunn på en 6-vältplatta eller till en 35 mm maträtt (det slutliga antalet celler ska vara 1 x 106 celler/platta) och placera i en inkubator på 37 ° c med 5% Co2. Vänta 0.5-1.0 h för celler att fästa.
- Med hjälp av en 37 ° c vattenbad, varm Värmeinaktiverade (HI) foster bovint serum (FBS). Tillsätt 100 μL (10% slutkoncentration) av FBS till varje platta. Lägg tillväxtfaktorer till cellerna för att främja makrofagdifferentiering.
- Primära makrofager för en M1-liknande fenotyp genom att tillsätta 25 ng/mL av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) till media. Prime makrofager för en m2-liknande fenotyp genom att tillsätta 50 ng/mL av makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) till media28.
Anmärkning: både GM-CSF och M-CSF tillåter monocyt differentiering till en allmän makrofagfenotyp (M0) medan grundning celler för M1 eller m2, respektive7,28,30.
- Primära makrofager för en M1-liknande fenotyp genom att tillsätta 25 ng/mL av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) till media. Prime makrofager för en m2-liknande fenotyp genom att tillsätta 50 ng/mL av makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) till media28.
3. transfecting primära mänskliga monocyter i kulturen
- Transfect monocyter med Mirna härmar eller hämmare eller siRNA med hjälp av ett kit som innehåller en polymer-baserade transfektion reagens (tabell över material).
- Efter tillverkarens protokoll för transfection Kit (och fortsatt användning av sterila tekniker under ett biosäkerhetsskåp), först späda ut de valda miRNA Mimics/hämmare eller siRNAs i bufferten till en slutlig koncentration av 1,83 μM. Förbered 10 μL utspädd härma/hämmare per överföring av 1 x 106 celler.
- Bered transfektionsreagenset genom att tillsätta 1 μL av den medföljande polymeren i ett färskt 1,5 mL microcentrifugerör, följt omedelbart genom att tillsätta 90 μL av den tillhandahållna bufferten (för sammanlagt 91 μL reagens per transfektion). Vortex för 3-5 s.
- Pipettera över 90 μL transfektionslösning i röret innehållande 10 μL utspädd miRNA-/hämmare eller siRNA. Blanda med skonsam pipettering och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Tillsätt 100 μL av transfektionskomplex till en brunn (eller maträtt) av 1 x 106 pläterade monocyter. Inkubera cellerna i 4 h vid 37 ° c och ersätt sedan mediet med 3 mL komplett media (RPMI 1640 kompletterat med 1% penicillin-streptomycin och 10% Värmeinaktiverade FBS) som innehåller antingen GM-CSF eller M-CSF.
4. differentiering och aktivering av M1/M2
- Monocyter börjar omedelbart differentiera till breda M0 makrofager vid plätering i kulturen. På tredje dagen efter plätering, fortsätt använda sterila tekniker under ett biosäkerhetsskåp och ersätta media med 3 mL färskt RMPI 1640 media (kompletteras med 1% penicillin-streptomycin, 10% Värmeinaktiverade FBS, och antingen 25 ng/mL GM-CSF för att främja M1-liknande polarisering eller 50 ng/mL M-CSF för att främja m2-liknande polarisering). Odla cellerna i dessa förhållanden under sammanlagt 6 dagar från första pläteringen i en inkubator vid 37 ° c, 5% CO2.
- För att främja polarisering av primade celler till M1-makrofage-fenotypen, aktivera celler på dag 6 av inkubering genom att ersätta cellmedia med nya medier som innehåller 5% Värmeinaktiverade FBS, 1% penna/STREP, 100 ng/ml E. coli-derived lipopolysackarid (LPS) och 20 ng/ml interferon gamma (IFN-γ).
- För att främja polarisering av primade celler till m2-makrofag fenotyp, aktivera celler på dag 6 av inkubering genom att ersätta cellmedia med nya medier som innehåller 5% Värmeinaktiverade FBS, 1% penna/STREP, 10 ng/mL M-CSF, och 20 ng/mL interleukin 4 (IL-4).
- Efter 24 h, skörda cellerna för RNA, protein, eller flödescytometri analyser.
- När cellerna är klara för uppsamling, tvätta celler i skålen 2x med PBS (vid RT för RNA-extraktion eller kyld på is för protein utvinning). Eftersom de differentierade makrofager är nu fast knutna till plattorna, lyse cellerna i plattorna direkt för att få material för RNA och protein analyser.
- För insamling av material för flödescytometri, tillsätt PBS innehållande 2 mM EDTA till skålen, inkubera cellerna i 10 min vid 37 ° c, försiktigt skrapa cellerna från skålen, och samla in innehållet i en 1,5 mL microcentrifug röret innan du fortsätter med standardprotokoll.
5. flödescytometri
- Skölj cellerna i PBS för att ta bort odlingsmediet. Snurra 100 000 celler (per flödescytometri) och Omsuspendera pelleten i 100 μL PBS innehållande 2 μL av HuFcR-bindningshämmare. Inkubera vid RT i 15 min.
- Tillsätt 50 μL färgbuffert och önskade antikroppar (här, CD80, CD83, CD163 och CD209 användes) i de rekommenderade mängderna.
- Blanda varsamt och inkubera vid 4 ° c i mörker i 30 min.
- Tvätta 2x med PBS och Omsuspendera de färgade cellerna i 150 μL av PBS innan du körprovet på en cytofluorimeter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det beskrivna förfarandet isolerades primära humana monocyter från HIV-infekterade individer och friska donatorer. Alla data som presenteras här erhölls från HIV+ ämnen som genomgår cART med låg (< 20 kopior/ml) eller omätbara virus laster och normala CD4+ T-celler räknas. Omedelbart efter isolering, celler färgas, och flödescytometri utfördes för att bekräfta renheten hos cellpopulationer. Resultaten visade att > 97% av cellerna färgade positiva för CD14 (data visas inte). För polarisering av macrophages, användes ett publicerat protokoll28. Primära mänskliga monocyter var odlade i närvaro av GM-CSF eller M-CSF för 6 dagar. På den sjätte dagen, celler aktiverades mot antingen M1 eller m2 makrofager. Tjugofyra timmar efter aktiveringen, celler skördades och färgas för flödescytometri analys av makrofager cell markörer.
Figur 1 visar representativa histogram av M1-aktiverad kontroll-(figur 1A) och patient-härledda (figur 1B) celler med ökade nivåer av CD80 och CD83 och minskade nivåer av CD163 jämfört med icke-aktiverade t0-celler, samt m2-aktiverade celler med ökade nivåer av CD163 och CD209. Panel C i visar uttryck för CD80, CD83, CD163 och CD209 i M1 och m2 polariserade celler. Grafen representerar den genomsnittliga data som erhålls från tre kontroll-och tre HIV-derived uppsättningar av celler. Som förväntat ökade uttrycksnivåerna CD80 och CD83 i M1 jämfört med m2-polariserade celler, medan CD209 och CD163 var högre uttryckta i m2 jämfört med M1-polariserade celler. Intressant, CD80 och CD83 verkade vara mer högt uttryckt i kontroll-härledda celler jämfört med HIV-härledda celler. Men potentiella skillnader i förmågan att polarisera och/eller uttrycks nivåer av polariserings markörer i HIV-härledda celler jämfört med kontroller kräver ytterligare utredning. Även om GM-CSF, M-CSF, LPS och IFN-γ valdes som behandlingar, kan andra kombinationer av tillväxtfaktorer, cytokiner eller stimulatorer användas med detta protokoll28.
Efter preliminära experiment visade att isolerings förfarandet var framgångsrik, nyligen insamlade monocyter var klädd i 6 bra tallrikar och transfekterade med en kodad, nära-infraröd-märkt Mirna att bestämma transfektion effektivitet. Celler var avbildade 24 h post-transfektion av fluorescerande konfokalmikroskopi. Med denna metod uppnåddes > 90% verkningsgrad för transfektion, vilket bestäms av flödescytometri (figur 2A) och konfokalmikroskopi (figur 2B).
Därefter bestämdes genomförbarheten av cellerna efter transfektion. Figur 3 visar cellernas livskraft, fastställd med hjälp av en kolorimetrisk analys som ett medelvärde av celler härledda från två patienter(figur 3a) och två kontroller (figur 3B) som transfekterade dag 1 (figur 3a) eller dag 4 (figur 3b) och skördats dag 7. För detta experiment var 50 000 celler pläterade på en 96 multi-well tallrik och transfekterade efter protokollet. I allmänhet, transfektion inte signifikant minska livskraften hos celler, oavsett stadiet av mognad av cellerna och transfektion villkor (dvs, Mock, kodade siRNA/miRNA, eller siRNA/miRNA). Det bör noteras att figur 3 representerar data som erhållits från patient-härledda celler (panel A) och kontrollhärledda celler (panel B). Detta var nödvändigt, eftersom inte tillräckligt med celler för att utföra hela experimentet (både lönsamhet och Western blot för dag 1 och dag 4 transfektioner, i sex olika förhållanden per transfektion) med ett enda prov kunde erhållas. Siffran ger dock representativa resultat som får erhållas med antingen kontroll-eller patient-härledda celler.
Sedan utvärderades effekten av siRNA transfektion på Target mRNA genom att utvärdera proteinuttryck. Resultat i figur 4 Visa effektiv nedreglering av EIF4EBP1, en translationell regulator mycket riklig i dessa celler, vid transfektion med en specifik siRNA på både dag 1 (figur 4a) och dag 4 (figur 4C). Samma regulator behöll också uttryck under de olika kontrollförhållanden (dvs., otransfected, Mock, kodade siRNA, och EIF4EBP1 siRNA utan transfection reagens: siR *). Kvantifiering av experiment med Western blot för dag 1-och dag 4-transfektion visas i figur 4B respektive figur 4D. Dessutom fastställdes uttrycks nivåer av miR-146a-5P efter transfektion vid dag 1 eller dag 4 av RT-qPCR för HIV-härledda celler (figur 4E). Celler som transfekterade med Mirna Mimic visade en 48-till 72-faldig ökning av Mirna uttryck över untransfected celler, medan alla transfektion kontroller visar inga märkbara förändringar.
Figur 1: makrofager som härrör från Monocyte är framgångsrikt polariserade och aktiverade mot fenotyperna M1 eller m2. Flödescytometri analysresultat av celler som härrör från en sund kontroll (a) och ett hiv-derived cellprov (B) visar nivåer av CD80, CD83, CD163, och CD209. Experimentet upprepades med två ytterligare kontroller och två ytterligare HIV-positiva prover med liknande resultat. Cell population av intresse var gated på grundval av framåt och sida scatter-parametrar, följt av Doublet diskriminering. (C) stapeldiagram som visar CD80, CD83, CD163 och CD209 i M1-och m2-polariserade celler. Grafen representerar den genomsnittliga data och standardavvikelser som erhålls från tre kontroll-(Ctrl) och tre HIV-härledda (PTS) uppsättningar av celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: primära humana CD14+ celler är effektivt transfekterade med mirnas. (A) flödescytometri analys av primära monocyter som härrör från friska kontroller, 24 h post-transfektion, visar > 90% transfektion effektivitet. (B) representativ konfokal bild tagen 24 h post-transfektion visar att alla celler i fältet uttrycker Mirna konjugerat med ett nästan infrarött färgämne (i vitt). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: genomförbarhet av transfekterade celler. Grafstaplar representerar genomsnittlig cellöverlevnad för två HIV+ patienter (a) och två friska kontroller (b) bestäms med hjälp av en kolorimetrisk analys, efter transfektion med Mir-146A-5P eller siRNA till EIF4EBP1 (siRNA) och lämpliga kontroller vid dag 1 (a) eller dag 4 (b), alla testade på dag 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: effektiv nedreglering av proteinnivåer vid siRNA/miRNA-transfektion efter isolering av CD14+ monocyter. Kontroll och hiv-derived monocyter (1 x 106 celler) var transfekterade vid dag 1 (a) eller dag 4 (C) efter isolering med siRNA mot EIF4EBP1 mRNA. Panelerna (B) och (D) representerar kvantifiering av EIF4EBP1 uttryck jämfört med GAPDH och uttrycks som procentandel över håna för patient (PT) eller kontroll (Ctrl) (a) eller otransfected för patient eller kontroll (B). (E) representativa stapeldiagram av två experiment som visar Mir-146a-5P uttryck i hiv-härledda celler transfekterade på dag 4 (bars 1-4) eller dag 1 (höger bar) och skördas på dag 7. Vik förändringen beräknas över det otransfesterade provet (siR = siRNA). siR * eller miR-145a-5P * indikerar inkubation av cellerna med siRNA eller miR-146a-5P utan transfektionsreagens. Experimentet upprepades 2x med kontrollhärledda celler och producerade i stort sett samma resultat (data visas inte). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet visar användningen av primära celler från HIV-infekterade försökspersoner som en modell för att studera monocyter och makrofager. HIV+ patienter som genomgår cART lever med infektion i flera år och kan också ha andra co-infektioner relaterade ett nedsatt immunförsvar. För att studera Immunomodulering i närvaro av HIV-kronisk infektion, celler skördats från patienter direkt. Som miRNAs har visat sig spela stora roller i cell utveckling och differentiering, fokuserar protokollet på förmågan att manipulera miRNA uttryck i dessa primära celler (figur 2, figur 3, figur 4). Med samma förfarande fungerar detta protokoll också mycket bra för siRNAs (figur 3, figur 4). På grund av den potentiella fagocytiska aktiviteten hos mogna makrofager, förutom mock och rusning siRNA kontroller, används en kontroll (anges som Sir * eller Mir * i figur 3 och figur 4), där transfektionsreagens utelämnas. Data bekräftar att transfektion reagens krävs för korrekt siRNA/miRNA leverans till cellerna, som utan reagenset, celler inte spontant upptag av miRNA eller siRNA, även när de redan är differentierade till makrofager (dag 4 efter plätering och polarisering, figur 3 och figur 4).
När du använder kommersiellt tillgängliga kit för isolering och transfektion av mänskliga primära CD14+ monocyter, det finns viktiga steg optimeras för att göra förfarandet reproducerbara och framgångsrika. Specifikt, 1) antalet celler pläterade är avgörande för deras överlevnad och differentiering, och 1 x 106 celler/35 mm skålen befanns fungera bäst. 2) nyligen isolerade CD14+ celler inte enhetligt fäster på kultur skålen om seedade i närvaro av FBS. Som en följd, vid byte av mediet 4 h efter transfektion, alla okopplade celler kommer att tas bort, vilket gör plattan till plattan förhållanden mycket varierande. 3) Det konstaterades att ersätta mediet 4 h efter transfektion, minskar toxicitet på grund av transfecting reagenser samtidigt inte påverka effektiviteten av transfektion. 4) transfektion villkor optimerades för att kräva mindre siRNA eller miRNA (15 nM) än koncentrationer som rekommenderas av tillverkaren (25 nM). 5) på grund av den mycket anhängare av cellerna, lägga lysis buffert direkt till plattan avsevärt förbättrar koncentrationen av proteiner eller RNA skördas. Men om det är nödvändigt att ta bort celler från plattan (dvs. för flödescytometri analys), är det bäst att använda PBS med EDTA och försiktigt skrapa cellerna. Denna metod minskar antalet insamlade celler med cirka 20%-30%, så det är viktigt att planera experiment för att få tillräckligt med cell nummer för vidare analys.
När den följs korrekt, detta förfarande visar att få av mycket ren CD14+ population av monocyter, transfektion av sirnas och små rnas såsom mirnas, odlingsförhållanden, och differentiering i M1 eller m2 makrofager. Denna metod kan tillämpas för att studera komplexa sjukdomar eller andra infektioner än HIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka HIV Clinical/tumör Biorepository kärna för att tillhandahålla patientprover och cellulära immunologi metabolism kärna för att tillhandahålla flödescytometri analys. Projektet finansierades av NIH P20GM121288 och P30GM114732.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
References
- Slim, J., Saling, C. F. A Review of Management of Inflammation in the HIV Population. Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).
- Herskovitz, J., Gendelman, H. E. HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).
- Machado Andrade, V., Stevenson, M. Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).
- Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome. Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).
- Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis. Viruses. 10 (2), (2018).
- Davis, M. J., et al. Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection. MBio. 4 (3), e00264 (2013).
- Raggi, F., et al. Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).
- Van Overmeire, E., et al. M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).
- Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
- Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection. AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).
- Ciesek, S., et al. Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).
- Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).
- Hearps, A. C., et al. HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy. AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).
- Heggelund, L., et al. Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences. Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).
- Hernandez, J. C., et al. Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens. AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).
- Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages. Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).
- Low, H. Z., et al. TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads. Retrovirology. 13, 15 (2016).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling. PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).
- Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells. Cytokine. 91, 118-123 (2017).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs. Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).
- Hu, X., et al. Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study. International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Huang, J., et al. MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection. Journal of Virology. 91 (10), (2017).
- Lodge, R., et al. Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor. Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).
- Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP. PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).
- Riess, M., et al. Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).
- Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae. PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).
- Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
- Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).
- Tarique, A. A., et al. Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).
