Summary
Denna studie beskriver kvantitativa mätningar av synaptisk storlek och lokalisering, muskelmorfologi, och mitokondriell form i C. elegans med fritt tillgängliga bildbehandlingsverktyg. Detta tillvägagångssätt möjliggör framtida studier i C. elegans att kvantitativt jämföra omfattningen av vävnad och organell strukturella förändringar som ett resultat av genetiska mutationer.
Abstract
Att definiera de cellulära mekanismerna bakom sjukdomen är avgörande för utvecklingen av nya Therapeutics. En strategi som ofta används för att riva upp dessa mekanismer är att introducera mutationer i kandidatgener och kvalitativt beskriva förändringar i morfologin av vävnader och cellulära organeller. Men kvalitativa beskrivningar kan inte fånga subtila fenotypiska skillnader, kan förvränga fenotypiska variationer mellan individer i en population, och ofta bedöms subjektivt. Här beskrivs kvantitativa metoder för att studera morfologin av vävnader och organeller i Nematoden Caenorhabditis elegans med hjälp av laserscanning konfokalmikroskopi kombinerat med kommersiellt tillgängliga bio-bildbehandlingsprogram. En kvantitativ analys av fenotyper som påverkar synaps integritet (storlek och integrerad fluorescens), muskelutveckling (muskel Cellstorlek och myosin glödtrådens längd), och mitokondriell morfologi (cirkularitet och storlek) utfördes för att förstå effekterna av genetiska mutationer på dessa cellulära strukturer. Dessa kvantitativa metoder är inte begränsade till de tillämpningar som beskrivs här, eftersom de lätt kan användas för att kvantitativt bedöma morfologin av andra vävnader och organeller i Nematoden, liksom i andra modellorganismer.
Introduction
Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) utnyttjas alltmer som modellsystem för att avslöja biologiska och molekylära processer som är involverade i människans sjukdom. En vuxen Nematoden har en kroppslängd på drygt 1 mm, och kan producera en stor kull på upp till 300 ägg1. Efter kläckningen, C. elegans kräver bara 3-4 dagar att nå vuxen ålder, och leva i cirka 2 till 3 veckor2. På grund av dess enkla odling, är C. elegans för närvarande en av de mest eftertraktade in vivo djurmodeller för att genomföra kostnadseffektiv, snabb drog screening för att identifiera Therapeutics för mänskliga sjukdomar. Dessutom, dess genetiska bevarande, väl definierade beteendemässiga paradigm, transparent kropp för fluorescens eller ljus mikroskopi, och enkel genetisk manipulation göra studiet av cellulära och molekylära konsekvenserna av genetiska mutationer lätt achieveable 3. C. elegans Genome aktier cirka 60-80% ortologi med mänskliga gener, och cirka 40% av dessa gener är kända för att vara sjukdomsrelaterade. Några av de mänskliga sjukdomar som har modellerats och studerats i C. elegans inkluderar neurodegenerativa sjukdomar (Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, Charcot-Marie-Tooth sjukdom), muskelassocierade sjukdomar ( Duchennes muskeldystrofi) och metabola sjukdomar (hyperglykemi)2,4. I de flesta mänskliga sjukdomar, sjukdomsinducerad cellulära och organell lokalisering och morfologiska förändringar sker, som lätt kan utvärderas i Nematoden modellen.
Fluorescerande markörer har använts i stor utsträckning för att märka vävnader och organeller för dynamisk visualisering under mikroskopet. I C. eleganshar dock konventionella metoder som bedömer morfologiska oegentligheter på grund av genetiska mutationer till stor del förlitat sig på visuella beskrivningar. Även kvalitativa bedömningar kan omfatta bredare intervall av fenotypiska beskrivningar (synaptisk morfologi, GFP clumping, specifik axonal form, muskelfiber tjocklek, etc.) och ge en fågelperspektiv av de morfologiska förändringarna, de är mindre lämpade för jämföra små variationer mellan olika grupper. Dessutom baseras kvalitativa bedömningar på visuell och subjektiv utvärdering, vilket kan leda till över-eller underskattningar av morfologiska avvikelser. Slutligen kan kvalitativa observationer också variera kraftigt mellan individer, vilket skapar problem med datareplikering.
Under de senaste åren har ett antal användarvänliga och lättillgängliga beräkningsalgoritmer som kvantitativt kan analysera bilder utvecklats. Emellertid, utnyttjandet av sådan bildanalysprogram vara för vissa morfologiska studier, särskilt i förhållande till kroppen väggen muskler och mitokonen, i C. elegans forskning har släpat efter. För att förbättra den underliggande strukturella analysen i C. elegans, några av de lättillgängliga, öppen källkod bildanalysprogram vara trialed att kvantitativt jämföra effekterna av genetiska mutationer på muskel mitokondrier, organ vägg muskler och synaptiska Morfologi. Dessa experimentella förfaranden skissera i detalj hur dessa program (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan användas för att utvärdera förändringar i Synaptic storlek och Synaptic protein lokalisering, kropp vägg muskel område och fiberlängd, och mitokondriell storlek och cirkularitet som ett resultat av genetiska mutationer i Nematoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillväxt och underhåll av C. elegans -stammar
- Frö nematode tillväxt medium (NGM, se tabell över material) agar plattor med 300 μl av den långsamt växande E. coli stam OP50 i ett laminärt flöde skåp.
- Låt NGM agar plattorna i laminärt flöde skåpet torka.
Anmärkning: i avsaknad av laminärt flöde skåp, kan plattorna lämnas att torka på bänken, men de är mer benägna att kontaminering. - Överför minst 20 djur till var och en av två OP50-seedade NGM agar plattor att ha arbets bestånd. Det finns två huvudsakliga sätt att överföra djur.
- Plockning: lyft försiktigt djuren med en värmesteriliserad plockning. Denna metod är effektiv för att välja enskilda eller flera djur från en agarplatta. Att ha en liten skrapa av bakterier vid spetsen när plockning hjälper överföringen.
Obs: en pick är gjord av en liten bit platina tråd ca 4 cm lång som är inbäddad i en glaspipett, med tråd spetsen tillplattad att vara "spjut-liknande". Värm sterilisera plockningen mellan plockning för att förhindra korskontaminering. - Chunking: med hjälp av en steriliserad spatel, skära en liten kvadrat med agar som innehåller djuren från en tallrik och överföras upp och ner till en ny tallrik.
Anmärkningar: denna metod är allmänt användbar för att överföra ett stort antal maskar, och för att ta bort kontaminering från plattor genom flera omgångar av storlekar icke-förorenad agar. Undvik korskontaminering genom att flammande spateln i några sekunder och doppa spateln i 100% etanol mellan överföringar. Överföring från svalt plattor rekommenderas inte som svält och överbeläggning kan påverka hälsa och morfologi av cellulära och subcellulära strukturer.
- Plockning: lyft försiktigt djuren med en värmesteriliserad plockning. Denna metod är effektiv för att välja enskilda eller flera djur från en agarplatta. Att ha en liten skrapa av bakterier vid spetsen när plockning hjälper överföringen.
- Underhålla maskarna vid normal tillväxt temperatur (20 ° c). För att säkerställa kontinuerlig tillförsel av välutfodrade maskar, överföra maskar till nya OP50-seedade plattor varje 2 till 3 dagar.
2. ålder-synkronisera C. elegans
- Underhålla maskar på 3-4 NGM plattor tills befolkningen är trångt men inte svalt.
- Tvätta masken försiktigt från NGM-plattan med M9-lösning. Äggen kommer att förbli på plattan eftersom de fastnar i E. coli OP50. Upprepa med ytterligare fyra tvättsteg för att avlägsna alla kläckta djur.
- Låt maskarna kläcks i 40 min.
- Tillsätt 1-2 mL M9-lösning till plattan och snurra försiktigt för att lossa nyligen kläckta maskar.
- Samla in M9-lösningen med nyligen födda maskar och överför lösningen med maskar till en ny NGM-platta.
- Låt M9-lösningen avdunta genom att utsätta NGM-plattan för luft. Gör detta intill en öppen låga för att undvika kontaminering av NGM plattan.
- Odla maskar för 27 h vid 20 ° c för att möjliggöra utveckling i den tredje larv (L3) skede. För synkroniserade 3-dagars gamla vuxna djur, maskarna plockas på larv steg 4, och odlas i ytterligare 3 dagar för att nå 3-dagars gammal vuxen skede.
3. beredning av diabilder för avbildning
- Förbered 3-4% w/v Agreste lager i en mikrovågsugn-säker flaska (3-4 g i 100 ml ultrarent vatten).
Anmärkning: agar kan användas i stället för aguppstod vid samma koncentration. - Smält aguppstod noggrant i en mikrovågsugn, noga med att inte över koka, tills alla Agros löser (klar lösning). Förvara lösningen vid 70 ° c för att förhindra stelning.
Obs: Aguppstod lager kan användas flera gånger. Återvärm före användning om aguppen har stelnat. - Med hjälp av en Pastavpipett placerar du en droppe smält Agam på en Mikroskop bild.
Obs: Undvik att ha luftbubblor i droppe agar eftersom dessa stör integriteten hos dynan. - Omedelbart pressa ner aguppstod dropp med en annan Mikroskop bild, försiktigt tillplattning av Agam i en pad mellan de två bilderna.
Anmärkning: eventuella överblivna bubblor bör tas bort i detta skede. Om inte, nya bilder bör göras som djur kan lätt fastna i bubblorna. Undvik att överrinna agar åt sidan när du trycker på bilden. - Låt aguppstod torka i 1 min.
- Noggrant separera de två bilderna för att undvika skador på aguppstod, samtidigt som den stelnade pad på en av bilderna.
Obs: diabilder med Agam Pads bör alltid förberedas färskt precis innan experimentet som de kan torka ut. Se till att agaros pad har en jämn tjocklek. Det bör inte finnas några luftbubblor eller sprickor i dynan eftersom detta kan störa bildtagning. - Tillsätt en liten droppe (5-10 μL) av 0,05% tetramisole hydroklorid (bedövningsmedel) till mitten av Agros pad.
- Med hjälp av värmesteriliserad plockning, överför snabbt ca 10 – 15 djur från lagerplattan till anestesi droppet innan lösningen torkar ut. Undvik att överföra för mycket OP50 bakterier eftersom detta gör lösningen grumlig, vilket kan störa Imaging.
Anmärkning: om anestesi lösningen torkar ut medan du plockar, Pipettera bara en andra droppe 0,05% tetramisole hydroklorid på djuren. Djuren tenderar att lägga på sin laterala sida i bedövningsmedlet lösningen. - Applicera en täckslip genom att placera den precis ovanför agat pad och försiktigt släppa ner den. Detta kommer att förhindra bildandet av bubblor. Tryck inte på täcksteget eftersom det kan krossa djuren.
- Märk bilderna med Stamnamnet.
4. bedömning av synaptisk morfologi
Obs: effekterna av MEC-17 överuttryck på synapsen integritet i den bakre laterala mikrotubuli (PLM) touch receptor neuroner studerades genom att kvantifiera Synaptic storlek och lokalisering med hjälp av linje skanning konfokal mikroskopi. PLM-neuronerna (inklusive de synaptiska regionerna) visualiserades med hjälp av uIs115 (pmec-17:: tagRFP) transgenens (stam: TU40655) och den synaptiska regionen var särskilt märkt med jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) (stam: NM664 6) . Denna studie utfördes i synkroniserade L3 icke-transgena och transgena djur av den extrachromosomal MEC-17 överuttryck stam BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. En fullständig förteckning över stammar som används i denna studie ingår i tabell 1.
- Konfokal avbildning av touch receptor neuron synapser
- För att avbilda de synaptiska regionerna, använda en linje skanning konfokala Mikroskop kopplad till en 488 nm och 552 nm optiskt pumpade semi-ledare diodlaser och utrustad med bild Capture Software.
- Leta reda på maskarna med den lägsta förstoringen.
- När djuren är framgångsrikt belägna, byta till en 40X förstoring och tillämpa nedsänkning medium (i denna studie: en 40X/1.10 HC PL APO CS2 multi-uppslukande mål med vatten nedsänkning användes).
- Visualisera Synaptic regionen genom att spännande den fluoroforer med en 488 nm Laser (2% effekt) för GFP fluorophore och 552 nm (1% effekt) för tagRFP fluorophore.
- Bestäm optimal x-och y-ram för att fånga hela synaptiska regionen. Se till att ta hänsyn till den optimala pixelstorleken när du väljer ramen. I denna studie erhölls en konsekvent pixelstorlek på 56 nm.
- Fånga bilder med hjälp av en hybrid fotodetektor och ställa in vinster för att förhindra överexponering av fluoroforer (100% för 488 nm excitation och 15% för 552 nm excitation).
- Samla z-stack bilder för att täcka hela synapsen, med den optimala z-steg storlek beroende på det specifika mål som används. I denna studie användes en optimal z-stegstorlek på 0,211 nm.
Obs: se till att alla bilder är tagna under strikt tillstånd för att möjliggöra integrerad fluorescens-kvantifiering och jämförelse. Detta kan göras genom att hålla mikroskopi parametrar identiska över alla tagna bilder (dvs., laser och detektor inställningar, pixelstorlek, skanningshastighet, och optimal z-stegs storlek). Optimala inställningar beror på målet och kan beräknas med hjälp av tillgängliga bioinformatik program, såsom Nyquist Calculator (https://svi.nl/NyquistCalculator). Etikett bilder systematiskt, detta kommer att vara användbart när du använder bioinformatik programvara som kommer att organisera och bearbeta filer baserat på filnamn.
-
Kvantifiering av den synaptiska regionen
- För att analysera Synaptic regionen, exportera bilder som TIFF-filer. Java-baserade Imaging processing program som ImageJ, kan användas (i denna studie, MRI bild omvandling makro i ImageJ användes).
- Storleken och den integrerade fluorescensintensiteten hos synapser mättes från summan av de erhållna z-Travarna med CellProfiler-3.1.5. Ladda in bilderna i programvaran CellProfiler 3.1.5. Om det behövs kan bilder filtreras baserat på avbildningens filnamn.
- Ställ in namn-och typmodulen. Du kan också extrahera metadata från bild etiketten för att ordna beräknade data i enlighet med detta.
- Bestäm den synaptiska regionen för hand definition av denna region med hjälp av diffusa tagRFP uttrycks från uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) Transgene. Detta kan göras genom att lägga till modulen ämne i pipelinen CellProfiler-3.1.5.
- Om du vill mäta storleken och fluorescensen hos den handdefinierade synapsen lägger du till mått objekts storlek och form och mäter objektintensitetsmodulen i pipelinen.
- Beräkna den relativa integrerade fluorescensintensiteten genom att lägga till modulen Beräkna matematik . Dividera de integrerade intensitetsenheter som erhålls från jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) med de integrerade enheter som erhålls för UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
- Export mätningar och beräkningar.
5. kvantifiera kroppen vägg muskel struktur
- Fluorescensavbildning av kroppens vägg muskel struktur
- Få en stam (till exempel RW1596) transporterar transgenens stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006))8, som etiketter MYOSIN fibrer med GFP.
Anmärkning: införandet av transgenen till djur kan uppnås genom att antingen passera en stam av intresse med djur som redan uttrycker transgenen, eller microinjicera DNA i den distala armen av gonaden. Den "rullande" fenotyp som induceras av ROL-6- mutation i denna transgen underlättar visualisering av musklerna. Kroppen väggen muskler löper längs dorsala och ventrala sidor som normalt hindras från att visa i vildtyp djur eftersom de vanligtvis ligger på en av deras laterala sidor. Den ROL-6 (su1006) allel inducerar vridning av djuren, och därigenom utsätta vissa muskler celler för avbildning. - Bild djuren med hjälp av ett fluorescensmikroskop i kombination med en högupplöst kopplad enhets kamera (CCD), 40X objektiv eller högre, GFP-filter och förvärvs programvara.
- Justera exponeringstiden och belysningsintensiteten för att förhindra övermättade bilder.
- Fånga och spara bilder av muskler (400X förstoring) från en del av djuret som innehåller minst en komplett synlig sneda muskel cell. Undvik regioner med en enda muskel cell som är ofullständig eller sektioner som är ur fokus. Också utesluta bilder från extrema främre och bakre regioner, och regioner intill vulva.
Anmärkning: om djuret inte har en enda synlig komplett muskel cell, försiktigt glida täckglas att vända djuret så att exponera en komplett cell.
- Få en stam (till exempel RW1596) transporterar transgenens stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006))8, som etiketter MYOSIN fibrer med GFP.
- Mätning av muskel cell Area
- Öppna bilden i Fiji Software9 (version 2.0.0 användes i denna studie).
- Använd polygonmarkeringen för att noggrant spåra runt en enda sned muskel cell. Justera linjen för polygonen i slutet genom att dra ankarpunkten för att förbättra spårningen.
- Gå till analysera fliken överst i programvaran och klicka på mått för att beräkna området för urvalet. En separat resultattabell med området och andra mätningar kommer att visas. Om områdes mätningen saknas i resultattabellen går du till Ange mått under fliken analysera och kontrollerar att områdes rutan är markerad. Likaså, avmarkera andra mätningar som inte behövs.
- För muskelceller med en degenererade/saknas region, spåra den saknade regionen med polygon markeringsverktyget och klicka på mått igen. Om det finns flera luckor i cellen, spåra varje mellanrum separat.
- Beräkna förhållandet mellan gap området till hela den enda muskelcellen. En hög ratio indikerar en högre grad av muskel degeneration på grund av stora luckor i cellen. Om det inte finns några saknade regioner, som vanligtvis ses i vildtyps djur, skulle kvoten beräknas som noll.
Obs: som en kontroll, Poäng också för muskel struktur defekter visuellt och jämföra resultat med den kvantitativa mätningen. Detta är särskilt användbart om stammen studeras för första gången i labbet. För fenotypisk scoring, bedöma djuren som defekta eller inte-defekt baserat på integriteten hos glödtrådarna. Till exempel, djur med förlust av distinkta glödtråden striationer, GFP klumpar, eller luckor i muskelceller på grund av strukturell uppdelning, skulle poängsättas som defekt.
- Segmentering och kvantifiering av myosin fiberlängd
- Om det behövs, först konvertera filer till. TIF med Fiji eller ett annat programpaket. Spara TIFF-filerna på önskad plats.
- Öppna ilastik10 (fri programvara, version 1.3.2 kan laddas ner från https://www.ilastik.org/).
- En gång i ilastik, Välj pixel klassificering under skapa nytt projekt. Programmet kommer att uppmana för projektet att sparas. Byt namn på projektet och spara till önskad plats.
Obs: ett nytt projekt behöver bara skapas en gång. Efterföljande segmentering kan göras med samma projekt. För att använda samma Projektinställningar, gå till projektfliken högst upp och klicka på Öppna projekt för att komma åt projektfilen. - Det bör finnas 5 flikar på den vänstra panelen (ingångsinformation, val av funktion, utbildning, förutsägelse export och batchbearbetning). På fliken indata klickar du på Lägg till ny och lägger sedan till separata bild (er). Dirigera popup-fönstret till mappen som innehåller TIFF-filerna och välj den bild som ska öppnas.
- I nästa flik nedan ( valavfunktion ), klicka på Välj funktioner för att välja alla pixel funktioner, som indikeras av gröna kryssade rutor. Pixelmarkeringen i det här steget används för att särskilja olika klasser av pixlar i nästa steg.
Valet av pixel funktioner beror på bildens upplösning. Därav, utvecklarna föreslår att välja alla eller så många funktioner som möjligt, om bearbetningen makt och tid tillstånd. - Följande utbildnings panel tillåter klassificering av olika objektklasser baserat på pixlar. I detta fall, de två klasserna är de enskilda GFP-uttrycker myosin glödtrådar och oönskade bakgrund eller suddiga kanter. Klicka på Lägg till etikett för att ha den första etiketten. Scrawl över ett antal glödtrådar att börja klassificerare Training.
Om du dubbelklickar på etiketten kan du ändra namn (till exempel döpa om "etikett 1" till "glödtråden"). Om du dubbelklickar på den färgade rutan kan färger för ritning och sannolikhets visning ändras. Standardstorleken på pensel är 1, även om storleken kan ökas till 61. Om fel pixel har dragits, Använd helt enkelt suddgummit för att ta bort ritningen. Tangentbordskontrollerna (-) och (Shift +) kan användas för att zooma in och ut ur bilden. Piltangenter används för att navigera runt bilden. - Lägg till en andra etikett och Byt namn på den till bakgrund. Scrawl över oönskade bakgrunder och mellanslag mellan glödtrådarna.
- Klicka på Live Update och se till att klassificeringen har gjorts av programvaran korrekt. Lägg till fler scrawls och finjustera träningen om det behövs.
Obs: det är viktigt att hålla utkik efter sammanslagna fibrer och suddiga kanter (t. ex. kropps linje) i detta steg. Förbättra förutsägelsen här så mycket som möjligt för att öka noggrannheten i mätningarna. Förutsägelsen noggrannhet beror också på bildupplösning, som pixlar i bilder med låg kvalitet är svårare att retas isär. Det är också valfritt men rekommenderas att köra filter metoden i funktionen föreslå funktioner bredvid Live Update -kontrollen. - När utbildning klassificerare har utförts på rätt sätt, gå till förutsägelse export panelen. Klicka på Välj Exportera bild Inställningar med sannolikheter som källa.
- Använd följande inställningar. Cut-out under region x och y kryssade, och c unticked. Start-och stoppvärdena för c ska vara 0 respektive 1. Markera och konvertera datatyp i transformationer till osignerade 8-bitars, kryssa renormalize [min, Max] och använda standardvärdena. Ändra formatet på utdatafilen video till PNG, och byta namn på filen och katalogen som du vill.
- Stäng fönstret exportinställningar och exportera den specifika avbildningen som just har segmenterats.
- Öppna den sparade PNG-bilden i Fiji programvara. Bilden ska visas i svartvitt.
- Justera bildens tröskelvärde med standardinställningarna.
- Applicera skeletonization plugin (Skeletonize 2D/3D, och sedan analysera skelett). En separat resultattabell visas, vilket inkluderar Grens längd. Förgrena sig längden föreställer fiber längden. Andra data i resultaten kan också vara användbara, såsom Euclidean avstånd.
Anmärkning: utelämna fibrer med längder på 0 μm eller mer än 250 μm, eftersom dessa storlekar inte är fysiologiskt möjliga.
6. kvantifiering av mitokondriell morfologi
Anmärkning: för kvantifiering av mitokondriell morfologi använde denna studie BXN0387 -stammen som innehöll UIs115 (pmec-17:: tagrfp)5 transgenens för att visualisera PLM-neuronerna och jsIs609 (pmec-4:: MLS:: GFP)11 för att visualisera mitokonen specifikt inom PLM-neuronerna. Denna studie utfördes i synkroniserade 3 dagar gamla vuxna maskar, men har framgångsrikt utförts i andra åldrar, samt i andra vävnader7.
- Fluorescensavbildning av mitokona inom PLM-neuronerna
- För att mäta storlek och formförändringar av mitokona inom PLM neuroner, visualisera både bakgrunden neuron och mitokonen med fluorescerande transgener.
- För att avbilda PLM neuron, Använd ett konfokal Mikroskop kopplad till en 488 nm och 552 nm optiskt pumpade semi-Conductor diodlaser och utrustad med bildfångst program.
- Bild masken enligt steg 4.1.1-4.1.4 ovan, vilket garanterar icke-mätande exponeringsförhållanden.
- För att visualisera hela neuron, kan en kaklad bild behövas. För att uppnå detta, använda programvara med en bricka scan alternativ för att lokalisera och släppa en markör i ett hörn av neuron och sedan lokalisera den motsatta änden och släppa den andra markören. Programvaran kommer att beräkna det optimala antalet brickor som behövs för att fånga det nödvändiga området.
Obs: för att minska skanningstiden, är det ofta lättare att lokalisera nervceller som följer ett enda plan, vilket resulterar i färre brickor. - För att koppla kakel skanning med en Z-stack, ställa in den nedre och övre gränser innan du startar kakel skanning, och se till att den optimala segmentstorleken är inställd.
- Se till att upplösningen är optimerad, eftersom segmenteringen blir mer förfinad med högre upplösningar (här användes en upplösning på 3224 x 3224 pixlar).
Obs: även om transgenen uIs115 (pmec-17:: tagRFP) används för att markera PLM och framgångsrikt positionera kameran, behöver den inte nödvändigtvis avbildas på grund av liten bakgrundfluorescens som observerats från JsIs609 (pmec-4:: MLS:: GFP) transgenens inom PLM Axon själv. Således kan skanning och bildtagning tid minskas genom att ta bort 552 nm-filtret från experimentet.
- Objektsegmentering med SQUASSH
- Konvertera bildfiler till TIFF -bilder och generera maximal intensitet projektioner från Z-stackar med Fiji Imaging Software. Beskär bilder till minimal storlek samtidigt som den innehåller hela neuron för att minska beräknings belastningen och minska bakgrundsbrus.
Anmärkning: för representativa resultat, endast mitokona inom den långa axonala processer ansågs, så cellen kroppen och alla mitokona inom var undantagna från varje bild. - Använda Mosaic Suite SQUASSH Macro för ImageJ, utföra Split Bregman segmentering12 på de maximala prognoserna. En detaljerad guide till installation och tillämpning av detta makro finns på Mosaic webbplats (http://mosaic.mpi-cbg.de/) och beskrivs av Rizk et al. 201413. Processen för bildsegmentering beskrivs i korthet nedan.
Obs: denna segmentering identifierar objekt (i detta fall individuella mitokonskens) över ett tröskelvärde för fluorescensintensitet, vilket möjliggör noggrann mätning av varje enskild objektstorlek och form. - Ta bort bakgrundsbrus från en bild med hjälp av metoden rullande boll, där ett användardefinierat fönster flyttas över bilden, vilket påverkar uppskattningen av den lokala bakgrunds intensiteten från den vanligast förekommande intensiteten i varje fönster. Detta korrigerar ojämna bakgrundintensiteter.
- Använd objektidentifiering för att ungefär hitta områden i bilden som innehåller objekt (mitokona) av intresse, baserat på fluorescensintensiteten och antalet pixlar. Parametrarna som styr det här steget är regularization och minsta objektintensitet.
Anmärkning: regularization används för att undvika segmentera liten intensitet, buller-inducerad toppar, och den lägsta nivån för objektorienterad hjälper till att definiera subcellulära organeller från bakgrund vävnad fluorescens. Dessa är de viktigaste två parametrarna som manipuleras för att hitta en optimal segmentering av mitokonen, och optimeringsprocessen tenderar att vara Trial och fel av olika parametrar för en test bild, följt av manuell inspektion. - Använd programvaran för att uppskatta de lokala bakgrunds intensiteterna runt varje objekt för att underlätta beräkningen av optimal segmentering.
- Mät enskilda objekt för storlek, omkrets, längd via pixel nummer, samt signalintensitet och x/y plats på bilden. För att beräkna mått i storlek (Nm), faktor i pixelstorleken på den ursprungliga bilden.
Observera: för varje experiment måste optimala parametrar först beräknas. För att säkerställa noggrannhet segmentering, är det lämpligt att utföra en SQUASSH analys på en test bild och manuellt inspektera noggrannheten av segmentering. Makrot ger utdatafiler som visar de enskilda objekt som identifierades på den ursprungliga bilden, och inspektera dessa noga och justera parametrar för att passa kommer att säkerställa en exakt segmentering. De definierade parametrarna måste sedan användas för hela experimentet för jämförbarhet. De parametrar som används för representativa resultat ingår i tabell 2. - Öppna Fiji eller ImageJ analysprogramvara, navigera till Mosaic Macro container och öppna SQUASSH menyn.
- Öppna undermenyn bakgrund subtraktion och se till att ta bort bakgrund? är markerad. Standardinställningen för fönsterstorlek är 10.
- Ställ in önskad regularisering och minsta objektintensitet, kanal 1 värden för att bäst identifiera och segmentera objekt (se steg 6.2.4). Kanal 2 -värden är inte nödvändiga för objekt som är markerade med en enda Transgene.
- Klicka på Beräkna polyesterstapelfibrer från objektiva egenskaper för att uppskatta funktionen punkt spridning baserat på mikroskopet egenskaper. Detta hjälper segmenteringen av nära placerade objekt genom att redogöra för påverkan av varje pixel på dess angränsande pixel.
Obs: subpixel segmentering användes inte i detta experiment på grund av dess ökade belastningen på datorn processorkraft. Cellmasker användes inte heller eftersom Axon är lätt att definiera. Dessa inställningar är användbara för mer komplexa vävnader och för att definiera objekt på en cell för cell basis. - Se till att objekt dispositioner och Spara objekt och Bildegenskaper är markerade för visualiserings alternativ. För användning senare i grafik och statistisk programvara, se till att rätt antal villkor matas in.
- Leta upp mappen med TIFF -bilder och kör makrot. Den här processen kan utföras på en enskild bild eller på en bunt bilder per genotyp som finns i en mapp. Utdatafiler kommer att finnas i mappen tillsammans med de ursprungliga bilderna.
- Konvertera bildfiler till TIFF -bilder och generera maximal intensitet projektioner från Z-stackar med Fiji Imaging Software. Beskär bilder till minimal storlek samtidigt som den innehåller hela neuron för att minska beräknings belastningen och minska bakgrundsbrus.
- Analys och mätningar av form
- Använd utdata från SQUASSH för att tillhandahålla en specificerad objektdata . csv -fil, som ger varje enskilt objekt per rad, inklusive dess mätningar enligt beskrivningen ovan.
Anmärkning: även om denna makro process automatiserar objekt mätningar, är det alltid viktigt att manuellt kontrollera produktionen bilder efter SQUASSH segmentering för att säkerställa att makrot har korrekt identifierat mitokona. - För att analysera formen på varje mitokona, Använd en tvådimensionell åtgärd för sfäricitet, cirkularitet, för att uppskatta avvikelsen av objektet från en perfekt cirkel.
Obs: cirkularitet är en funktion av område och omkrets (cirkularitet = (4 x π) x (område/omkrets2) där 1 = en perfekt cirkel och 0 = en rak linje. Detta kan åstadkommas med hjälp av en formel i grafik och statistisk programvara. - För att bestämma variansen i storlek och form över poolen av mitokondrien, beräkna histogram och en monterad Gaussisk distribution med hjälp av grafik och statistisk programvara, med behållare på 0,2 μm för mitokondriell storlek och 0,05 för mitokondriell cirkularitet.
- Använd utdata från SQUASSH för att tillhandahålla en specificerad objektdata . csv -fil, som ger varje enskilt objekt per rad, inklusive dess mätningar enligt beskrivningen ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans är en idealisk modellorganism för att studera morfologi av olika vävnader och organeller på grund av dess enkelhet, känd cellhärstamning, transparens och tillgängliga verktyg. Här erbjuder vi kvantitativa metoder för att studera organeller (t. ex. mitokona) och vävnader, inklusive synapser och muskler med hjälp av levande fluorescens Imaging och gratis bio-bildbehandlingsprogram.
Strikt reglering av MEC-17 uttryck krävs för normal synaps utveckling
För att ytterligare förstå funktionen av alfa-tubulin acetyl-transferas MEC-1714, 15, 16 i nervsystemet, vi studerade synaptisk morfologi i touch receptor nervceller i C. elegans överuttrycker proteinet17. Dessa cellulära strukturer är viktiga för neuron funktion som de tillåter signaler att överföras till angränsande nervceller. Bilder av PLM synaps samlades in med hjälp av en laserskanning konfokala Mikroskop och kvantitativ morfologi analys utfördes med hjälp av tillgänglig bio-bildbehandlingsprogram (figur 1a, B). Överuttrycket av MEC-17 resulterar i betydande minskningar av presynaptiska ansamlingar i PLM och minskade relativa integrerade fluorescensintensitet i SNB-1:: GFP-markören (figur 1c, D). Tillsammans, dessa resultat tyder på att överuttryck av MEC-17 stör normal synaps utveckling i PLM touch receptor nervceller.
Storleken på den presynaptiska platsen och relativ integrerad fluorescens studerades med hjälp av gratis bio-bildbehandlingsprogramvara CellProfiler 3.1.5. På grund av sin komplexa struktur, var synapser definieras för hand med hjälp av diffusa tagRFP protein uttryckt från uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) Transgene. Området för den definierade synapsen beräknades med antalet pixlar inom det definierade området. Jämfört med Wild-Type kontroll, djur som överuttrycker MEC-17 har signifikant reducerad pre Synaptic regioner (P = 0,0025; n ≥ 10) (figur 1C). För att studera synaptisk integritet jämfördes dessutom relativa integrerade fluorescensintensitetsnivåer. Detta beräknades genom att mäta integrerade fluorescensintensitetsnivåer inom den definierade synapsen för både SNB-1:: GFP och diffusible tagRFP. Därefter jämfördes SNB-1:: GFP-fluorescensvärdena i förhållande till tagRFP-värden för vilka en signifikant minskning (P = 0,0479; n ≥ 10) observerades med överuttryck av MEC-17 (figur 1d). Tillsammans, dessa resultat tyder på att rätt reglering av MEC-17 är viktigt för synaps utveckling.
Kvantitativ mätning av kroppen vägg muskel cellområde och fiberlängd avslöjar betydande defekter som ett resultat av mutationer i CMT2-relaterade gener
Mutation i generna MFN2, DNM2 och KIF5A har visat sig orsaka Charcot-Marie-Tooth typ 2 (CMT2), en axonal form av den vanligaste ärftliga perifer neuropati18, 19. CMT2 är vanligen förknippad med långsamt progressiv distala muskelsvaghet och atrofi, distala sensorisk försämring, missbildningar i foten och sekundära steppage gång. Som ett resultat, patienter drabbas ofta försvagande livslångt rörlighet försämringar. Det finns för närvarande inget botemedel för sjukdomen, delvis på grund av genetiska och kliniska heterogenitet i samband med CMT219, samt en brist på djurmodeller för att studera sjukdom patofysiologi. Därför, med hjälp av djurmodeller för att förstå de underliggande cellulära defekter kan ge svar på den okända CMT2 sjukdomsmekanismer.
Hittills publicerade studier som utvärderar kroppens vägg muskel defekter i C. elegans har förlitat sig på visuell scoring snarare än kvantitativa mätningar20. För att undvika subjektiva bias som kan inträffa under kvalitativ bedömning, kvantitativa mätningar av kroppen vägg muskel området och myosin fiberlängd var trialed med hjälp av tillgängliga bildbehandlings program. Vi använde dessa metoder för att bedöma muskel morfologi hos djur som transporterar mutationer i FZO-1/MFN2, dyn-1/DNM2 och UNC-116/KIF5A gener i 3-dagars gammal vuxen C. elegans. För båda mätningarna, ett antal villkor tillämpades, så att åtminstone en enda komplett sned muskel cell var inom synvinkel, muskelceller som var suddig eller ur fokus uteslöts, och extrema främre och bakre regioner, samt regioner i anslutning till vulvan utelämnades. Förutom de mutationer i CMT2-associerade gener, djur också transporteras stEx30 (pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) transgenens som etiketter en C. elegans myosin tung kedja subenhet med GFP (figur 2A-E). Den enkla polygon verktyg i Fiji programvara9 (version 2.0.0) användes för att mäta området för en enda muskel cell. Om ett djur erfarna kropp vägg muskel struktur uppdelning, lämnar bakom tomma utrymmen inom muskelceller, förhållandet mellan gap område till totalt enda muskel cellområde beräknades och jämfördes med Wild-typkontroll (figur 3a). För att få mätningar av myosin fiberlängd var varje bild först segmenterad med ilastik programvara10 (version 1.3.0) (figur 3b). Segmentering är en process som gör att de enskilda muskelfibrerna klassificeras och separeras från oönskade avsnitt som bakgrunden. Efter segmenteringen exporterades avbildningen som en otilldelad 8-bitars binär avbildning. Fiji (version 2.0.0) var nästa används för att Skeletonize den binära bilden för att filtrera ut gränsen pixlar, lämnar bakom fragment som representerar de ursprungliga fibrerna. Grenen längder av skelett, eller enskilda myosin glödtrådar, analyserades sedan i Fiji. Längdmätningar på 0 eller mer än 250 μm, vilket är den maximala rimliga längden för en glöd tråds även med muskelsträckning, exkluderades. Sammanlagt mättes mellan 2000 till 3000 myosin fiber längder. En sammanfattning av segmenteringen arbetsflöde visas i figur 3b. Resultat från den kvantitativa analysen jämfördes ytterligare med visuell bedömning av skador kropps väggen muskel, där 3-dagars gamla djur kategoriserades som defekt eller inte-defekt baserat på muskel struktur integritet.
Defekter i kroppens vägg muskel morfologi observerades mellan 2,5 till 3,5 gånger högre i FZO-1 (cjn020), dyn-1 (ky51) och UNC-116 (e2310) djur än hos vildtyp djur under visuell bedömning (figur 4a). De flesta djur med mutationer i FZO-1 och UNC-116 upplevde iögonfallande förlust av muskel STRIATIONER, stora GFP klumpar på grund av ansamling av cellulära skräp, och muskelfiber degeneration som lämnade gapande utrymme inom muskelceller ( Figur 2C, E). Däremot var mer än 60% av dyn-1 mutanter gjorde visuellt defekt, var omfattningen av defekter minimal jämfört med de andra två genetiska mutanter. Det fanns bara liten förlust av strisationer, inga GFP aggregeringar och endast mindre muskel degeneration jämfört med de andra två mutanter (figur 2D och figur 4a). I likhet med andra fenotypiska Poäng kan omfattningen av felen inte övervägas, och en tendens till bias kan leda till att en större andel defekter registreras. Därför, kvantitativa mätningar av muskel cellområde och fiberlängd skulle ge en mer exakt representation av omfattningen av muskel defekter än visuell bedömning ensam. I linje med de stora luckor som observerats med visuell poängsättning visades förhållandet mellan gap området och det totala enskilda cellområdet vara 5 till 6 gånger högre i FZO-1- och UNC-116-muterade djur jämfört med den vildtyps grupp som endast upplevde försumbar nedbrytning av muskel strukturen (figur 4b). Avsaknaden av strukturell kollaps i dyn-1 mutanter resulterade i en icke-signifikant, 3-faldig ökning av klyftan till muskel cellområde ratio (figur 4b). Detta tyder också på att försöksledaren bias kan vara en faktor som bidrar till den höga andelen defekter som tilldelas av kvalitativ bedömning. Ändå minskade de små klyftorna den genomsnittliga fiber längden från 24 μm i vildtyp till 22 μm i dyn-1 mutanter (figur 4c). Den genomsnittliga fiberlängd var dramatiskt kortare i FZO-1 och UNC-116 mutanter, korrelera med närvaron av större luckor i degenererade muskelceller hos dessa djur (figur 2C,E och figur 4c ). Dessa resultat är förenliga med våra senaste fynd som studerar effekterna av muterar CMT2-asscoiated gener i C. elegans20. Dessutom belyser de mer exakt bedömning av muskelmorfologi med hjälp av dessa kvantitativa metoder jämfört med visuell poängsättning ensam, och ger belägg för att FZO-1 och UNC-116 krävs för normal muskelmorfologi.
Kvantitativa mätningar av mitokondriell morfologi med hjälp av SQUASSH objektsegmentering
För att förstå hur frånvaron av mitokondriell fission påverkar mitokondriell morfologi i C. elegans neuroner, utförde vi kvantitativa analyser i PLM mechanosensoriska nervceller. DRP-1, C. elegans orthologue av däggdjurs dynamin-relaterade protein 1 (DRP1), kontrollerar mitokondriell fission, där vid aktivering rekryteras från Cytosol att bilda en spiral runt mitokonen, sammandragning och slutligen bryta båda de inre och yttre mitokondriella membranen21, 22. Vi fluoresceras med en vävnadspecifik transgen i PLM-neuronerna, som har en lång axonal process som lätt kan visualiseras med hjälp av epifluorescens-mikroskopi. En förlust av fission är en hypotes om att störa den totala mitokondriella dynamiken, och därmed minska skapandet av nyare, mindre mitokondrier genom en process som kallas spirande23.
Vi utförde SQUASSH segmentering att jämföra mitokondriell morfologi i vild-typ och DRP-1 Mutant djur. Vi analyserade mitokonan från 6 PLM neuroner per genotyp, vilket resulterar i ett n värde av större att 200 mitokona för varje. Schematiska och representativa bilder visas i figur 5a, B. Vi fann att mutanter som saknar DRP-1 hade större och mer långsträckta mitokona (Figur 5b-F). Mitokondrien i DRP-1 Mutant bakgrund var 32% större än vildtyp (p = 0,0006, figur 5c), och 14% mer långsträckt (längre från en perfekt cirkel) (P < 0,0001, figur 5D). För en mer detaljerad bedömning av variansen i storlek och form, vi plottade histogram för varje åtgärd, montering av data till Gaussian fördelningar (figur 5E, F). Vi fann att för både storlek och cirkularitet, mutanter som saknar fission proteinet hade en större varians (p < 0,0001 för båda), belystes av närvaron av större och mer långsträckta mitokondrie/Mitochondrial nätverk (se figur 5Bii för exempel ). Sammantaget fann vi bevis som tyder på att mutation av DRP-1 orsakar en brist på fission inom PLM neuroner, vilket resulterar i större och mer långsträckt mitokona. Vi visade också att störning av mitokondriell fission orsakar en ökning av variationen av mitokondriell morfologi.
Figur 1: kvantifiering av synapseintegriteten i PLM-neuronerna. (A) bilder är maximala z-projektioner av PLM Synaptic region i ett icke-transgena djur. Den vänstra panelen visar PLM neuron märkt med tagRFP, den andra panelen visar pre Synaptic regionen märkt med SNB-1:: GFP, den tredje bilden är en overlay med co-lokalisering representerade i gult, och den fjärde panelen är en schematisk av overlay bilden. B) maximalt antal z-projektion-konfokalbilder av den synaptiska regionen hos djur som ÖVERUTTRYCKER MEC-17. Bilderna visas som per panel A. C kvantifiering av den presynaptiska regionen i icke-transgena jämfört med transgena djur som ÖVERUTTRYCKER MEC-17. D kvantifiering av de relativa integrerade fluorescensnivåer för SNB-1: GFP i icke-transgenik kontra transgena djur som ÖVERUTTRYCKER MEC-17. För (C) och (D), individ synapser som analyseras, föreställs av cirklar; n ≥ 10; medelvärde ± visas i svart. P -värden * < 0,05, * * < 0,01 från ej Parade t-tester; skalstreck representerar 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: visualisering av kropps Väggs musklerna i C. elegans . A) ett djur som uttrycker StEx30 (pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) Transgene, som etiketter myosin tung kedja med GFP i kroppen väggen muskler. Matrisen inducerar också en rullande fenotyp i djuret som underlättar visualisering av muskelceller arrangerade längs dorsala och ventrala sidorna av kroppen. Representativ förstorade vyer av myosin fibrer i (B) vildtyp, (C) FZO-1 (cjn020), (D) dyn-1 (ky51) och (E) UNC-116 (e2310) djur. Alla djur var avbildade på den 3-dagars gamla vuxen scenen. Skalstapeln motsvarar 60 μm i (A) och 30 μm i (B-E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mätning av kroppens vägg muskel område och fiberlängd med hjälp av tillgängliga beräkningsalgoritmer. (A) exempel bild som visar hur det inre gapet utrymme inom en enda muskel cell (röd-slutna), och området för hela cellen (gula-slutna) dras och beräknas i Fiji för att få muskel området förhållandet. (B) disposition av segmenteringprotokollet på en enda exempel bild med hjälp av en kombination av Fiji och ilastik. Skalstapeln representerar 30 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvalificering och kvantifiering av defekter i kropps Väggs muskeln. (A) visuell bedömning av skador på kroppens vägg muskler. B) jämförelse av blankstegs yta till totalt muskel cell områdes förhållande mellan WT och indikerade mutanter. (C) mätning av myosin fiberlängd. För (B) och (C), endast bilder med minst en komplett synlig sneda muskel cell ingick för analys. Fibrer med en längd av 0 μm eller längre än 250 μm exkluderades också. Stång representerar procent defekta djur i a och medelvärde ± S.E.M. i B och C. n värden som listas i varje stapel. Chi-square test med falsk Discovery Rate utfördes för att jämföra visuella defekter i (A), medan enkelriktad ANOVA med Dunnetts post hoc-tester för multipeljämförelse användes för att analysera kvantitativa mätningar i (B) och (C). *P < 0,05, * * * *p < 0,0001, ns = inte signifikant. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mitokondriell morfologi inom PLM-neurons axoner. (A) Schematisk av en bakre lateral mikrotubuli (PLM) mechanosensorisk neuron i svansen av C. elegans. Den röda rutan anger den ungefärliga placeringen av de markerade avsnitten i (B), som visar representativa bilder av GFP-märkta mitokona (pmec-4:: MLS:: GFP) inom PLM Axon. Ljust grön Auktor indikerar mitokon Jämfört med WT (i), DRP-1 (tm1108) mutanter (II) visar större, mer långsträckt mitokona. Bilderna är representativa för n = 6 PLM axoner från 6 maskar per genotyp; skalstreck = 15 μm. (C) medelstorlek (μm2) av enskilda mitokondier som kvantifieras genom squassh objektsegmentering i 3-dagars gamla vuxna (3doa) maskar. D) medelvärdet för cirkularitet hos enskilda mitokondier inom PLM Axon, som kvantifierats från squassh-objektmätningar i 3doas. (E) histogram och Gaussisk fördelning som visar variansen av mitokondriell storlek. F-test (P < 0,0001) visar att varianserna skiljer sig markant mellan DRP-1 och WT. (f) histogram och Gaussisk fördelning som visar variansen av mitokondriell cirkularitet. Data representeras som medelvärde +/-SEM. * * * p < 0,001, * * * * p ≪ 0,0001 från Welch t-test; n ≥ 204 mitokona för kvantitativ analys från n = 6 maskar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stam namn | Genotyp | Källkod | Referens # | ||
| BXN038 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN366 | FZO-1 (cjn020); Myo-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN419 | DRP-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & lin-15A (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 17 | ||
| BXN675 | UNC-116 (e2310); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN685 | dyn-1 (ky51); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| NM664 | jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & lin-15A (n765) | Caenorhabditis Genetik centrerar | 6 | ||
| RW1596 | Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: MYO-3 + ROL-6 (su1006)) | Caenorhabditis Genetik centrerar | 8 | ||
| TU4065 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Martin Chalfie | 5 | ||
Tabell 1. Lista över C. elegans -stammar som används i denna studie.
| PLM Axon bilder | |
| Mål | 40x |
| Bildupplösning (per panel för tilescan) | 3224 x 3224 |
| Storlek på fönster för bakgrundsborttagning | 20 |
| POLYESTERSTAPELFIBRER XY | 0,78 |
| POLYESTERSTAPELFIBRER z | 0,68 |
| Legalisering | 0,15 |
| Lägsta fluorescensintensitet hos GFP | 0,4 |
Tabell 2. SQUASSH parametrar för segmentering av mitokonskerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morfologiska variationer har ofta bedömts genom manuell räkning av märkbara skillnader eller genom godtyckliga tröskelvärden för att fastställa defekter jämfört med en typ av vildtyp. På senare tid har dock kvantitativa metoder använts för jämförande studier av morfologi för att noggrant mäta och beskriva förändringar på en cellulär och subcellulär nivå på ett förutsättningslös sätt. Förmågan att identifiera subtila men biologiskt relevanta skillnader mellan fenotyper är ett kraftfullt sätt att förstå de bakomliggande molekylära mekanismer som styr förändringar i morfologi orsakad av miljömässiga faktorer eller genetiska sjukdomar. Den fortsatta ökningen av beräkningskraft och mikroskopi bildupplösning, tillsammans med den enkla tillväxten och mångsidigheten hos C. elegans Genetics har gett den perfekta plattformen för kombinationen av sofistikerade men ändå fri bildbehandling programvara med fina detaljerade konfokalbilder. Här har vi visat metoder för att utvärdera och kvantifiera Synaptic storlek och protein lokalisering, kropp vägg muskel område och fiberlängd, och mitokondriell morfologi i en rad genetiska bakgrunder.
Även om dessa analyser har visat en förmåga att kvantifiera subtila morfologiska skillnader, finns det begränsningar. Även om var och en av dessa analyser utnyttjar öppen källkod och lätt tillgänglig programvara, de förlitar sig på hög kvalitet, skarpa bilder för att korrekt lösa cellulära strukturer och subcellulära organeller. Detta kan ofta vara ett begränsande steg, eftersom känslig hög-end utrustning, såsom konfokala Mikroskop med avancerade detektorer, krävs för att fånga bilder med tillfredsställande upplösning. Dessa är inte alltid tillgängliga för laboratorier, och analys med sub-par-teknik kan leda till felaktiga och unrepeatable resultat. Dessutom, medan varje teknik syftar till att minska experimenteraren bias med hjälp av datoralgoritmer, det finns fortfarande steg som kan innebära en del av mänskliga fel. Den manuella definitionen av synapsen för hand, disposition av muskel cellområdet, parametern optimeringar av mitokondriell segmentering av ögat är alla områden som kan förbättras i detta avseende. För att minska risken för mänskliga misstag, studier kan genomföras i en blind mode eller alternativt bildanalysprogram vara kan användas för att definiera regionen av intresse själv. Med hjälp av cellmasker, där det önskade området för analys definieras av fluorescensen vid en annan våglängd, kan hjälpa detta. Detta används för att begränsa analysen till ett avsnitt i en bild som visar fluorescens ovanför ett inställt tröskelvärde, till exempel en cells kärna eller en transfekterade cell13,24. Dessutom begränsar användningen av enstaka tidspunkt bilder de frågor som dessa tekniker kan hantera. De processer som styr organell morfologi, synapsen formation och muskel struktur är mest sannolikt dynamiska, och skillnader kan ses inom samma cell beroende på utveckling eller biologisk status. Analys av dessa strukturer vid en specifik slutpunkt kan därför vara begränsande och tidsförlopp avbildning skulle vara fördelaktigt för övervakning av strukturella förändringar över tiden. Slutligen, medan morfologiska förändringar kan vara en bra indikator på störningar i cellulära processer, är korrelation inte alltid implicit. Till exempel har de senaste rönen hos olika arter visat att mitokondriell funktion och form verkligen kan skiljas åt7,25. Därför måste ytterligare analyser beaktas vid slutsatser av funktionella förändringar till följd av morfologiska skillnader.
Vi har kunnat påvisa användningen av dessa kvantitativa metoder i en särskild uppsättning vävnader och genetiska bakgrunder. emellertid, deras användning kan tillämpas mer allmänt. Fluorescenskvantifiering via avbildningsprogramvara kan användas för att analysera en rad olika subcellulära organeller såsom kärnor och endosomer, eller olika strukturer såsom nervceller och epitelceller, alla inom ramen för olika Mutant eller sjukdom Bakgrunder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna i Neumann Lab för värdefulla diskussioner och synpunkter. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH kontor forskningsinfrastruktur program (P40 OD010440). Författarna tackar WormBase för sin rikedom av information om C. elegans, och erkänna Monash Micro Imaging, Monash University, för tillhandahållande av instrumentering, utbildning och teknisk support. Detta arbete stöddes av CMTAA forskningsanslag (2015 och 2018), och NHMRC projektbidrag 1101974 och 1099690 tilldelas B.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S.
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al.
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
