Summary
Круговые РНК (циркрнки) являются некодирующие РНК, которые могут иметь роль в транскрипционной регуляции и посредничестве взаимодействий между белками. После оценки различных параметров для строительства библиотек секвенирования циркрнки был составлен протокол с использованием застрявшей общей подготовки библиотеки РНК с помощью предварительной обработки RNase R и представлен здесь.
Abstract
Циркулярные РНК (circRNAs) представляют собой класс некодирующих РНК, участвующих в функциях, включая регулирование микроРНК (miRNA), посредничество белково-белковых взаимодействий и регуляцию скррижки генов родителей. В классическом следующем поколении секвенирования РНК (РНК-сек), циркрнки, как правило, упускается из виду в результате выбора поли-A во время строительства библиотек мРНК, или находятся в очень низком изобилии, и поэтому трудно изолировать и обнаружить. Здесь был оптимизирован протокол строительства библиотеки circRNA путем сравнения комплектов подготовки библиотек, вариантов предварительной обработки и различных общих объемов ввода РНК. Были протестированы два коммерчески доступных целых комплекта подготовки библиотеки транскриптома, с и без RNase R предварительной обработки, а также с использованием переменных количеств общего объема РНК-ввода (1 до 4 мкг). Наконец, несколько типов тканей; включая печень, легкие, лимфатические узлы и поджелудочную железу; а также несколько областей мозга; включая мозжечок, нижнюю теменной доли, среднюю височную извилину, затылочную кору и превосходную лобную извилину; были сравнена для оценки изобилия циркрнки по типам тканей. Анализ генерируемых данных РНК-сек с использованием шести различных инструментов обнаружения циркрнки (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC и CIRCexplorer) показал, что полный комплект подготовки библиотеки РНК с RNase R предварительной обработкой и 4 мкг РНК-ввода является оптимальным метод определения наивысшего относительного числа циркрн. В соответствии с предыдущими выводами, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в тканях мозга по сравнению с другими типами тканей.
Introduction
Круговые РНК (CircRNAs) являются эндогенными, не кодирующих РНК, которые привлекли внимание, учитывая их широкое выражение в эукариотической транскриптоме1,2,3. Они образуются, когда экзоны обратно-сращивания друг к другу и, следовательно, первоначально считались сращивания артефактов4,5. Тем не менее, недавние исследования показали, что циркрнки экспонат авт., ткани, и стадии развития специфической экспрессии3,6 и эволюционно сохранены2,3. Кроме того, они участвуют в посредничестве белково-белковых взаимодействий7,микроРНК (miRNA) связывания3,8,9,10,и регуляции скрушины генов родительских11.
В классическом секвенировании РНК (РНК-сек) циркрнки могут быть полностью потеряны при строительстве библиотеки в результате выбора поли-А для мРНК или могут быть трудно изолировать, учитывая их низкое изобилие. Тем не менее, последние исследования характеристик циркрнки включили предварительный этап лечения с использованием RNase R для того, чтобы обогатить для цирка2,12,13. RNase R является экзорибонуклеазом, который переваривает линейные РНК, оставляя за собой круговые структуры РНК. Протоколы обогащения CircRNA были оптимизированы путем генерации и сравнения данных из двух коммерчески доступных целых комплектов транскриптомной библиотеки, с шагом предварительной обработки RNase R и без него, а также с использованием различных количеств общего объема ввода РНК (от 1 до 4 мкг). Оптимизированный протокол затем использовался для оценки обилия циркрнков в пяти различных областях мозга (мозжечок ,BC), нижняя теметельная доля «IP», средняя височная извилина «Mg», затылочная кора и превосходная лобная извилина »SF» и четыре других типа тканей (liver (ПА) , легочная « LU», лимфальное узели). Библиотеки RNA-seq были сопряжены с последовательностью конца и данные были проанализированы с помощью шести различных алгоритмов прогнозирования циркуляции: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17, и CIRCexplorer18. На основе нашего анализа, наибольшее количество уникальных циркрнков было обнаружено при использовании мель общей РНК комплект подготовки библиотеки с RNase R предварительной обработки и 4 мкг общего ввода РНК. Оптимизированный протокол описан здесь. Как сообщалось ранее19,20, наибольшее обогащение циркрнков наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование проводилось в соответствии со всеми институциональными, национальными и международными руководящими принципами в области благосостояния человека. Мозг ткани были получены из Баннер Солнце Здравоохранения научно-исследовательский институт мозга и тела Пожертвование программы в Сан-Сити, штат Аризона. Деятельность программы донорства мозга и тела одобрена Западным советом по институциональному обзору (#20120821 протокола WIRB). Все субъекты или их законные представители подписали информированное согласие. Коммерческие (не мозговые) биоспеции были приобретены у Proteogenex.
1. RNase R Лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих шагах объем реакции корректируется на общую сумму 50 кЛ. Это минимальный объем выборки, который будет использоваться в комплекте очистки РНК и концентратора (см. Таблица материалов). Кроме того, оптимизированный протокол, описанный здесь, предназначен для входной суммы 4 мкг общей РНК. Более длительное время инкубации для лечения RNase R рекомендуется для вхоложного количества
- Разбавить общую РНК до 4 мкг в 39 ЛЛ RNase свободной воды в микроцентрифуговой трубки и хорошо перемешать путем пипеттинг.
- В отдельной трубке разбавьте RNase R до рабочей концентрации 2 U/Зл с 1x RNase R Реакционный буфер. Сделать только достаточно для немедленного использования.
- Пипетка 39 зл и 5 л 10x RNase R Реакция буфера в 1,5 мл реакционной трубки и хорошо перемешать путем пипеттинг (50 л будет общий объем реакции). Далее, добавьте 6 зл ИТ RNase R (2 U/L).
- Отрегулируйте пипетку до полного объема реакции (50 л) и хорошо перемешайте, в10 раз пополнив трубку вверх и вниз.
- Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Убедитесь, что полный объем реакции погружается в водяную ванну.
- Поместите трубку на лед и немедленно приступаем к очистке РНК и концентрации (раздел 2).
2. Очистка РНК с помощью РНК очистки и концентратор комплект
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании высококачественной РНК (RIN'gt;8, DV200'gt;80%), лечение RNase R может привести к потере примерно 60% РНК. Используя ввод 4 мкг, предполагается, что после раздела 1 остается 2-2,5 мкг обработанной РНК.
- Перед началом, подготовить РНК мыть буфер, добавив 48 мл 100% этанола в буферный концентрат и хорошо перемешать путем пипеттинг. Поместите колонны очистки в трубки для сбора (см. Таблицу Материалов)и поместите в стойку трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие настройки центрифугации для всех следующих шагов: 10 000-16 000 х г. Если dNase I лечение уже было выполнено, пропустить DNase I лечение на данном этапе. - Добавьте 2 тома РНК Связывающий буфер в образец RNase R и хорошо перемешайте путем пипеттинга (общий объем: 150 зл).
- Добавьте 1 том 100% этанола в РНК Связывающий буфер и RNase R обработанные образца смеси, и хорошо перемешать путем пипеттинг (общий объем: 300 кЛ).
- Перенесите весь объем в столбец и центрифугируйте столбец на 30 с. Отбросьте поток.
- Добавьте 400 qL РНК Prep Buffer непосредственно к столбце, центрифугируйте столбец на 30 с и отбросьте поток.
- Добавьте 700 л РНК-буфера на колонку, центрифугируйте столбец на 30 с и отбросьте поток.
- Добавьте 400 qL РНК вымойте буфер непосредственно к столбце, центрифугиколонка в течение 2 минут, и передать столбец на свежий RNase свободной 1,5 мл трубки.
- Добавьте 11 кЛ воды без RNase непосредственно к столбце, держа наконечник пипетки прямо над фильтром колонны и гарантируя, что вода приземляется только на фильтр колонны.
- Инкубировать колонну в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифуги в течение 1 мин.
- Перед тем, как отбросить столбец, проверьте протекаете в трубке без RNase. Если элуция была успешной, храните образец при -80 градусах по Цельсию или немедленно приступайте к подготовке библиотеки. Окончательный общий объем элюции, насчитываемый примерно в 10 зл, используется для строительства библиотеки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пункт остановки: Оставьте РНК при -80 градусов на срок до 7 дней, прежде чем продолжить подготовку библиотеки.
3. CircRNA Библиотека Prep
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблица материалов для комплекта, который содержит большинство реагентов, используемых в этом разделе.
- РРНК истощение и фрагментация
- Перенесите 10 л очищенной РНК со ступени 2.10 в чистый колодец в новой 96-колодской пЦР пластине 0,3 мл. К скважине добавьте 5 зЛ связывающего буфера rRNA, за которым следует 5 кЛ рРНК Удаление Mix. Аккуратно пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать.
- Печать пластины и инкубировать в течение 5 мин при 68 градусах По Цельсию на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блока. После завершения 5 мин инкубации, поместите тарелку на скамейку и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Снимите уплотнение с тарелки. Добавьте в образец 35 зл. вихревых комнатных шариков удаления rRNA. Отрегулируйте пипетку до 45 qL и пипетки вверх и вниз 10-20x, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать тарелку в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Перенесите пластину на магнитную подставку и инкубировать на подставке в течение 1 мин или до тех пор, пока раствор не расчистит. Перенесите все супернатанты (45 евро) в новый колодец на той же пластине или новую пластину (в зависимости от того, с каким количеством образцов вы работаете).
- Vortex РНК очистки шарики (см. Таблица материалов) до тех пор, пока хорошо рассеялись, и добавить 99 л бусин к каждому образцу. Пипетка вверх и вниз 10x, чтобы смешать. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Перенесите пластину на магнитную подставку и инкубировать еще 5 мин или до тех пор, пока раствор не расчистит. Удалите и сбросьте все супернатанты из колодца.
- С пластиной еще на магнитной подставке, добавить 200 л свежеприготовленных 80% EtOH к колодцу, не нарушая шарики. Инкубировать в течение 30 с, затем удалить и отказаться от этанола. Повторите в общей сложности 2 стирания.
- Добавьте 11 кЛ elution Buffer к каждой скважине и пипетке вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем перенести на магнитную подставку, пока раствор не прояснит (1-5 мин).
- Перенесите 8,5 л супернатанта из скважины в новый колодец на той же тарелке или на новую пластину. Добавьте 8,5 зл и l из Elute, Primer, Фрагмент Высокой смеси для каждого хорошо содержащие образец. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать.
- Печать пластины и инкубировать в течение 8 мин при 94 градусах По Цельсию на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блока. Снимите с термоциклора, когда он достигнет 4 градусов по Цельсию и центрифуги кратко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приступайке к протоколу Synthesize First Strand cDNA.
- Синтезировать cDNA
- Для каждого готовящемся образца смешайте 9 л первого синтеза стрядок с 1 зл и обратной транскриптазой (см. Таблица материалов). Добавьте в образец 8 кл.л. смеси. Пипетка вверх и вниз 6 раз, чтобы смешать.
- Печать пластины и инкубировать на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоциклер блок, используя следующие параметры: 25 КК в течение 10 мин, 42 КК в течение 15 мин, 70 C в течение 15 мин, 4 C удержания. Немедленно приступайке ко второму синтезу нитей.
- Добавьте 5 юл буфера resuspension к каждому образцу, за которым следует 20 злиц мастер-микса второй отметки маркировки. Pipette весь объем вверх и вниз 6 раз.
- Печать пластины и инкубировать на заранее запрограммированных, предварительно нагретый термоцикл блок установлен до 16 градусов по Цельсию в течение 1 ч. После инкубации снимите пластину с термоциклора и дайте ей уравновеситься до комнатной температуры.
- Vortex PCR очищения шарики (см. Таблица материалов) и добавить 90 бусинок l к каждому колодцу образца. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.
- Перенесите смесь биса/образца на магнитную подставку и инкубировать в течение 5 мин или до тех пор, пока жидкость не очистится. Удалите и отбросьте супернатант.
- Добавьте 200 кЛ 80% EtOH к каждому образцу. Инкубировать образцы на магнитной подставке при комнатной температуре 30 с. Отбросьте супернатант. Повторите 1x.
- Дайте бисеру высохнуть при комнатной температуре в течение 6 мин, а затем снимите с магнитной стойки.
- Повторное увеличение шариков в буфере resuspension 19,5 л. Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин, затем переложить на магнитную стойку и инкубировать еще 1 мин или до тех пор, пока жидкость не очистит.
- Передача 17,5 л супернатанта на новую скважину/новую пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не происходит немедленно, образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 7 дней.
- Для каждого готовящемся образца смешайте 9 л первого синтеза стрядок с 1 зл и обратной транскриптазой (см. Таблица материалов). Добавьте в образец 8 кл.л. смеси. Пипетка вверх и вниз 6 раз, чтобы смешать.
- Подготовка библиотеки
- Добавьте 12,5 злителк A-Tailing Mix к каждому хорошо содержащему супернатант. Pipette весь объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать.
- Инкубировать реакцию на заранее запрограммированном, предварительно нагретом блоке термоциклора, установленном до 37 градусов по Цельсию, используя следующие параметры: 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 70 градусов по Цельсию в течение 5 мин, 4 градуса по Цельсию. Когда образцы достигают 4 градусов по Цельсию, немедленно приступайке к перевязке адаптера.
- К каждому образцу добавляйте 2,5 л буфера Resuspension, 2,5 л уникального адаптера РНК и 2,5 л ligation Mix. Пипетка вверх и вниз 10x, чтобы смешать.
- Инкубировать образцы на заранее запрограммированном, предварительно нагретом термоцикле блок при 30 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
- Добавьте 5 зЛ буфера стоп-лиги к каждому образцу и пипетку вверх и вниз, чтобы смешать.
- Добавьте 42 зЛ смешанных шариков очистки ПЦР к каждому образцу и тщательно перемешайте. Выполните шаги 3.2.6 до 3.2.10, но измените объем повторной подвески до 52 зл и окончательный объем elution до 50 зл.
- Повторите протокол очистки пЧР снова с 50 злификации от шага 3.3.6, но изменить объем повторного подвески до 22 Зл и окончательный объем elution до 20 Зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если не происходит немедленно, образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 7 дней. - Добавьте в каждый образец 5 зЛ пЦР Primer Cocktail и 25 Л ПЦР Master Mix. Смешайте путем pipetting вверх и вниз 10 раз. Инкубировать реакцию на запрограммированном, предварительно нагретом термоцикле блоке, используя следующие параметры: 98 градусов по Цельсию на 30 с; затем 8 циклов 98 градусов по Цельсию на 10 с, 60 градусов по Цельсию на 30 с и 72 градуса по Цельсию на 30 с; затем 72 кк в течение 5 мин, затем 4 градуса по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация общего числа циклов ПЦР может потребоваться для создания достаточного количества библиотекдля для секвенирования. - Следуйте протоколу для очистки шариков пЧР (шаги 3,2,4 до 3,2,9), за исключением добавления 50 qL хорошо смешанных бусинок пЦР очистки и изменения объема повторного подвески до 32,5 л с окончательным объемом elution 30 зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны храниться при -20 градусах Цельсия.
- Количественная оценка и контроль качества с помощью анализатора нуклеиновой кислоты
- Разрешить ленты и реагенты, чтобы уравновесить при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Смешайте 2 злицы библиотеки с 2 йЛ буфера HS D1000 и добавьте к совместимой скважине.
- Печать плотно с совместимым уплотнением фольги, и вихрь в течение 1 мин при 2000 об/мин.
- Спин вниз и загрузить пластину на анализатор следующие программные подсказки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер библиотек должен быть примерно 260 б.п.
4. Рабочий процесс анализа данных
- Последовательность библиотек RNA-seq (см. Таблица материалов) для генерации 82 bp парного конца читает. Преобразуйте исходные данные последовательности в виде файлов basecall (.bcl) в FAST с помощью инструмента bcl2fastq (v0.2.19).
- Обнаружение циркрн.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на ранее сообщенных доказательств того, что подход обнаружения цирка ансамбля работает лучше по сравнению с использованием одного инструмента обнаружения21,22, мы предлагаем использовать несколько инструментов для обнаружения цирка. Здесь были определены циркрнки с использованием шести существующих алгоритмов прогнозирования циркрнки: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE и DCC, применяя рекомендуемые параметры параметров для каждого алгоритма.- Скачать и установить каждый алгоритм обнаружения circRNA на высокопроизводительный вычислительный кластер Linux с помощью инструкций, предоставленных разработчиками.
- Выровняй РНК-сек ФАСТ с эталонным геномом (GRCh37), используя выровняте, рекомендованный для каждого инструмента.
- После выравнивания выполняйте алгоритмы обнаружения циркрнки, применяя рекомендуемые параметры параметров.
- Каждый инструмент будет выделять файл результатов нескольких столбцов со списком обнаруженных циркрнков, извлекать координаты циркрнков и количество поддерживающих считываний из этого, чтобы количественно определить количество кандидатов, обнаруженных в каждом состоянии выборки/теста.
- Преобразуйте выводковые координаты circRNA CIRI, Mapsplice и DCC в 0-основанные координаты, чтобы соответствовать трем другим алгоритмам.
- Выберите циркрнки с двумя или более поддерживающими считываниями или ниже по течению анализы и сравнения. Таблица 1 обобщает все параметры, оцениваемые в нашем исследовании, а также общее количество считывательных считок, генерируемых для каждого образца.
- Для каждого состояния образца/теста подсчитайте количество обнаруженных циркрн, нормализованных к количеству отображенных считок, генерируемых для этой библиотеки, на миллион. Обобщить результаты по различным инструментам/образцам в участках коробок, как описано в результатах представитель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сначала была проведена оценка данных, генерируемых с использованием коммерчески доступной универсальной РНК-системы управления (УК) и с использованием двух комплектов подготовки библиотек, оба из которых включают этап истощения рибо в своих протоколах. Используя аналитический рабочий процесс (рабочий процесс анализа данных, раздел 4), в целом в наборах данных TruSeq было обнаружено большее количество циркрн по сравнению с наборами Kapa(рисунок 1). Хотя рибосомные РНК (rRNA) проценты были ниже 5% в наборах данных из обоих комплектов для более низких объемов ввода (1, 2 ug), Kapa наборы данных имели более высокое содержание RRNA для 4, 5, и 10 ug входов (Таблица 2). Таким образом, на основе количества обнаруженных циркрний и эффективности истощения рРНК, дальнейшие эксперименты проводились с использованием комплекта TruSeq.
Далее, значение RNase R предварительной обработки был протестирован путем сравнения данных, полученных от RNase R предварительно обработанных и не предварительно обработанных библиотек. С этой целью, общая РНК была извлечена из MG здоровых пожилых людей и последовательности данных, полученных из библиотек с (N No 3) и без (N No 3) предварительного лечения с использованием RNase R23 был сравнен. Более высокое количество циркрнков было последовательно выявлено в предварительно обработанных библиотеках по сравнению с необработанными(рисунок 2). Это ожидается, так как предварительная обработка удаляет линейные РНК, тем самым обогащая для видов циркрнки.
В-третьих, было протестировано количество входной РНК, которое было бы оптимальным для обнаружения более высокого разнообразия циркрн. Библиотеки были подготовлены с использованием 1, 2 и 4 мкг общей входиной РНК, которая была извлечена из областей мозга MG, OC и SF, а также UC RNA. Сравнивая обилие циркрнков, обнаруженных в каждой библиотеке, наибольшее разнообразие видов циркрнки наблюдалось при использовании 4 мкг входного РНК по сравнению с 2 и 1 мкг(рисунок 3),что отражается на количестве уникальных циркрн. Одно предостережение отметить, что, хотя различные инкубационные времена во время лечения RNase R не были протестированы, тенденция, при которой все большее число циркрнков было обнаружено в общем объеме ВХОДов РНК от 1 до 4 мкг, наблюдалось при контроле по всем другим параметрам.
Этот оптимизированный протокол затем применялся в нескольких типах тканей для сравнения изобилия циркрнков. Пять областей мозга, в том числе до н.э., MG, OC, IP, и SF, из четырех здоровых пожилых людей, были протестированы, наряду с четырьмя другими типами тканей, в том числе LV, LU, LN и PA, из шести здоровых доноров. В целом, более высокое обилие циркрнки наблюдалось в головном мозге по сравнению с другими типами тканей(рисунок 4), как ранее сообщалось19,20.
Рисунок 1: Обнаружение цирка с использованием TruSeq против Капы всего комплектов РНК. Данные по секвенированию были получены для UC RNA с использованием двух отдельных общих комплектов подготовки библиотеки РНК, каждый из которых имеет 1, 2, 4, 5 и 10 мкг входной РНК и рибонуклизе R (RNase R) предварительной обработки. Количество циркрн, обнаруженных инструментами в каждой выборке, нормализовалось с числом отображенных считываемых считываемых на миллион (Y-оси). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Обнаружение циркрнки с и без RNase R предварительной обработки. Для сравнения воздействия rNase R предварительной обработки были использованы данные секвенирования, генерируемые с помощью комплекта TruSeq. РНК была извлечена из средней височной извилины (Mg) здоровых пожилых элементов управления для этого анализа. Нормализованное количество обнаруженных циркрн (Y-оси) было рассчитано аналогично рисунку 1. RNase РЗ - предварительно обработанные с RNase R, RNase R- - не предварительно обработанные с RNase R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Обнаружение циркрнки с использованием различного количества входиной РНК. Использование РНК, извлеченных из MG, затылочной коры (OC), и превосходной лобной извилины (SF), а также UC РНК, количество уникальных циркрн, обнаруженных при использовании 1, 2 и 4 мкг входной РНК, каждая из которых была построена с использованием комплекта TruSeq и RNase R предварительной обработки, было сравнено. Нормализованное количество обнаруженных циркрн (Y-оси) было рассчитано аналогично рисунку 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Обнаружение циркрнки в головном мозге по сравнению с другими типами тканей. CircRNA обогащенных наборов данных с помощью РНК, извлеченных из различных областей мозга, включая мозжечок (BC), нижнюю теменной доли (IP), MG, OC, и SF, а также четыре других типа тканей, включая печень (LV), легкие (LU), лимфатический узл (LN), и поджелудочной железы (PA) были созданы. Обогащение circRNA осуществлялось с использованием комплекта Illumina TruSeq с предварительной обработкой RNase R и 4 мкг общего объема входиной РНК. Участки коробки представляют число circRNAs обнаружено по крайней мере три из шести инструментов через образцы из каждого мозга области / ткани типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Тест # | Оценка параметров | Условия тестирования | Источник примера | Количество входных данных/условия/проверенные образцы | Общее количество считывательных |
| 1 | Комплект подготовки библиотеки | Illumina TruSeq Мель Всего РНК против Рош Капа Всего РНК комплекты | Uc | TruSeq: 1 мкг | 8,91,46,128 |
| TruSeq: 2 мкг | 7,93,90,202 | ||||
| TruSeq: 4 мкг | 6,66,12,238 | ||||
| TruSeq: 5 мкг | 7,88,56,902 | ||||
| TruSeq: 10 мкг | 6,61,06,874 | ||||
| Капа: 1 мкг | 8,83,95,496 | ||||
| Капа: 2 мкг | 10,66,59,272 | ||||
| Капа: 4 мкг | 10,62,34,954 | ||||
| Капа: 5 мкг | 7,47,75,914 | ||||
| Капа: 10 мкг | 11,00,68,504 | ||||
| 2 | Предварительное лечение | RNase R предварительнообработанных против не предварительно обработанных | Мг | Пара1: MG_1 (RNase РЗ) | 10,76,09,934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9,62,15,516 | ||||
| Пара2: MG_2 (RNase R) | 9,68,40,790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10,16,09,754 | ||||
| Пара3: MG_3 (RNase R) | 11,15,76,344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11,13,14,114 | ||||
| 3 | Общий объем ввода РНК | 1 мкг против 2 мкг против 4 мкг | MG, OC, SF, UC | М.Г.: 1 мкг | 12,00,94,758 |
| М.Г.: 2 мкг | 11,64,75,728 | ||||
| М.Г.: 4 мкг | 12,13,15,232 | ||||
| OC: 1 мкг | 11,11,18,120 | ||||
| OC: 2 мкг | 11,53,25,492 | ||||
| OC: 4 мкг | 11,49,13,266 | ||||
| SF: 1 мкг | 12,27,24,142 | ||||
| SF: 2 мкг | 9,39,33,288 | ||||
| SF: 4 мкг | 12,33,31,474 | ||||
| UC: 1 мкг | 9,24,48,120 | ||||
| UC: 2 мкг | 12,58,15,354 | ||||
| UC: 4 мкг | 12,56,92,534 | ||||
| 4 | Типы тканей | Области мозга по сравнению с другими типами тканей | до н.э., МГ, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10,72,08,904 |
| BC_2 | 11,18,33,362 | ||||
| BC_3 | 9,61,25,856 | ||||
| BC_4 | 9,62,77,094 | ||||
| IP_1 | 9,86,56,506 | ||||
| IP_2 | 11,35,95,746 | ||||
| IP_3 | 12,87,81,536 | ||||
| IP_4 | 9,59,81,446 | ||||
| MG_1 | 10,76,09,934 | ||||
| MG_2 | 9,68,40,790 | ||||
| MG_3 | 11,15,76,344 | ||||
| MG_4 | 10,05,39,028 | ||||
| OC_1 | 8,85,47,042 | ||||
| OC_2 | 12,09,83,142 | ||||
| OC_3 | 10,26,55,452 | ||||
| OC_4 | 10,84,49,330 | ||||
| SF_1 | 8,76,21,824 | ||||
| SF_2 | 14,50,57,894 | ||||
| SF_3 | 11,01,52,030 | ||||
| SF_4 | 9,67,24,472 | ||||
| LN_1 | 15,02,94,816 | ||||
| LN_2 | 8,33,30,187 | ||||
| LN_3 | 11,30,96,032 | ||||
| LN_4 | 10,78,38,278 | ||||
| LU_1 | 16,05,27,595 | ||||
| LU_2 | 8,94,30,799 | ||||
| LU_3 | 9,14,51,858 | ||||
| LV_1 | 9,72,18,369 | ||||
| LV_2 | 10,54,16,880 | ||||
| LV_3 | 8,86,53,148 | ||||
| LV_4 | 8,61,02,943 | ||||
| LV_5 | 12,87,88,483 | ||||
| LV_6 | 11,87,76,622 | ||||
| PA_1 | 8,79,20,160 | ||||
| PA_2 | 7,82,36,741 | ||||
| PA_3 | 10,21,24,209 | ||||
| PA_4 | 11,53,22,926 |
Таблица 1: Сводка по примерам и условиям тестирования. Резюме всех параметров и условий тестирования, оцененных в данном исследовании, а также общее количество считывательных считок, генерируемых для каждого образца. UC - универсальный контроль, М. - средняя височная извилина, OC - затылочная кора, до н.э. мозжечок, IP - нижняя перьевая доли, SF - превосходная лобная извилина, LU - легкое, LV и печень, ЛН - лимфатический узел, ПАО и поджелудочная железа, RNase R s ribonuclease R, RNase R
| Источник примера | Проверенные количества ввода/образцы | Процент rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 мкг | 5.53% |
| TruSeq: 2 мкг | 4.11% | |
| TruSeq: 4 мкг | 4.38% | |
| TruSeq: 5 мкг | 3.21% | |
| TruSeq: 10 мкг | 3.74% | |
| Капа: 1 мкг | 5.57% | |
| Капа: 2 мкг | 4.56% | |
| Капа: 4 мкг | 9.67% | |
| Капа: 5 мкг | 12.69% | |
| Капа: 10 мкг | 15.59% |
Таблица 2: проценты rRNA в библиотеках TruSeq против Капы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании были протестированы два коммерчески доступных комплекта для подготовки библиотек, варианты предварительной обработки и количество входной РНК для оптимизации протокола обогащения циркрнки для строительства библиотек секвенирования циркрнки. На основе оценок этого исследования очевиден ряд ключевых аспектов и важнейших шагов в создании библиотек секвенирования циркрн. Наша оценка подтверждает полезность RNase R предварительной обработки, о чем свидетельствует увеличение числа цирка, обнаруженных. В целом, наблюдалось более высокое разнообразие циркрнпри при использовании библиотечного комплекта Illumina TruSeq с предварительной обработкой RNase R и 4 мкг входиной РНК. Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что шаг по обогащению RNase R полезен для обнаружения цирка2.
Дополнительные ключевые аспекты строительства библиотеки циркрнки включают количество общей РНК, которая доступна для секвенирования, а также тип ткани, из которого извлечена РНК. Хотя было установлено, что ввод 4 мкг общей РНК дает наибольшее количество обнаруженных циркрнков, в большинстве исследований РНАСек используются злт; 1 мкг общей РНК, что получение более высоких количеств может быть сложным, особенно для анализа человеческих образцов. Идентификация циркрн по-прежнему осуществима для более низких объемов ввода, однако имеет значение признание того, что на специфику анализа может быть затронута. Это исследование также подчеркивает большее количество циркрнков, которые обнаружены в мозге человека по сравнению с другими тканями, как сообщалось ранее19,20. Поэтому крайне важно признать дифференциальное выражение циркрнков в различных типах тканей. Кроме того, дополнительные исследования в контексте болезни будут иметь важное значение для пролить свет на то, как циркРНК могут быть вовлечены в патогенные процессы.
Производительность двух оцененных комплектов подготовки библиотеки РНК также подчеркивает, что, хотя различные коммерчески доступные наборы могут продемонстрировать значительное сходство, различия по-прежнему наблюдаются при анализе цирка. Два основных вывода из этого сравнения включают уменьшение истощения РНК и меньшее число циркрн, выявленных с помощью одного подхода. Хотя одна из возможностей заключается в том, что более высокое изобилие rRNA в образце может помешать созданию последовательности в состоянии цирковой библиотеки молекул, этот вывод подчеркивает необходимость оценки, казалось бы, аналогичные комплекты, особенно когда реагенты являются собственностью.
Хотя данные, представленные здесь дает представление о существовании и обилии циркрнков в различных типах тканей, это исследование имеет несколько технических ограничений. Во-первых, в то время как лечение RNase R уменьшает популяцию линейных РНК в выборке, это не очень хорошо понятно, если этот шаг истощения вводит какие-либо предубеждения в обнаружении циркрнки и может ли он истощать циркрнки. Предыдущие исследования показали, что в некоторых случаях, циркрнки чувствительны к RNase R2,24,25. Во-вторых, неясно, приведет ли увеличение общего объема РНК выше 4 мкг к линейному увеличению числа выявленных циркрн. Как упоминалось ранее, имеющиеся общие РНК часто ограничены в научных исследованиях, поэтому более низкие объемы ввода были рассмотрены здесь. Следует отметить, что циркрнки все еще могут быть обнаружены при использовании более низких входных данных, но важно признать, что более низкие входные данные связаны с обнаружением меньшего числа циркрн. В-третьих, представленный здесь оптимизированный протокол использует РНК, извлеченные из определенного набора тканей. Учитывая переменное распределение экспрессии циркрнки по разным типам тканей, связь между общими объемами ввода РНК и числом выявленных циркрн может отличаться между тканями.
С ростом интереса к пониманию биологической роли циркрнков разрабатываются также новые стратегии, позволяющие лучше охарактеризовать и идентифицировать циркрнки. Один новый подход к биоинформатике позволяет выявлять циркрнки, которые могут быть низко выражены путем реконструкции полнометражныхциркрн, а также позволяет количественно определить экспрессию конкретных изоформ окрн. Этот подход использует функции, описанные как обратное перекрытие (RO) читает, что может произойти на 3' или 5 'концы цирка молекул библиотеки. Разработка новых стратегий выявления циркрнков, охватывающих как лабораторные подходы, так и средства биоинформатики, будет способствовать пониманию поля функции и воздействия циркрн.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) из Сан-Сити, штат Аризона, за предоставление тканей мозга человека. BBDP была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (U24 NS072026 Национальный мозг и ткани ресурс для болезни Паркинсона и связанных с ними расстройств), Национальный институт по проблемам старения (P30AG19610 Аризона болезнь Альцгеймера Основной центр), Аризона Департамент здравоохранения (контракт 211002, Аризона Альцгеймера исследовательский центр), Аризона биомедицинских исследований комиссии (контракты 4001, 0011, 05-901 и 1001 в Аризоне Паркинсона болезни консорциума) и Майкл J. Фокс Фонд исследований Паркинсона27. Это исследование было также поддержано DHS и штата Аризона (ADHS гранта ADHS14-052688). Мы также благодарим Андреа Шмитт (Banner Research) и Синтию Лечуга (TGen) за административную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
