Summary
Sirkulær RNAs (circRNAs) er ikke-koding RNAs som kan ha roller i transcriptional regulering og formidling interaksjoner mellom proteiner. Etter vurdering av ulike parametre for bygging av circRNA sekvensering biblioteker, en protokoll ble kompilert utnytte strandet total RNA biblioteket forberedelse med RNase R pre-behandling og er presentert her.
Abstract
Circular RNAs (circRNAs) er en klasse av ikke-koding RNAs involvert i funksjoner, inkludert Micro-RNA (miRNA) regulering, formidling av protein-protein interaksjoner, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon. I klassisk neste generasjon RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs er vanligvis oversett som følge av Poly-et utvalg under byggingen av mRNA biblioteker, eller finnes ved svært lav overflod, og er derfor vanskelig å isolere og oppdage. Her, en circRNA biblioteket konstruksjon protokollen ble optimalisert ved å sammenligne biblioteket forberedelse kits, forbehandling alternativer og ulike totale RNA input beløp. To kommersielt tilgjengelige hele transcriptome bibliotek Forberedelses sett, med og uten RNase R forbehandling, og ved hjelp av variable mengder totalt RNA-inngang (1 til 4 μg), ble testet. Til slutt, flere vevstyper; inkludert lever, lunge, lymfe node, og bukspyttkjertel; så vel som flere hjerneregioner; inkludert lillehjernen, mindreverdig parietal flik, midt Temporal gyrus, occipital cortex, og overlegen frontal gyrus; sammenlignet med å evaluere circRNA overflod på tvers av vevstyper. Analyse av de genererte RNA-SEQ-dataene ved hjelp av seks forskjellige circRNA gjenkjenningsverktøy (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC og CIRCexplorer) avslørte at en strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg RNA-inngang er den optimale metode for å identifisere det høyeste relative antallet circRNAs. I samsvar med tidligere funn, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen vev i forhold til andre typer vev.
Introduction
Sirkulær RNAs (CircRNAs) er endogene, ikke-koding RNAs som har fått oppmerksomhet gitt deres gjennomgående uttrykk i eukaryote transcriptome1,2,3. De dannes når exoner back-skjøte til hverandre og dermed ble i utgangspunktet anses å være skjøting gjenstander4,5. Men nyere studier har vist at circRNAs utstillingen celle type, vev, og utviklingsmessige scenen spesifikke uttrykk3,6 og er evolutionarily bevart2,3. Videre er de involvert i mekling av protein-protein interaksjoner7, mikro-RNA (miRNA) binding3,8,9,10, og regulering av foreldrenes genet transkripsjon11.
I klassisk RNA sekvensering (RNA-SEQ), circRNAs kan være helt tapt under biblioteket konstruksjon som et resultat av Poly-et utvalg for mRNAs eller kan være vanskelig å isolere gitt sin lave overflod. Men nylig circRNA karakterisering studier har innarbeidet en pre-Treatment trinn ved hjelp RNase R for å berike for circRNAs2,12,13. RNase R er en exoribonuclease som fordøyer lineær RNAs, og etterlater sirkulære RNA-strukturer. CircRNA berikelse protokoller ble optimalisert ved å generere og sammenligne data fra to kommersielt tilgjengelige hele transcriptome biblioteket konstruksjon kits, med og uten en RNase R pre-Treatment trinn, og ved hjelp av varierende mengder av total RNA input (1 til 4 μg). Den optimaliserte protokollen ble neste brukt til å evaluere overflod av circRNAs over fem forskjellige hjernen regioner (lillehjernen [BC], mindreverdig parietal flik [IP], midt Temporal gyrus [MG], occipital cortex [OC] og overlegen frontal gyrus [SF]) og fire andre vev typer (lever [LV], lunge [LU], lymfeknuter [LN] og bukspyttkjertel [PA]). RNA-SEQ bibliotekene ble sammenkoblet slutten sekvensert og data ble analysert ved hjelp av seks forskjellige circRNA prediksjon algoritmer: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, Knife16, DCC17, og CIRCexplorer18. Basert på vår analyse ble det høyeste antallet unike circRNAs oppdaget ved bruk av et strandet total RNA-biblioteks Forberedelses sett med RNase R forbehandling og 4 μg total inngang RNA. Den optimaliserte protokollen er beskrevet her. Som tidligere rapportert19,20, den høyeste berikelse av circRNAs ble observert i hjernen i forhold til andre typer vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne forskningen er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Brain vev ble innhentet fra banner Søn Health Research Institute Brain og Body donasjon program i Sun City, AZ. Driften av Brain and Body donasjon program er godkjent av Western institusjonelle Review Board (WIRB protokollen #20120821). Alle eller deres juridiske representanter undertegnet informert samtykke. Kommersielle (ikke-hjerne) biospecimens ble kjøpt fra Proteogenex.
1. RNase R behandling
Merk: I de følgende trinnene justeres reaksjons volumet til et total volum på 50 μL. Dette er det minste prøvevolumet som skal brukes i RNA-oppryddingen & konsentratoren (se tabell over materialer). I tillegg er den optimaliserte protokollen som er beskrevet her, for et inngangs beløp på 4 μg av total RNA. En lengre inkubasjonstid for behandling med RNase R anbefales for et inn data beløp > 4 μg.
- Fortynne total RNA til 4 μg i 39 μL RNase-fritt vann i et mikrosentrifugen rør og bland godt med pipettering.
- I et separat rør kan du fortynne RNase R til en arbeids konsentrasjon på 2 U/μL med 1x RNase R reaksjons buffer. Gjør bare nok for umiddelbar bruk.
- Pipetter 39 μL av total RNA og 5 μL av 10x RNase R reaksjons buffer i et 1,5 mL reaksjons rør og bland godt med pipettering (50 μL vil være det totale reaksjons volumet). Tilsett deretter 6 μL av RNase R (2 U/μL).
- Juster pipette til hele reaksjons volumet (50 μL) og bland godt ved å pipettering opp og ned 10 ganger.
- Plasser røret i et vannbad på 37 ° c i 10 min. Pass på at hele reaksjons volumet er nedsenket i vannbadet.
- Plasser røret på is og umiddelbart Fortsett med RNA-opprydding & konsentrasjon (avsnitt 2).
2. rensende RNA ved hjelp av en RNA CleanUp-og konsentrat Kit
Merk: Ved bruk av høy kvalitet RNA (RIN > DV200 > 80%), RNase R behandling kan resultere i tap av ca 60% av RNA. Ved bruk av en 4 μg-inngang anslås det at 2 – 2,5 mikrogram behandlet RNA blir etterlatt etter del 1.
- Før du starter, klargjør du RNA Wash buffer ved å legge 48 mL 100% etanol til buffer konsentrat og bland godt med pipettering. Plasser rense søyler i prøvetakingsrør (se tabell over materialer) og plasser i en tube rack.
Merk: Bruk følgende sentrifugering innstillinger for alle følgende trinn: 10000 – 16000 x g. Hvis DNase jeg behandling har allerede blitt utført, hoppe DNase jeg behandling på dette stadiet. - Legg til 2 bind av RNA binding buffer i RNase R-behandlet prøve, og bland godt med pipettering (totalt volum: 150 μL).
- Tilsett 1 bind av 100% etanol til RNA binding buffer og RNase R behandlet prøve blanding, og bland godt av pipettering (totalt volum: 300 μL).
- Overfør hele volumet til kolonnen og sentrifuger kolonnen for 30 s. kast strømmen gjennom.
- Tilsett 400 μL av RNA prep buffer direkte til søylen, sentrifuger kolonnen i 30 s, og kast flyten gjennom.
- Tilsett 700 μL av RNA Wash buffer direkte til søylen, sentrifuger kolonnen i 30 s, og kast flyten gjennom.
- Tilsett 400 μL av RNA vaske buffer direkte til søylen, sentrifuger kolonnen i 2 minutter, og Overfør kolonnen til en ny RNase-Free 1,5 mL tube.
- Tilsett 11 μL av RNase vann direkte til søylen ved å holde pipette spissen rett over kolonnefilteret og sikre at vannet lander bare på kolonnefilteret.
- Ruge kolonnen i 1 min ved romtemperatur og sentrifuge i 1 min.
- Før du kaster kolonnen, sjekk for flyt gjennom i RNase-Free tube. Hvis eluering var vellykket, lagre prøve på-80 ° c eller umiddelbart fortsette med biblioteket forberedelse. Det endelige totale eluering volumet på ca. 10 μL brukes til bibliotek konstruksjon.
Merk: Stoppe punkt: Forlat RNA at-80 ° c i opptil 7 dager før du fortsetter med å klargjøre biblioteket.
3. circRNA bibliotek prep
Merk: Se tabell over materialer for sett, som inneholder de fleste reagenser som brukes i denne delen.
- rRNA-tømming og fragmentering
- Overfør 10 μL av renset RNA fra trinn 2,10 til en ren brønn i en ny 96-brønn 0,3-mL PCR-plate. Tilsett 5 μL av rRNA bindings buffer etterfulgt av 5 μL rRNA Removal mix. Pipetter forsiktig opp og ned 10 ganger for å blande.
- Tetningsplate og ruge i 5 min ved 68 ° c på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk. Etter fullføring av 5 min inkubasjons, Plasser platen på benken og ruge ved romtemperatur i 1 min.
- Fjern forseglingen fra platen. Tilsett 35 μL av blåste romtemperatur rRNA fjerning perler å prøve. Juster pipette til 45 μL og pipette opp og ned 10-20x å blande grundig. Ruge plate i 1 min ved romtemperatur.
- Overfør platen til et magnetisk stativ og ruge på stativet i 1 min eller til løsningen tømmes. Overfør alle supernatanten (~ 45 μL) til nye brønn på samme plate, eller ny plate (avhengig av hvor mange prøver du arbeider med).
- Vortex RNA opprydding perlene (se tabell over materialer) til godt spredt, og tilsett 99 μL av perler til hver prøve. Pipetter opp og ned 10x å blande. Ruge platen ved romtemperatur i 10 min.
- Overfør platen til det magnetiske stativet og ruge ytterligere 5 min eller til løsningen forsvinner. Fjern og kast alle supernatanten fra brønnen.
- Med platen fortsatt på det magnetiske stativet, tilsett 200 μL av ferskt tilberedte 80% EtOH til brønnen uten å forstyrre perlene. Ruge for 30 s, deretter fjerne og forkaste etanol. Gjenta for totalt 2 vasker.
- Tilsett 11 μL av eluering buffer i hver brønn og Pipetter opp og ned 10 ganger for å blande. Ruge ved romtemperatur i 2 min, og deretter overføre til den magnetiske stativet til løsningen klarner (1 – 5 min).
- Overfør 8,5 μL av supernatanten fra brønnen til en ny brønn på samme plate eller til en ny plate. Tilsett 8,5 μL av Eluere, primer, fragment høy Mix til hver brønn som inneholder prøven. Pipetter opp og ned 10 ganger for å blande godt.
- Tetningsplate og ruge i 8 min ved 94 ° c på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk. Fjern fra thermocycler når den når 4 ° c og sentrifuger kort.
Merk: Fortsett umiddelbart til syntetisere First strand cDNA-protokollen.
- Syntetisere cDNA
- For hver prøve som forberedes, bland 9 μL første strand syntese Mix med 1 μL av revers transkriptase (se tabell over materialer). Tilsett 8 μL av blandingen i prøven. Pipetter opp og ned 6 ganger for å blande.
- Tetningsplate og ruge på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk ved hjelp av følgende parametre: 25 ° c i 10 min, 42 ° c i 15 min, 70 ° c i 15 min, 4 ° c hold. Fortsett umiddelbart til andre strand syntese.
- Tilsett 5 μL blanding buffer i hvert utvalg etterfulgt av 20 μL av Second strand merking Master mix. Pipetter hele volumet opp og ned 6 ganger.
- Tetningsplate og ruge på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk satt til 16 ° c for 1 time. Etter inkubasjons, Fjern platen fra thermocycler og la den likevekt til romtemperatur.
- Vortex PCR rensing perler (se tabell over materialer) og tilsett 90 μL perler til hver brønn av prøven. Pipetter opp og ned 10 ganger for å blande godt. Ruge ved romtemperatur i 10 min.
- Overfør perle/prøve blandingen til magnet stativet og ruge i 5 minutter eller til væsken forsvinner. Fjern og kast supernatanten.
- Tilsett 200 μL av 80% EtOH i hvert utvalg. Ruge prøver på det magnetiske stativet ved romtemperatur i 30 s. kast supernatanten. Gjenta 1x.
- La perlene tørke ved romtemperatur i 6 min, og fjern deretter fra magnetisk stativ.
- Resuspend perler i 19,5 μL av blanding buffer. Pipetter opp og ned 10 ganger for å blande godt. Ruge ved romtemperatur i 2 min, deretter overføre til magnetisk stativ og ruge for ytterligere 1 min eller til væsken klarner.
- Overføring 17,5 μL av supernatanten til ny brønn/ny plate.
Merk: Hvis det ikke går umiddelbart, kan prøvene oppbevares ved-20 ° c i opptil 7 dager.
- For hver prøve som forberedes, bland 9 μL første strand syntese Mix med 1 μL av revers transkriptase (se tabell over materialer). Tilsett 8 μL av blandingen i prøven. Pipetter opp og ned 6 ganger for å blande.
- Forberedelse av biblioteket
- Tilsett 12,5 μL av A-Tailing Mix til hver brønn som inneholder supernatanten. Pipetter hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande.
- Ruge reaksjonen på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk satt til 37 ° c ved hjelp av følgende parametre: 37 ° c i 30 min, 70 ° c i 5 min, 4 ° c hold. Når prøvene nå 4 ° c, Fortsett umiddelbart til adapter ligation.
- For hvert eksempel legges 2,5 μL av blanding buffer, 2,5 μL av en unik RNA-adapter, og 2,5 μL av ligation mix. Pipetter opp og ned 10x å blande.
- Ruge prøver på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk ved 30 ° c i 10 minutter.
- Tilsett 5 μL stopp ligation buffer i hver prøve og pipette opp og ned for å blande.
- Tilsett 42 μL av blandede PCR rensing perler til hver prøve og bland godt. Følg trinn 3.2.6 gjennom 3.2.10, men endre blanding volumet til 52 μL og endelig eluering volum til 50 μL.
- Gjentagelse av PCR rensing bead protokollen igjen med 50 μL eluering fra trinn 3.3.6, men endre blanding volum til 22 μL og endelig eluering volum til 20 μL.
Merk: Hvis det ikke går umiddelbart, kan prøvene oppbevares ved-20 ° c i opptil 7 dager. - Tilsett 5 μL av PCR primer cocktail og 25 μL av PCR Master Mix til hver prøve. Bland med pipettering opp og ned 10 ganger. Ruge reaksjonen på en pre-programmert, forvarmet thermocycler blokk ved hjelp av følgende parametere: 98 ° c for 30 s; deretter 8 sykluser med 98 ° c i 10 s, 60 ° c i 30 s, og 72 ° c for 30 s; deretter 72 ° c i 5 min, deretter 4 ° c hold.
Merk: Det kan være nødvendig å optimalisere det totale antallet PCR-sykluser for å generere tilstrekkelige mengder bibliotek for sekvenser. - Følg protokollen for PCR perle rensing (trinn 3.2.4 gjennom 3.2.9), bortsett fra tilsett 50 μL av godt blandede PCR rensing perler og endre blanding volumet til 32,5 μL med et endelig eluering volum på 30 μL.
Merk: Prøvene skal oppbevares ved-20 ° c.
- Kvantifisering og kvalitetskontroll ved hjelp av en nukleinsyre yre analysator
- La kassetter og reagenser likevekt ved romtemperatur i 30 minutter.
- Bland 2 μL av bibliotek med 2 μL av HS D1000 buffer, og Legg til en kompatibel brønn plate.
- Forsegle tett med kompatibel folie tetning, og Vortex på 1 min ved 2 000 rpm.
- Snurr ned og lasteplate på analysator følgende programvarespørsmål.
Merk: Bibliotekene bør være ca 260 BP i størrelse.
4. arbeidsflyt for data analyse
- Sekvens RNA-SEQ biblioteker (se tabell over materialer) for å generere 82 BP sammenkoblet-end leser. Konverter rådata sekvensering data i form av basecall filer (. BCL) til FASTQs hjelp av bcl2fastq verktøyet (v 0.2.19).
- Finn circRNAs.
Merk: Basert på tidligere rapportert bevis på at et ensemble circRNA Detection tilnærming yter bedre i forhold til å bruke et enkelt gjenkjenningsverktøy21,22, foreslår vi at du bruker flere verktøy for circRNA deteksjon. Her ble circRNAs identifisert ved hjelp av seks eksisterende circRNA prediksjon algoritmer: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE, og DCC, bruke de anbefalte parameterinnstillingene for hver algoritme.- Last ned og Installer hver circRNA deteksjon algoritme på en Linux høy ytelse Computing klyngen ved hjelp av instruksjonene fra utviklerne.
- Juster RNA-SEQ FASTQs mot referanse Genova (GRCh37), og bruk aligner som anbefales for hvert verktøy.
- Etter justering, kjøre circRNA deteksjon algoritmer ved å bruke sine respektive anbefalte parameterinnstillinger.
- Hver verktøyet ville produksjon en mange--søylen resultater arkiv med det liste over oppdaget circRNAs, ekstra det circRNA tilpasse-koordinater og antallet av hjelper leser fra her for at kvantifisere antallet av søkerne oppdaget inne hver prøve/test forfatning.
- Konverter circRNA-koordinatene utdata med CIRI, Mapsplice og DCC til 0-baserte koordinater for å være i samsvar med de tre andre algoritmene.
- Velg circRNAs med to eller flere støtte leser eller nedstrøms analyser og sammenligninger. Tabell 1 oppsummerer alle parametrene evaluert i vår studie sammen med det totale antall sekvensering leser generert for hver prøve.
- For hver prøve/test tilstand, telle antall oppdagede circRNAs normalisert til antall kartlagt leser generert for dette biblioteket, per million. Oppsummer resultatene på tvers av de ulike verktøy/samples i boksen tomter, som beskrevet i representative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data generert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig universell kontroll RNA (UC) og bruk av to biblioteks Forberedelses sett, som begge inkluderer et Ribo-trinn i protokollene, ble først vurdert. Ved hjelp av en analytisk arbeidsflyt (arbeidsflyt for data analyse, del 4), samlet, ble et høyere antall circRNAs oppdaget i TruSeq datasett sammenlignet med de kapa de (figur 1). Selv om ribosomal RNA (rRNA) prosenter var under 5% i datasett fra begge settene for lavere input beløp (1, 2 UG), kapa datasett hadde høyere rRNA innhold for 4, 5 og 10 UG innganger (tabell 2). Derfor, basert på antall oppdagede circRNAs og rRNA forringelse effektivitet, ytterligere eksperimenter ble utført ved hjelp av TruSeq Kit.
Neste, betydningen av RNase R pre-behandling ble testet ved å sammenligne data generert fra RNase R pre-behandlet og ikke-pre-behandlet bibliotekene. For dette formål, total RNA ble Hentet fra MG av friske eldre individer og sekvensering data generert fra bibliotekene med (N = 3) og uten (N = 3) forbehandling bruker RNase R23 ble sammenlignet. Et høyere antall circRNAs ble konsekvent identifisert i pre-behandlet bibliotekene i forhold til ikke-pre-behandlet seg (figur 2). Dette er forventet siden pre-behandling fjerner lineære RNAs, og dermed berikende for circRNA arter.
For det tredje, mengden av input RNA som ville være optimalt for å påvise et høyere mangfold av circRNAs ble testet. Bibliotekene ble fremstilt ved hjelp av 1, 2 og 4 μg av total input RNA, som ble Hentet fra hjerne regionene MG, OC og SF, og i tillegg til UC RNA. Sammenligning av overflod av circRNAs oppdaget fra hvert bibliotek, det høyeste mangfoldet av circRNA arter ble observert ved bruk av 4 μg input RNA sammenlignet med 2 og 1 μg (Figur 3), som gjenspeiles av antall unike circRNAs identifisert. En påminnelse å merke er at selv om ulike inkubasjons tider under RNase R behandling ikke ble testet, en trend der et økende antall circRNAs ble oppdaget over totalt RNA innganger på 1 til 4 μg ble observert ved kontroll for alle andre parametre.
Denne optimaliserte protokollen ble deretter brukt på tvers av flere vevstyper for å sammenligne circRNA-forekomster. Fem hjernen regioner, inkludert BC, MG, OC, IP, og SF, fra fire friske eldre individer, ble testet, sammen med fire andre typer vev, inkludert LV, LU, LN og PA, fra seks sunne donorer. Overall, en høyere overflod av circRNAs ble observert i hjernen i forhold til andre typer vev (Figur 4), som har vært tidligere rapportert19,20.
Figur 1: CircRNA-gjenkjenning ved hjelp av TruSeq vs. kapa totale RNA-sett. Data fra sekvensering ble generert for UC RNA ved hjelp av to separate total RNA-bibliotek Forberedelses sett, hver med 1, 2, 4, 5 og 10 μg-inndata RNA og ribonuklease R (RNase R) forbehandling. Antall circRNAs oppdaget av verktøyene i hvert utvalg ble normalisert til antall kartlagt leser, per million (Y-aksen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CircRNA deteksjon med og uten RNase R pre-behandling. Sekvensering data generert ved hjelp av TruSeq Kit ble brukt til å sammenligne effekten av RNase R pre-behandling. RNA ble Hentet fra den midterste timelige gyrus (MG) av sunne eldre kontroller for denne analysen. Normalisert antall circRNAs oppdaget (Y-aksen) ble beregnet på samme måte som figur 1. RNase R + = pre-behandlet med RNase R, RNase R-= ikke pre-behandlet med RNase R. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: CircRNA-gjenkjenning ved hjelp av varierende mengde inn data RNA. Ved hjelp av RNA Hentet fra MG, occipital cortex (OC), og overlegen frontal gyrus (SF), så vel som UC RNA, antall unike circRNAs oppdaget ved bruk av 1, 2 og 4 mikrogram inn data RNA, ble hver hvis bibliotek ble bygget ved hjelp av TruSeq Kit og RNase R forbehandling, sammenlignet. Normalisert antall circRNAs oppdaget (Y-aksen) ble beregnet på samme måte som figur 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: CircRNA deteksjon i hjernen kontra andre typer vev. CircRNA beriket datasett ved hjelp av RNA Hentet fra ulike hjerneområder, inkludert lillehjernen (BC), mindreverdig parietal flik (IP), MG, OC, og SF, samt fire andre vevstyper, inkludert lever (LV), lunge (LU), lymfeknuter (LN), og bukspyttkjertel (PA) ble generert. CircRNA berikelse ble utført ved hjelp av Illumina TruSeq-settet med RNase R forbehandling og 4 μg av total input RNA. Box tomter representerer antall circRNAs oppdaget av minst tre av de seks verktøyene på tvers av prøvene fra hver hjerne region/vev type. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Test # | Parameter evaluert | Test forhold | Eksempel kilde | Input beløp/betingelser/prøver testet | Totalt antall leste sekvensering |
| 1 | Forberedelses sett for bibliotek | Illumina TruSeq strandet total RNA vs Roche kapa totalt RNA kits | Uc | TruSeq: 1 μg | 46128, 8, 91 |
| TruSeq: 2 μg | 7, 93, 90202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 12238, 6, 66 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7, 88, 56902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 06874, 6, 61 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 34954, 10, 62 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 11, 00, 68504 | ||||
| 2 | Pre-behandling | RNase R pre-behandlet kontra ikke pre-behandlet | Mg | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 09934, 10, 76 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11, 13, 14114 | ||||
| 3 | Total RNA-inngang | 1 μg vs. 2 μg vs. 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 94758, 12, 00 |
| MG: 2 μg | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 μg | 12, 13, 15232 | ||||
| OC: 1 μg | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 μg | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 μg | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 μg | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 μg | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 μg | 12, 33, 31474 | ||||
| UC: 1 μg | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 μg | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 μg | 12, 56, 92534 | ||||
| 4 | Vevstyper | Brain regioner kontra andre typer vev | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 08904, 10, 72 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 11, 35, 95746 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 09934, 10, 76 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 21824, 8, 76 | ||||
| SF_2 | 14, 50, 57894 | ||||
| SF_3 | 52030, 11, 01 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 30187, 8, 33 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 38278, 10, 78 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 16880, 10, 54 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 7, 82, 36741 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
Tabell 1: Sammendrag av prøve-og testbetingelser. Sammendrag av alle parametere og test vilkår evaluert i denne studien, sammen med det totale antallet sekvensering leser generert for hver prøve. UC = universell kontroll, MG = middels Temporal gyrus, OC = occipital cortex, BC = lillehjernen, IP = dårligere parietal flik, SF = overlegen frontal gyrus, LU = lunge, LV = lever, LN = lymfe node, PA = bukspyttkjertel, RNase R = ribonuklease R, RNase R + = pre-behandlet med RNase R, RNase R-= ikke pre-behandlet med RNase R.
| Eksempel kilde | Input beløp/prøver testet | Prosent rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 μg | 5,53 prosent |
| TruSeq: 2 μg | 4,11 prosent | |
| TruSeq: 4 μg | 4,38 prosent | |
| TruSeq: 5 μg | 3,21 prosent | |
| TruSeq: 10 μg | 3,74 prosent | |
| Kapa: 1 μg | 5,57 prosent | |
| Kapa: 2 μg | 4,56 prosent | |
| Kapa: 4 μg | 9,67 prosent | |
| Kapa: 5 μg | 12,69 prosent | |
| Kapa: 10 μg | 15,59 prosent |
Tabell 2: rRNA prosenter i TruSeq vs. kapa biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien, to kommersielt tilgjengelige bibliotek forberedelse kits, pre-behandling alternativer, og innspill RNA beløpene ble testet for å optimalisere en circRNA berikelse protokoll for bygging av circRNA sekvensering biblioteker. Basert på vurderingen til denne studien, er en rekke viktige aspekter og kritiske trinn for å opprette circRNA sekvensering biblioteker åpenbare. Vår evaluering bekrefter nytten av RNase R pre-behandling, som gjenspeiles av det økte antallet circRNAs oppdaget. Generelt sett ble det observert et høyere mangfold av circRNAs ved bruk av Illumina TruSeq bibliotek sett med RNase R forbehandling og 4 mikrogram inn data RNA. Disse resultatene samsvarer med tidligere funn at RNase R berikelse trinnet er gunstig for påvisning av circRNAs2.
Ytterligere viktige aspekter ved circRNA bibliotek konstruksjon omfatter mengden av total RNA som er tilgjengelig for sekvensering samt type vev som RNA Hentet fra. Selv om en 4 μg-inngang av total RNA ble funnet å gi det høyeste antallet oppdagede circRNAs, utnytter flertallet av RNAseq-studiene < = 1 μg av total RNA, slik at det kan være utfordrende å oppnå høyere beløp, spesielt for analyse av humane prøver. Identifisering av circRNAs er fortsatt gjennomførbart for lavere input beløp, men det er relevant å erkjenne at spesifisitet av analysen kan bli påvirket. Denne studien fremhever ytterligere det høyeste antallet circRNAs som oppdages i menneskets hjerne sammenlignet med andre vev, som tidligere rapportert19,20. Det er derfor avgjørende å erkjenne differensial uttrykk for circRNAs på tvers av ulike typer vev. Videre vil ytterligere forskning i sammenheng med sykdommen være viktig for shedding lys inn i hvordan circRNAs kan være involvert i patogene prosesser.
Resultatene av de to vurderte RNA biblioteket forberedelse kits også fremhever at selv om ulike kommersielt tilgjengelige kits kan demonstrere betydelige likheter, forskjellene er fortsatt observert når analysere circRNAs. To store funn fra denne sammenligningen inkluderer redusert rRNA-nedbryting og et lavere antall circRNAs identifisert ved hjelp av en tilnærming. Mens en mulighet er at en høyere overflod av rRNA i en prøve kan forstyrre skape sekvens-stand circRNA biblioteket molekyler, understreker dette funn behovet for å vurdere tilsynelatende lignende kits, spesielt når reagenser er proprietære.
Selv om dataene som presenteres her gir innsikt i eksistensen og overflod av circRNAs i ulike typer vev, har denne studien noen tekniske begrensninger. For det første, mens RNase R behandling reduserer befolkningen i lineære RNAs i en prøve, er det ikke godt forstått Hvis dette nedbryting trinn introduserer noen fordommer i circRNA deteksjon og om det kan tømme circRNAs. Tidligere studier har rapportert at i noen tilfeller, circRNAs er følsomme for RNase R2,24,25. For det andre er det uklart om det å øke den totale RNA-inngangen over 4 μg vil resultere i en lineær økning i Antall identifiserte circRNAs. Som tidligere nevnt, er tilgjengelig total RNA ofte begrenset i forskningsstudier så lavere input beløp ble vurdert her. Av notatet, circRNAs kan fortsatt oppdages ved bruk av lavere innganger, men det er viktig å erkjenne at lavere innganger er forbundet med påvisning av et lavere antall circRNAs. For det tredje, den optimaliserte protokollen som presenteres her utnytter RNAs Hentet fra et bestemt sett med vev. Gitt variabel fordeling av circRNA-uttrykk på tvers av ulike vevstyper, kan tilknytningen mellom total RNA-inndata og Antall identifiserte circRNAs variere på tvers av vev.
Med økende interesser i å forstå den biologiske rolle circRNAs, nye strategier er også utviklet for å bedre muliggjøre karakterisering og identifisering av circRNAs. En ny bioinformatikk tilnærming muliggjør identifisering av circRNAs som kan være ydmyk uttrykt gjennom rekonstruksjon av full lengde circRNAs, og muliggjør også kvantifisering av uttrykk for spesifikke circRNA isoformene26. Denne tilnærmingen utnytter funksjoner beskrevet som omvendt overlapping (RO) leser som kan oppstå på 3 ' eller 5 ' endene av circRNA biblioteket molekyler. Utvikling av nye strategier for å identifisere circRNAs, som omfatter både laboratorie tilnærminger og Bioinformatikk verktøy, vil bidra til feltets forståelse av funksjonen og virkningen av circRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for banner Søn Health Research Institute Brain and Body donasjon program (BBDP) av Sun City, Arizona for levering av menneskelige hjernevev. Den BBDP har blitt støttet av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (U24 NS072026 National Brain og vev Resource for Parkinsons sykdom og relaterte lidelser), National Institute on aging (P30AG19610 Arizona Alzheimers sykdom Core Center), Arizona Department of Health Services (kontrakt 211002, Arizona Alzheimers Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (kontrakter 4001, 0011, 05-901 og 1001 til Arizona Parkinson ' s Disease Consortium) og Michael J. Fox Foundation for Parkinsons forskning27. Denne studien ble også støttet av DHS og staten Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). Vi takker også Andrea Schmitt (banner Research) og Cynthia Lechuga (TGen) for Administrativ støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
