Summary
항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.
Abstract
광학 클리어링 기술은 후속 3차원(3차원) 이미징을 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화하여 조직을 투명하게 만듭니다. 그(것)들은 거시적인 거리를 통해 확장하는 현미경 다세포 구조물을 분석하는 잠재력을 위한 모든 연구 지역에 있는 큰 관심을 받았습니다. 신장 tubules, 혈관, 신경 및 사구체가 많은 방향으로 확장한다는 것을 감안할 때, 지금까지 전통적인 2 차원 기술에 의해 부분적으로 포착된, 조직 정리는 또한 신장 연구의 많은 새로운 지역을 열었습니다. 광학 클리어링 방법의 목록은 빠르게 성장하고 있지만,이 분야의 초보자가 주어진 연구 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에 제공된 두꺼운 마우스 신장 슬라이스의 항체 라벨링을 결합하는 간단한 방법이 있다; 저렴하고 무독성이며 즉시 사용할 수있는 화학 물질 인 에틸 시나 메이트 (ethyl cinnamate)가있는 광학 클리어링; 및 공초점 이미징. 이 프로토콜은 신장을 침투시키고 항원 회수 단계를 사용하여 항체-결합을 증가시키는 방법을 전문 장비를 필요로 하지 않고 설명한다. 그것의 응용은 신장 내의 다른 다세포 구조물을 화상 진찰에서 제출되고, 조직에 나쁜 항체 침투를 해결하는 방법은 해결됩니다. 우리는 또한 내인성 형광을 화상 진찰의 잠재적인 어려움및 아주 큰 견본을 취득하고 그(것)들을 극복하는 방법 토론합니다. 이 간단한 프로토콜은 3차원으로 조직을 연구할 수 있는 설치가 간편하고 포괄적인 도구를 제공합니다.
Introduction
전체 기관 또는 큰 다세포 구조를 공부에 대한 관심이 증가함에 따라 투명 조직의 이미징을 3차원으로 포함하는 광학 클리어링 방법의 개발이 이해지고 있습니다. 최근까지, 전체 구조의 세포 수, 길이 또는 부피를 추정하는 가장 좋은 방법은 2 차원 1에서 후속 분석을위한 조직의 전신샘플링을 기반으로 하는 입체학 또는 철저한 직렬 단면입니다. 2개 , 3. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리며 높은 수준의 교육 및 전문 지식이 필요합니다4. 광학 클리어링 방법은3D 이미징5,6,7에대한 조직을 반투명하게 만들기 위해 샘플 전체에 걸쳐 굴절률을 평형화함으로써 이러한 문제를 극복한다.
용매 기반 및 수성 기반 방법의 두 가지 주요 범주로 속하는 몇 가지 광학 청산 방법이 개발되었습니다. 수성 기반 방법은 더 간단한 침수 8,9,과수10,11,및 하이드로겔 포함12,13으로나눌 수 있다. 용매 기반 방법은 조직을 탈수시키고, 지질을 제거하고, 굴절률을 약 1.55값으로 정상화한다. 대부분의 용매 기반 방법의 한계는 GFP, 용매 독성, 일부 이미징 챔버 또는 객관적렌즈에 사용되는 접착제를 용해하는 능력, 그리고 동안 조직의 수축과 같은 일반적으로 사용되는 리포터 단백질의 내인성 형광의 담금질입니다. 탈수14,15,16,17,18,19,20,21. 그러나, 용매 기반 방법은 간단하고 시간 효율적이며 다양한 조직 유형에서 작동할 수 있다.
수성 기반 방법은 1.38-1.528,11,12,22,23,24 범위의 굴절 지수가있는 수성 용액에 조직의 침지에 의존합니다. . 이러한 방법은 내인성 형광 리포터 단백질 방출을 보존하고 탈수 유발 수축을 방지하기 위해 개발되었지만, 대부분의 수성 계 청산 방법의 한계는 프로토콜의 더 긴 지속 기간, 조직 확장, 및 단백질 변형 (즉, ScaleA2와 같은 과수성 프로토콜에서 요소로 단백질의 부분 변성) 7,11,23,25. ScaleS는 요소-유도 조직 확장을 탈수시킴으로써 균형을 이룬 소르비톨과 우레아를 결합하여 조직 확장을 해결하고, 전자 현미경 검사법10에의해 평가된 바와 같이 조직 초구조를 보존하였다. 조직 수축 또는 확장은 구조물의 절대 크기, 물체 사이의 거리 또는 부피당 세포 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 조직의 정리 시 크기 변화의 측정은 얻어진결과 7,26을해석하는 데 도움이 될 수 있다.
일반적으로 광학 클리어링을 위한 프로토콜은 전처리, 투과, 면역 라벨링(필요한 경우), 굴절률 매칭 및 고급 광 현미경(예: 2광자, 공초점 또는 광시트 형광 현미경 검사법). 대부분의 클리어링 접근법은 신경 조직을 시각화하기 위해 개발되었으며, 새로운 연구는 다른장기에서 의 응용 프로그램을 검증했습니다 5. 이 포괄적인 도구는 사구체27,28,면역 침투28, 혈관 구조28,및 수관 분절을 포함하여 신장 구조의 안정적이고 효율적인 분석을 허용하는 것으로 이전에 입증되었습니다. 29,그것은 건강과 질병에 사구 기능 및 tubule 리모델링의 이해를 더 나은 이상적인 접근이다.
여기서 요약하면 신장 관의 면역 염색을 결합하는 용매 기반 방법이다. 저렴하고 무독성이며 즉시 사용이 간 화학 물질인 에틸 시나메이트(ECi)가 있는 광학 클리어링; 완전한 수화 시각화 및 정량화를 허용하는 공초점 현미경 이미징. 이 방법은 간단하고, 신장 슬라이스의 항원 회수와 상업용 항체의 얼룩을 결합하며, 대부분의 실험실에서 접근 할 수있는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.
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Protocol
참고: 여기에 설명된 모든 실험 절차는 미국 오리건 주 포틀랜드 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 독일 아헨의 관련 지방 당국에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 신장의 역행 복부 대동맥 관류 및 고정
- 전날 또는 저녁에 솔루션을 준비하고 밤새 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 실온(RT)에 따뜻한 용액을 사용하십시오.
-
1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 신선한 배치를 확인합니다. 마우스당 약 50-100 mL PFA가 필요합니다.
- 3% PFA의 1 L을 만들려면: PFA 30g의 무게를 측정하고 연기 후드에 증류수 800 mL을 추가하십시오. 저어서 50-60°C로 가열합니다. 70 °C 이상으로 가열하지 마십시오.
주의: PFA는 독성이 있습니다. 연기 후드에 PFA를 준비합니다. - 천천히 2N NaOH의 여러 방울을 추가합니다. PFA가 용액에 들어갈 때까지 몇 분 정도 기다리거나 몇 방울을 더 추가하십시오. 일부 작은 덩어리는 용해되지 않습니다.
- 용액을 열에서 제거합니다. 20x PBS의 50mL를 추가합니다. RT에 얼음에 진정.
- HCl을 사용하여 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.
- 0.22 μm 필터로 1x PBS 및 3% PFA를 필터링하여 용해되지 않은 입자를 제거합니다.
- 3% PFA의 1 L을 만들려면: PFA 30g의 무게를 측정하고 연기 후드에 증류수 800 mL을 추가하십시오. 저어서 50-60°C로 가열합니다. 70 °C 이상으로 가열하지 마십시오.
- 1x PBS의 1L에 헤파린 1,000유닛을 추가합니다. 헤파린을 함유한 1x PBS와 1x PBS에 3% PFA를 별도의 50 mL 플라스틱 주사기로 옮김.
참고: 가능한 경우, 80-100 mmHg 또는 정수압 (드립 방법, 관류 용액의 높이 : 동물 위의 160-200cm)에서 설정 된 압력 제어 펌프는 신장 관류에 사용할 수 있습니다. - PBS, PFA 및 무딘 21G 나비 바늘을 3방향 스톱콕에 연결합니다. 시스템에 기포가 없는지 확인합니다.
- 15 mL 원엽 튜브에 라벨을 부착하고 10 mL의 PFA를 분배합니다.
- 남성 또는 여성 C57BL/6 마우스 12-24주를 사용하여 120 mg/kg의 체중 케타민과 16 mg/kg 체중자일라진을 심층으로 마취시면 됩니다. 동물은 수술을 진행하기 전에 반사 신경을 꼬집어 반응성의 완전한 부재를 확인해야합니다 (예를 들어, 발가락 핀치 반사).
- 동물이 마취의 외과 비행기에 도달하면 해부 현미경 아래에 뒷면에 놓습니다. 수술 가위를 사용하여 중간 선 복부 절개를 사용하여 복부를 외과적으로 열고 복부 대장을 노출시다.
- 구부러진 지혈로 장골 동맥에 분기 바로 위의 복부 대동맥을 고정합니다. 그런 다음 신장 동맥 바로 아래에 복부 대동맥을 미세 한 세련 미로 고정합니다. 바나가가있는 두 클램프 사이의 복부 대장에 작은 절개 (1mm)를 만듭니다. 나비 바늘을 천천히 절개에 넣고 복부 대장이 열리지 않도록주의하십시오.
- 5-0 실크 봉합사로 오른쪽 신장 동맥을 리게이트하고 관류및 고정을 위해 하나의 신장이 필요한 경우 다른 분석을 위해 오른쪽 신장을 제거하십시오.
- 마이크로 세정제를 제거하고, 바나가위로 문맥을 변환하고, 헤파린을 함유한 PBS 50 mL로 즉시 정성한 다음, 3% PFA의 50 mL로 전환하고 퍼퓨징한다.
참고: 복부 대류를 통해 높은 관류 압력은 조직을 통해 더 나은 항체 확산을 위해 신장 관을 열 것을 요구됩니다. 심장을 통한 관류는 신장 관을 열지 않을 수 있습니다. - 주의 깊게 공수 된 신장을 수집하고 조직을 뚫거나 압박하지 마십시오.
- 캡슐을 제거하고 신장을 1mm 두께의 관상 슬라이스로 자른다. 슬라이서 매트릭스(재료표)를사용하여 슬라이스 두께를 표준화합니다.
참고: 또는 진동을 사용하는 것이 좋습니다. - 표시된 15 mL 원엽 튜브에 준비된 PFA로 신장 슬라이스를 담급전시.
- 10 mL의 PFA를 다른 라벨이 붙은 15 mL 원엽 튜브에 분배하십시오. 다음 마우스로 이동하기 전에 PBS로 3방향 스톱콕과 나비 바늘을 플러시합니다.
- 빛으로부터 보호된 RT에서 밤새 사후 고정을 수행하십시오.
2. 조직 준비 및 면역 염색
- 고착 후, RT에서 수평 로커에 1시간 동안 1 x 세척 버퍼 (재료 표)로 신장 슬라이스를 두 번 씻으하십시오.
- 항원 검색을 수행합니다. 92-98 °C에 500 mL 비커에서 1x 항원 미모 스킹 솔루션 (재료의 T수)의300 mL을 가열합니다. 92-98°C에서 1시간 동안 교반하여 가열된 완충액에 투과가능한 카세트를 임베딩한 카세트를 둘러싸는다. 비커를 열에서 제거하고 RT로 식힙니다.
참고: 몇몇 공급 업체는 면역 조직 화학 응용을 위해 그들의 항체를 시험하고 데이터 시트에 제안된 항원 회수 방법을 포함할 것입니다. 따라서, 일부 에피토프는 보다 기본적인 버퍼(예를 들어, pH 9)를 요구할 수 있다. - 슬라이스를 0.1% 트리톤 X-100으로 1x 세척 버퍼의 10 mL로 옮기고 RT에서 밤새 바위를 2x로 씻어 신선한 1x 세척 버퍼 10 mL로 다음날 1 시간 동안 씻어 내보소입니다.
- 정상 항체 희석제의 500 μL에서 1 차항체를 희석한다(물질표). 1:50-1:100의 농도로 시작합니다. 37°C에서 4d동안 희석된 1차 항체로 신장 슬라이스를 부드럽게 흔들었다.
참고: 각 항체는 독특한 특성을 가지고 있기 때문에 항체의 항체 배양 및 희석 동안의 온도는 개별 프로브에 최적화되어야 합니다. 이차 항체 전용 대조군을 위해, 1 차적인 항체 없이 희석제로 신장 조직을 배양한다. 상업적 항체 희석제 대신에, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.01% 아지드 나트륨을 이용한 1x PBS를 사용할 수 있다. - 8시간 후에 세척 완충액을 한 번 변경하여 RT에서 밤새 1x 세척 완충액의 10 mL로 신장 슬라이스를 세척합니다.
- 정상 항체 희석제의 500 μL에서 이차 항체(예를 들어, 알렉사 플루오르-컨쥬게이트 이차 항체에 대해 1:100)를 희석한다. 37°C에서 4일 동안 희석된 이차 항체에 신장 슬라이스를 배양한다. 이 단계부터 는 빛으로부터 신장 조각을 보호하십시오.
- 8시간 후에 세척 완충액을 한 번 변경하여 RT에서 밤새 10 mL의 1x 세척 버퍼로 신장 슬라이스를 씻습니다.
3. 조직 정리
- 신장 슬라이스를 5 mL의 고급 100%에탄올 (재료 표)으로 2 시간 동안 RT에서 부드러운 흔들림 (1 시간 후 신선한 에탄올로 한 번 변경). 이 단계는 조직 탈수용입니다.
참고: 고급 에탄올은 다음 단계에서 높은 조직 투명도를 달성하기 위해 요구된다. 메탄올 또는 테트라하이드로푸란은 탈지질 전위가 높은 대체 탈수 시약이다. - 하룻밤 동안 RT에서 부드럽게 흔들면서(2시간 후 신선한 ECi로 한 번 변경) ECi (재료 표)의 2 mL에 신장 슬라이스를 담급니다.
참고: ECi의 동결/융점은 6-8°C입니다. 따라서 샘플을 냉장고에 보관하지 마십시오. 적절한 환기 연기 후드에 침지하고 옷과 피부와 직접 접촉을 피하십시오 (ECi는 식품 의약품 안전청이 승인한 비독성 화합물이지만 강한 냄새가 납니다). 일반 Eppendorf 튜브 또는 유리 용기 (폴리스티렌 용기 없음)를 사용하십시오. - 조직 반투명은 ECi 침지 후에 그리고 신장 조각이 화상 진찰을 위해 준비될 때 달성될 수 있습니다.
4. 공초점 이미징 및 이미지 분석
참고: 이미징을 위해 굴절률 매칭 솔루션이 대물렌즈와 호환되는 한 다른 현미경 기술을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 반전된 공초점 현미경을 사용합니다.
- 600-1,000 μL의 ECi를 유리 바닥접시(재료 표)에 넣습니다.
참고: ECi는 플라스틱 접시를 용해하는 유기 용매이기 때문에 일반 세포 배양 접시의 사용을 피하십시오. 마찬가지로, ECi는 대목적 렌즈의 플라스틱 부품/절연 링을 공격할 수 있습니다. 호환 가능한 이미징접시(30) 및 자수제작 3D 프린팅챔버(28)의개요에 대한 적절한 보고서를 참조하십시오. - 반투명 신장 슬라이스를 접시에 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 유리 바닥쪽으로 가벼운 압력을 가하기 위해 신장 슬라이스에 둥근 덮개슬립을 놓습니다. ECi의 누출을 방지하기위해 파라핀 필름 (재료 표)으로 접시를 밀봉하십시오.
참고: 전체 장기 또는 몇 밀리미터 두께의 조직 슬라이스는 샘플에 대한 ECi 풀을 만들기 위해 조직 주위에 테두리 (치과 시멘트 또는 실리콘 탄성 중합체; 재료 표참조)를 필요로 할 수 있습니다. - 접시를 현미경 이미징 플랫폼에 놓습니다.
- 여러 z 스택을 가지고 바느질을 수행합니다. 5 μm의 z 단계 크기로 시작합니다.
참고: 매우 두꺼운 조직 조각 이나 장기의 이미징에 대 한 긴 작업 거리 (>5 mm) 그리고 높은 숫자 조리개 (>0.9) 목표를 사용 하 여 고려. 이미징 후, 조직을 에탄올로 다시 옮기고 0.02% 나트륨 아지드로 세척 완충제 또는 PBS에 보관하십시오. - 소프트웨어(재질 표)를 사용하여3D 렌더링을 사용하여 이미지를 분석합니다.
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Representative Results
신장은 43개의 다른 세포 모형31로이루어져 있는 복잡한 기관입니다. 이 세포의 대부분은 사구체및 tubules와 같은 큰 다세포 구조물을 형성하고, 그들의 기능은 서로 상호 작용에 높게 의존합니다. 고전적 2-D 조직학 기법은 부분적으로 이러한 큰 구조물을 포착하고 그대로구조(31)내에서 초점 변화를 놓칠 수 있다. 따라서 광학 클리어링 기술을 사용한 3D 분석은 건강과 질병에서 어떻게 기능하는지 이해하는 데 도움이 됩니다.
대부분의 용매 계 광학 클리어링 기술은 적어도 부분적으로 내인성 형광 리포터 단백질 신호를 담금질할 것이다. YFP 태그파브알부민의 담금질은 ECi로 탈수 및 광학클리어링 시 관찰되었다(그림 1). 그러나, 다른 강한 형광 단백질은 신호 담금질에 저항할 수 있고, pH를 기본 수준(pH 8-11)으로 조절하면 내인성 형광 단백질14,20,28,30을안정화시킬 수 있다. 또한 형광 단백질 방출 보존이 필요한 경우 수성 계 방법을 고려해야 합니다. 이 현재 보고서에서, 이러한 용매 계 청산 프로토콜이 항체 라벨링과 호환된다는 것이 입증된다; 비록, 그것은 조직의 깊은 면역 라벨링을 달성 하기 위해 도전 남아, 특히 신장 등 조밀 한 세포가 풍부한 장기에.
신장의 역행 복부 대동맥 관류는 혈액 세포를 제거하고 관을 열기 위해 수행하였다 (그림2A,B). 이 접근법은 자가형광을 감소시키고 항체 확산을 개선합니다. 항체 농도는 조직의 크기와 항원의 풍부에 달려 있습니다. 따라서, 피상적 신호는 불량한 항체 침투 또는 항체의 부족한 양중 어느 것과 관련이 있다(도3A, B, 또한 영화 1참조). 큰 견본 또는 극단적으로 풍부한 마커를 위해, 1-2 일 후에 항체의 항체 그리고 보충의 더 높은 농도가 요구될 수 있습니다. 관심있는 항원이 신장 혈관 구조에서 발현되는 경우, 항체의 혈관 내 전달을고려해야합니다 (도 3C). 그러나, 관 상피 세포의 정점 막에서 단백질을 표적으로 하는 항체는 분자 크기로 인한 사구 체 여과 장벽을 교차하지 않으며, 따라서 혈관 및사구체에서 비특이적 신호를 유발한다(도 3D).
이 프로토콜은 신장 슬라이스 또는 전체 신장에 적용될 수 있다(도4A,B). 항체 특이성을 시험하기 위해, 대조군만이 이차항체를 행하였다(도 4C). 조직은 특정 세포 집단을 검출하기 위해 항체로 표지될 수 있다(예를 들어, 증식 세포, 도 4D)또는 세그먼트 특이적 항체를 사용하여 전체 수화 세그먼트를 시각화할 수 있다(도4E). 더욱이, 다중 항체의 조합은 3-D에서 다른 단백질을 동국화할 수 있는 기회를 제공한다(예를 들어, 다른 자극에 대한 튜불 리모델링에서 발생하는 세그먼트 특이적 관 증식을 검출하기 위해) (그림4F,G; 또한 동영상2를 참조하십시오.
도 1: 내인성 형광 리포터 단백질 신호의 담금질. (A) 파브알부민YFP+형질전환 마우스로부터 유래된 내인성 형광 리포터 단백질은 5 μm의 얇은 PFA 고정 냉동 신장 섹션에서 검출가능하다. 화살표는 말단 복잡한 tubule의 초기 부분에 있는 몇몇 형광 표지된 parvalbumin+ 세포를 표시합니다. (B) 신장 조직의 광학 적 개간 후 명백한 형광 신호가 관찰되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신장 관류 품질의 평가. (A) 주기산 쉬프 (PAS)-스테인드 파라핀 내장 조직 (5 μm 얇은 섹션)은 약간 열린 루멘 (일반적으로 브러시 테두리를 가진 근위 부관; 화살표 참조)가있는 몇 개의 튜브를 보여줍니다. (B) 모든 부관은 좋은 신장 관류 후 열립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전체 마운트 면역 라벨링 문제 해결. (A,B) 두꺼운 신장 슬라이스는 헨레의 고리의 두꺼운 오름차순 사지에서 발현되는 염화나트륨 코트랜스포터-2(NKCC2)에 대하여 항체로 염색되었다. 신호는 조직의 표면에서 감지 할 수 있습니다 ((B)의 화살표). 그러나, 항체는 조직 내로 침투하지 않았다[화살촉(B)]]. (C) 혈관에서 발현되는 단백질을 표적화하는 혈관 내 항체 주사(예를 들어, CD31)는 빠르고 균일한 혈관 염색을 가능하게 한다. 강한 신호가있는 둥근 구조는 사구체입니다. (D) 그러나, 회골 에피테리아의 정점 막에서 발현되는 항체 표적화 단백질(예를 들어, 말단 결합 된 환구에서 발현되는 인산화 나트륨 - 염화물 cotransporter (phospho-NCC))은 사구체를 교차하지 않을 것이다. 여과 장벽, 따라서 혈관 구조에 비특이적 인 신호를 일으키는 (구심성 동맥 및 기타 혈관을 가리키는 화살촉 참조) 및 사구체 (화살표 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 면역표지된 신장 조직의 대표적인 결과. (A,B) 이 프로토콜은 전체 신장의 광학 적 지우기를 허용합니다. (C) 대표적인 z-스택은 이차 항체의 비특이적 결합의 부재를 사전 배양 없이 대조군으로 보여준다. (D) 대표적인 z-stack의 3-D 가시화는 신장 수질에서 증식하는 브로모데독시우리딘(BrdU)+ 세포를 나타낸다. (E) 수질 수집 덕트는 아쿠아포린-2(AQP2)에 대하여 항체를 사용하여 가시화된다. (F,G) AQP2+ 수질 수집 덕트 내 BrdU+ 세포의 분석 및 정량화. (F,G)의 경우 영화2를 참조하십시오. 이 수치는 사리타스 외29에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 (그림3관련): 헨레의 루프의 NKCC2+두꺼운 오름차순 사지의 3D 시각화. 이 영화는 광학적으로 제거된 신장 슬라이스에 있는 나쁜 항체 침투를 보여줍니다. 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 2(도 4와 관련): BrdU+세포 및 AQP2+수질 수집 덕트의 3-D 시각화는광학적으로 클리어된 신장 슬라이스에서. BrdU+ 세포 (빨간색) 및 AQP2+ 수질 수집 덕트 (녹색)가 도시됩니다. Imaris 스폿 및 표면 알고리즘은 BrdU+ 외부 (청록색 반점) 또는 내부 (분홍색 반점) AQP2+tubules (녹색 표면)를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 영화는 원래 사리타스등에서 나타났다. 29. 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
광학 클리어링 기술은 다양한 장기에서 미세 해부학의 3차원 시각화 및 정량화에 대해 폭넓은 관심을 받고 있습니다. 여기서, 용매계 클리어링 방법(ECi)을 신장 슬라이스에서 전체 튜블의 3차원 이미징을 위한 면역 라벨링과 결합하였다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 빠를 수 있습니다. 그러나 다른 연구 질문은 다른 클리어링 프로토콜5로 가장 잘 대답 할 수 있습니다. 또한 용매 기반 방법은 주로 탈수 단계14,18로인해 가변 각도에서 조직 수축을 일으킨다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 대부분의 용매계 방법(예를들어, ECi14)은또한 적어도 부분적으로 GFP 또는 tdTomato와 같은 기자들의 내인성 형광을 담금질; 따라서, FDISCO32,CLARITY12,또는 입방11은 대체 프로토콜로 작용할 수 있다. 그러나, ECi의 담금질 효과는 가변적이며 각 리포터마우스(28)의개별 구문에 따라 달라집니다. 또한, 1) GFP 및 다른 리포터에 대한 형광 항체 또는 2) 내인성 형광 신호를 보존하는 변형된 용매 기반 프로토콜(30,32)의 사용은 또한 이러한 맥락에서 대안적인 접근법일 수 있다. 여러 그룹이 용매 기반 클리어링 방법이 아직 테스트되지 않은 반면, RNA를 3D로 시각화하기 위해 수성 기반 프로토콜24,33,34의 호환성을 테스트했다는 점은 언급할 가치가 있습니다. 따라서, RNA 분석을 고려할 때 CLARITY33의 수정된 버전과 같은 수성 기반 클리어링 방법이 바람직해야 한다.
관심 있는 세포 또는 유전자 생성물은 내인성 형광 단백질 발현을 가진 형질전환 마우스를 사용하여 구상될 수 있습니다, 그러나 유전으로 조작된 마우스 선의 생성은 시간 소모적이고 비용이 많이 듭니다. 따라서, 항체 표지는 더 실용적이고 큰 조직의 면역 표지가 도전적이더라도, 더 많은 융통성을 제공합니다. 본래 의전(14)과는 대조적으로, 우리의 접근법은 항원 회수 단계를 사용하는 변형된 ECi 광학 클리어링 방법 및 면역 라벨링을 결합한다. 열-유도 항원-회수는 단백질을 변성시킬 수 있지만, PFA-고정(35) 동안 항원성의 손실을 회복하는 데 도움을 주며 항체 결합을 개선한다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 신장의 좋은 관류를 수행하는 것이 중요합니다. 적혈구를 함유하는 헤모글로빈은 이미징 깊이 7을 제한하고 개방 루멘을 가진 팽창된 관은 항체 침투를 강화한다. tubules의 개통은 또한 반대측에 그밖 apically 표현한 단백질에서 상피 상체 막에서 표현된 단백질의 더 나은 구별을 허용합니다. 그러나, 인위적으로 팽창된 관은 tubule 구조물에 부정적인 영향을 미치고 신장의 특정 병리생리학적 반응을 마스크할 수 있습니다 (예를 들면,부상당한 근위 수관의 팽창,) 그러나 건강한 tubules36의 아닙니다. 둘째, 4°C 또는 RT가 아닌 37°C에서 항체 배양을하여 항체 침투를 개선한다(27). 그러나, 각 항체는 독특한 특성을 갖는다; 따라서 항체 배양 중 온도는 개별 프로브에 최적화되어야 합니다. 셋째, Alexa Fluor-647(원적 스펙트럼) 이차 항체의 사용은 특히 신장이 청록 스펙트럼37에서다량의 자가형광을 방출하기 때문에 신호 대 잡음 비율을 증가시키는 데 도움이 된다.
혈관에서 발현되는 단백질에 대해 플루오로포폴레-컨쥬게이션된 항체를 가진신장(38)의 레트로 궤도 주사 또는 관류는 신장 혈관구조에 라벨을 붙이는 우아하고 빠른 방법이다. 그러나, tubules의 단점 막에 있는 단백질은 항체가 60-65 kDa의 범위에 있는 단백질의 여과를 위한 그것의 차단한 분자량으로 사구 체 여과 장벽을 교차할 수 없기 때문에 혈관 주입에 의해 접근할 수 없습니다 남아 있습니다. 따라서, 항체의 보존된 분자 인식 특성을 가진 작은 항체 단편 및 조립체 단편(~55 kDa), 디아바디(~50 kDa), 탠덤 scFv(~28 kDa) 또는 핵산 압타머(~6-30 kDa)와 같은 설계된 변이체를 사용하여 항체의 보존된 분자 인식 특성을 제공할 수 있다. 기회는 튜블38,39의정점 막에 액세스 할 수 있습니다. 또한, 작은 항체 단편과 전기장(40) 또는 압력(13) 또는 나트륨 도데실 황산나트륨(SDS) 기반의 클리어링 프로토콜을 조합하여 지질24, 41, 42를 제거한다. 조직의 빠르고 효율적인 항체 침투를 가능하게 할 수 있습니다.
여러 그룹은 클리어링 시약을 가진 관류가 프로토콜 시간을 감소시킬뿐만 아니라 조직 투명성을 증가시킨다는 것을 입증했다19,24,43,44. 따라서, 탈수 및 굴절 지수 매칭 솔루션으로 신장의 후속 관류와 복부 대동맥 또는 신장 동맥의 통조림은 더 나은 빠른 조직 정리를 달성하기 위해 고려되어야한다. 그러나, 우리는 시약을 지우기로 전체 신장을 정중하고 여러 가지 이유로 슬라이스 신장을 사용하지 않았습니다. 첫째, 다른 항원은 1개의 신장에서 다중 신장 조각의 항체 표지에 의해 구상될 수 있습니다. 둘째, 전체 신장에 비해 신장 슬라이스의 면역 라벨링을 수행하기 위해 더 적은 시간과 항체가 필요합니다. 셋째, 대형 샘플의 3D 이미징은 최대 몇 테라바이트의 데이터 세트를 생성하므로 대부분의 워크스테이션에서 관리하기가 어려울 수 있습니다. 따라서 조직 조각 이나 더 큰 파일의 하위 집합에서 데이터는 자동 계산 또는 거리 측정 등 복잡 한 작업을 수행 하는 것이 더 편리 합니다.
이 프로토콜에서는, 공초점 현미경 검사는 단세포 해결책을 가진 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 이용됩니다, 이는 공동 현지화 연구 결과에서 특히 관련있습니다. 그러나 공초점 이미징은 이미징 속도가 지워진 작은 조직에대해서만 실용적이기 때문에 레이저 스캐닝이 필요합니다. 긴 수관 세그먼트 또는 전체 장기와 같은 다세포 구조의 3 차원 형태 분석을 수행하려면 가벼운 시트 형광 현미경 (LSFM)과 같은 빠른 현미경 기술이 필요합니다. LSFM은 가장 높은 세포 해상도가 필수적이지 않을 때 빠른 이미징을 허용합니다. 예를 들어, 말단 결합 된 튜브의 길이는 최근 CLARITY12및 LSFM29에기초한 전체 마운트 면역 라벨링, 광학 클리어링을 결합하여 평가되었다. 안타깝게도 상용 LSFM은 비용이 많이 들고 용매 기반 클리어링 프로토콜과 항상 호환되지는 않습니다. 사실, CLARITY는 CLARITY에 맞게 사용자 정의 된 목표를 가진 우리의 특정 LSFM이 ECi29와호환되지 않았기 때문에이 연구를 위해 선택되었습니다. 그러나 클링버그 등은 ECi가 LSFM14와원칙적으로 호환된다는 것을 입증했습니다.
결론적으로, 간단한 ECi 기반 광학 클리어링 방법이 입증되어 ~ 100 μm에서 몇 밀리미터 두께에 이르는 고정 조직 조각을 사용하여 모든 연구 프로젝트에 적용할 수 있습니다. 또한 이전에 는 거의 철저한 완료 노력이 필요했던 실행 가능한 분석을 허용하고 형태학의 2차원 분석과 관련된 필요한 가정 및 추론을 제거합니다. 전체 마운트 면역 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경검사법의 조합은 건강과 질병의 세포 기능에 대한 이해를 증진하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
T. S.는 DFG 독일 연구 재단 (332853055), 엘스 크뢰너 - 프레세니우스 - 스티퉁 (2015_A197), RWTH 아헨의 의료 학부 (RWTH 반환 자 프로그램)의 보조금에 의해 지원됩니다. V. G. P. 도이치 Gesellschaft 모피 Nephrologie, 알렉산더 폰 훔볼트 재단, 그리고 호주의 국립 건강 및 의료 연구 위원회에서 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다. D. H. E는 레덕크 폰디에 의해 지원됩니다. R. K.는 DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), 노스리뉴스트팔리아 주(MIWF-NRW) 및 RWTH 아헨 대학교의 임상 연구를 위한 학제간 센터(O3-11)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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