Summary
Kombinationen af antistof mærkning, optisk clearing, og avanceret lys mikroskopi tillader tredimensionel analyse af komplette strukturer eller organer. Beskrevet her er en simpel metode til at kombinere immunolabeling af tykke nyre skiver, optisk clearing med ethyl cinnamat, og confokale Imaging, der muliggør visualisering og kvantificering af tredimensionelle nyre strukturer.
Abstract
Optiske clearing teknikker gør vævet gennemsigtigt ved at ækvibrere brydningsindekset i en prøve for efterfølgende tredimensionelle (3-D) billeddannelse. De har fået stor opmærksomhed på alle forskningsområder for potentialet til at analysere mikroskopiske flercellede strukturer, der strækker sig over makroskopiske afstande. I betragtning af at nyre tubuler, vasculature, nerver, og glomeruli strækker sig i mange retninger, som kun er delvist fanget af traditionelle to-dimensionelle teknikker indtil videre, vævs rydning også åbnet mange nye områder af nyre forskning. Listen over optiske clearing metoder er hastigt voksende, men det er stadig vanskeligt for begyndere på dette område til at vælge den bedste metode til en given forskning spørgsmål. Forudsat her er en simpel metode, der kombinerer antistof mærkning af tykke mus nyre skiver; optisk clearing med billige, ikke-giftige og klar-til-brug kemisk ethyl cinnamat; og konfokal billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan man kan perfuse nyrerne og bruge et antigen-hentning skridt til at øge antistof-binding uden at kræve specialiseret udstyr. Dens anvendelse præsenteres i Imaging forskellige flercellede strukturer i nyrerne, og hvordan man foretager fejlfinding af dårlig antistof penetration i væv er rettet. Vi diskuterer også de potentielle vanskeligheder ved Imaging endogene fluorophorer og erhverve meget store prøver og hvordan man overvinde dem. Denne enkle protokol giver en nem at setup og omfattende værktøj til at studere væv i tre dimensioner.
Introduction
Den stigende interesse i at studere hele organer eller store flercellede strukturer har ført til udviklingen af optiske clearing metoder, der involverer billeddannelse af gennemsigtigt væv i tre dimensioner. Indtil for nylig har de bedste metoder til at anslå celle nummer, længde eller volumen af hele strukturer været Stereologi eller udtømmende seriel skæring, som er baseret på den systemiske prøvetagning af væv til efterfølgende analyse i to dimensioner1, 2 , 3. disse metoder er imidlertid tidskrævende og har brug for en høj grad af uddannelse og ekspertise4. Optiske clearing metoder overvinder disse problemer ved at udligne brydningsindekset i en prøve for at gøre vævs gennemskinnelige for 3-D-billeddannelse5,6,7.
Der er udviklet flere optiske clearing metoder, som falder i to hovedkategorier: opløsningsmiddel baserede og vandige baserede metoder. Vandige-baserede metoder kan yderligere opdeles i simpel fordybelse8,9, hyperhydrering10,11, og hydrogel indlejring12,13. Opløsningsmiddelbaserede metoder dehydrere vævet, fjerne lipider og normalisere brydningsindekset til en værdi omkring 1,55. Begrænsninger af de fleste opløsningsmidler baserede metoder er dæmpning af endogene fluorescens af almindeligt anvendte reporter proteiner såsom GFP, solvent toksicitet, evne til at opløse lim, der anvendes i nogle billed kamre eller objektiv linser, og svind af væv under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Men, solvent-baserede metoder er enkle, tidsbesparende, og kan arbejde i en række forskellige vævstyper.
Vandige-baserede metoder er afhængige af nedsænkning af vævet i vandige opløsninger, der har brydningsindeks i intervallet 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Disse metoder blev udviklet for at bevare endogene fluorescerende reporter protein emission og forhindre dehydrering-induceret svind, men begrænsninger af de fleste vandig-baserede clearing metoder omfatter en længere varighed af protokollen, væv ekspansion, og protein modifikation (dvs. delvis denaturering af proteiner af urinstof i hyperhydrerende protokoller som SCALea2)7,11,23,25. SCALeS behandlede vævs ekspansion ved at kombinere urinstof med sorbitol, som modvirker ved dehydrering af urinstof-induceret vævs ekspansion og bevarede vævs ultrastrukturen som evalueret af elektronmikroskopi10. Vævs svind eller ekspansion påvirker de absolutte størrelser af strukturer, afstande mellem objekter eller celletæthed pr. volumen; således kan målingen af størrelsesændringer ved rydning af vævet hjælpe med at fortolke de opnåede resultater7,26.
Generelt består en protokol for optisk clearing af flere trin, herunder forbehandling, permeabilisering, immunolabeling (hvis påkrævet), brydningsindeks matchning og billeddannelse med avanceret lymikroskopi (f. eks. to-foton, confocal eller lysplade Fluorescens mikroskopi). De fleste af de clearing tilgange er blevet udviklet til at visualisere neuronal væv, og nye undersøgelser har valideret deres anvendelse i andre organer5. Dette omfattende værktøj er tidligere blevet påvist at tillade pålidelig og effektiv analyse af nyre strukturer, herunder glomeruli27,28, immun infiltrater28, Vaskulaturen28, og tubulus segmenter 29, og det er en ideel tilgang til bedre forståelse af glomerulær funktion og tubulus remodeling i sundhed og sygdom.
Opsummeret her er en solvent-baseret metode, der kombinerer immun farvning af nyre tubuler; optisk clearing med billige, ikke-giftige, og klar-til-brug kemisk ethyl cinnamat (ECi); og konfokal mikroskopi Imaging, der tillader komplet tubulær visualisering og kvantificering. Denne metode er enkel, kombinerer antigen-hentning af nyre skiver med farvning af kommercielle antistoffer, og kræver ikke specialiseret udstyr, hvilket gør det tilgængeligt for de fleste laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA og de relevante lokale myndigheder i Aachen, Tyskland.
1. retrograde abdominal aorta perfusion og fiksering af muse nyrer
- Forbered løsninger samme dag eller aften før og opbevar i et køleskab natten over. Varmeløsninger til stuetemperatur (RT) før brug.
-
Der fremstiller et nyt parti af 3% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS). Der kræves ca. 50-100 mL PFA pr. mus.
- For at gøre 1 L af 3% PFA: vejer 30 g PFA og tilsæt 800 mL destilleret vand i røgudemhætten. Rør og Opvarm til 50-60 °C. Opvarm ikke over 70 °C.
Forsigtig: PFA er giftig. Forbered PFA i røghætten. - Tilsæt langsomt flere dråber 2N NaOH. Vent et par minutter, indtil PFA går ind i løsningen eller tilføje et par flere dråber. Nogle små klumper vil ikke opløses.
- Fjern opløsningen fra varmen. Tilsæt 50 mL 20x PBS. Chill på is til RT.
- Juster pH-værdien til 7,3-7,4 med HCl. Tilsæt destilleret vand til 1 L.
- Fjern eventuelle uopløste partikler ved at filtrere 1x PBS og 3% PFA med 0,22 μm filter.
- For at gøre 1 L af 3% PFA: vejer 30 g PFA og tilsæt 800 mL destilleret vand i røgudemhætten. Rør og Opvarm til 50-60 °C. Opvarm ikke over 70 °C.
- Tilsæt 1.000 enheder heparin til 1 L 1x PBS. Overfør 1x PBS indeholdende heparin og 3% PFA i 1x PBS i separate 50 mL plastik sprøjter.
Bemærk: Hvis det er muligt, kan den trykregulerede pumpe indstillet til 80-100 mmHg eller hydrostatisk tryk (dryp metode, højden af perfusions opløsninger: 160-200 cm over dyret) anvendes til nyre perfusion. - Tilslut PBS, PFA og en afrundede 21 G Butterfly Needle til en tre-vejs stopcock. Sørg for, at der ikke er luftbobler i hele systemet.
- Etiketten et 15 mL konisk rør og dispenserer 10 mL PFA i den.
- Dybt anæstetize en mandlig eller kvindelig C57BL/6 mus 12-24 uger af alder ved hjælp af 120 mg/kg legemsvægt ketamin og 16 mg/kg legemsvægt xylazine. Dyret skal kontrolleres for komplet fravær af reaktionsevne ved at klemme reflekserne, før du fortsætter til kirurgi (f. eks tå knivspids refleks).
- Når dyret har nået et kirurgisk plan af anæstesi, placere det på ryggen under den dissekere mikroskop. Kirurgisk åbning af maven med en midterlinje abdominal indsnit ved hjælp af en operativ saks og udsætte abdominal aorta.
- Klemme abdominal aorta lige over forgreningen til bækkenbens arterien med en buet hemostat. Derefter klemme abdominal aorta lige under de renale arterier med en mikro serraffinere. Lav et lille snit (1 mm) på abdominal aorta mellem de to klemmer med Vannas saks. Indsæt Butterfly nålen ind i snittet langsomt og pas på ikke at rippe abdominal aorta åben.
- Ligate den rigtige nyrearterie med en 5-0 silke sutur og fjerne den rigtige nyre til andre analyser, hvis kun én nyre er nødvendig for perfusion og fiksering.
- Fjern mikro serraffinere, transect Portal vene med Vannas saks, og straks perfuse med 50 mL PBS indeholdende heparin, derefter skifte og perfuse med 50 mL af 3% PFA.
Bemærk: Høj perfusions tryk gennem abdominal aorta er nødvendig for at åbne renal tubuli for bedre antistof diffusion gennem væv. Perfusion gennem hjertet kan ikke åbne renal tubuli. - Saml den perfulat nyre omhyggeligt og undgå punktering eller klemme vævet.
- Fjern kapslen og skær nyrerne i 1 mm tykke koronale skiver. Brug en udsnitsmatrix (tabel over materialer) til at standardisere udsnit tykkelse.
Bemærk: Alternativt kan du overveje at bruge en vibratome. - Nedsænk nyre skiver med den forberedte PFA i det mærkede 15 mL koniske rør.
- 10 mL PFA dispenserer til et andet mærket 15 mL konisk rør. Skyl trevejs stophanen og Butterfly Needle med PBS, før du flytter til den næste mus.
- Udfør efter fiksering natten over på RT beskyttet mod lys.
2. vævs forberedelse og immun farvning
- Efter fiksering, vask nyre skive to gange med 1x vask buffer (tabel over materialer) for 1 h på en horisontal ROCKER på rt.
- Udfør antigen hentning. Der opvarmes 300 mL 1x antigen-afmasknings opløsning (T istand af materialer) i et 500 ml bægerglas til 92-98 °c. Sæt skiven i indlejrings kassetten permeabel på den opvarmede buffer med omrøring i 1 time ved 92-98 °C. Fjern bægerglasset fra varmen, og lad det køle af til RT.
Bemærk: Nogle leverandører tester deres antistoffer for immun histokemi ansøgning og vil omfatte en foreslået antigen hentning metode i dataarket. Derfor kan nogle epitoper kræve en mere grundlæggende buffer (f. eks. pH 9). - Overfør udsnittet til 10 mL 1x vaskebuffer med 0,1% Triton X-100 og rock overnight at RT. vask udsnittene 2x med 10 mL frisk 1x vaskebuffer i 1 time den næste dag.
- Det primære antistof fortyndes i 500 μL normal antistof fortyndingsmiddel (tabel over materialer). Begynd med en koncentration på 1:50-1:100. Forsigtigt klippe nyre skive i fortyndet primære antistof for 4 d ved 37 °C.
Bemærk: Da hvert antistof har unikke egenskaber, skal temperaturen under antistof inkubation og fortyndinger af antistof optimeres for individuelle sonder. For sekundære antistof-kun kontrol, der inkuberes ved nyrevævet i fortyndingsmiddel uden primære antistof. I stedet for kommercielt antistof fortynder kan 1x PBS med 0,1% Triton X-100 og 0,01% natriumazid anvendes. - Nyre skiven vaskes i 10 mL 1x vaskebuffer natten over ved RT med én ændring af vaskebuffer efter 8 timer.
- De sekundære antistoffer fortyndes (f. eks. 1:100 for Alexa fluor-konjugeret sekundære antistoffer) i 500 μL normal antistoffortynde. Nyre skiver i fortyndet sekundært antistof i 4 dage ved 37 °C. Fra dette trin og fremefter, beskytte nyrerne skiver fra lys.
- Vask nyre skiver i 10 mL 1x vask buffer natten over ved RT med en ændring af vaskebuffer efter 8 h.
3. vævs rydning
- Overfør nyre skive til 5 mL af høj kvalitet 100% ethanol (tabel over materialer) for 2 h ved rt med blid Rocking (med en ændring til frisk ethanol efter 1 time). Dette trin er for vævs dehydrering.
Bemærk: Høj kvalitet ethanol er nødvendig for at opnå en høj vævs gennemskinnelighed i det næste trin. Methanol eller tetrahydrofuran er alternative dehydrering reagenser med høj delipidation potentiale. - Nedsænk nyre skive i 2 mL ECi (tabel over materialer) med blid Rocking på RT (med en ændring til frisk ECi efter 2 h) natten over.
Bemærk: Fast frysnings-/smeltepunktet for ECi er 6-8 °C. Opbevar derfor ikke prøverne i køleskab. Gennemføre fordybelse i en korrekt ventileret røg hætte og undgå direkte kontakt med tøj og hud (ECi er en ikke-giftige fødevare-og Drug Administration-godkendt sammensatte, men har en stærk lugt). Brug almindelige Eppendorf-rør eller glasbeholdere (ingen polystyren beholdere). - Vævs gennemskindet kan opnås efter ECi-nedsænkning, og når nyre skiverne er klar til billeddannelse.
4. ConfocalImaging og billedanalyse
Bemærk: Til billeddannelse kan andre mikroskopi teknikker anvendes, så længe brydningsindeks matchende løsning er kompatibel med objektivlinsen. Denne protokol anvender et inverteret Konfokal mikroskop.
- Tilsæt 600-1000 μL ECi i glasset bund skålen (tabel over materialer).
Bemærk: Undgå brug af almindelige cellekultur retter, fordi ECi er et organisk opløsningsmiddel, der vil opløse plastik retterne. På samme måde kan ECi angribe plastikdele/isolerings ringe på objektive linser. Se de relevante rapporter for en oversigt over kompatible billedbehandlings retter30 og selv lavede 3-D trykte kamre28. - Overfør den gennemsigtige nyre skive til skålen. Anbring en rund dækseddel på nyre skiven for at påføre let tryk mod glasbunden. Forsegl skålen med paraffin folie (tabel over materialer) for at undgå lækage af ECi.
Bemærk: Hele organer eller flere millimeter-tykke vævs skiver kan kræve en grænse (dental cement eller silikoneelastomer; Se tabel over materialer) rundt om vævet for at lave en ECi-pulje til prøven. - Placer skålen på mikroskop billedbehandlings platformen.
- Tag flere z-stakke og udføre syning. Start med en z-trins størrelse på 5 μm.
Bemærk: Overvej at bruge lange arbejdsafstande (> 5 mm) og høje numeriske blænde (> 0,9) mål for billeddannelse af meget tykke vævs skiver eller organer. Efter billeddannelse, overføres vævet tilbage til ethanol og opbevares i vaskebuffer eller PBS med 0,02% natriumazid. - Analysér billedet ved hjælp af 3-D-gengivelse med software (tabel over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyrerne er komplekse organer bestående af 43 forskellige celletyper31. De fleste af disse celler danner store flercellede strukturer som glomeruli og tubuler, og deres funktion er meget afhængig af interaktioner med hinanden. Klassiske 2-D histologiske teknikker delvist fange disse store strukturer og kan gå glip af fokale ændringer i intakt strukturer31. Således, 3-D analyse ved hjælp af optiske clearing teknikker hjælper med at forstå, hvordan de fungerer i sundhed og sygdom.
De fleste opløsningsmidler baseret optisk clearing teknikker vil i det mindste delvist slukke det endogene fluorescerende reporter protein signal. Bratkøling af YFP-mærket Parvalbumin blev observeret ved dehydrering og optisk clearing med ECi (figur 1). Andre stærke fluorescerende proteiner kan dog modstå signal dæmpning, og justering af ph til grundlæggende niveauer (pH 8-11) kan stabilisere endogene fluorescerende proteiner14,20,28,30. Desuden bør vandige-baserede metoder overvejes, hvis fluorescerende protein emission bevaring ønskes. I denne aktuelle rapport påvises det, at denne clea Rings protokol baseret på opløsningsmidler er kompatibel med antistof mærkning; selv om, det er fortsat udfordrende at opnå dyb immunolabeling af væv, især i et tæt celle-rige organ som nyrerne.
Retrograd abdominal aorta perfusion af nyrerne blev derefter udført for at fjerne blodlegemer og åbne tubuler (figur 2A, B). Denne fremgangsmåde nedsætter autofluorescens og forbedrer antistof diffusion. Antistofkoncentrationen afhænger af størrelsen af vævet og overflod af antigenet. Derfor kan det overfladiske signal relatere til enten dårlig antistof indtrængning eller utilstrækkelig mængde antistof (figur 3A, B, Se også film 1). For store prøver eller ekstremt rigelige markører kan der kræves højere koncentrationer af antistof og genopfyldning af antistof efter 1-2 dage. Hvis antigenet af interesse udtrykkes i nyre vaskulatur, skal intravaskulær levering af antistoffet overvejes (figur 3c). Antistoffer, som er rettet mod proteiner i den apiske membran af tubulære epitelceller, krydser imidlertid ikke den glomerulære filtrerings barriere på grund af molekyl størrelse, hvilket forårsager uspecifikke signaler i blodkar og glomeruli (figur 3D).
Denne protokol kan anvendes på nyre skiver eller hele nyrer (figur 4A, B). For at teste antistof specificitet blev kun kontrollerne underkastet sekundært antistof (figur 4c). Vævet kan mærkes med antistoffer for at detektere en bestemt cellepopulation (f. eks. prolifererende celler, figur 4d) eller for at visualisere hele tubulære segmenter ved hjælp af segmentspecifikke antistoffer (figur 4e). Desuden giver kombinationen af flere antistoffer mulighed for at colocalisere forskellige proteiner i 3-D (f. eks. til påvisning af segment specifik hyperplasi i tubulus, da det forekommer i tubulus Remodeling på forskellige stimuli) (figur 4F, g; Se også film 2).
Figur 1: dæmpning af endogene fluorescerende reporter protein signal. (A) den endogene fluorescerende reporter protein afledt af Parvalbuminyfp +Transgene mus er detekterbar i 5 μm tynde PFA-fastfrosne nyre sektioner. Pilene markerer nogle fluorescerende-mærkede parvalbumin+ celler placeret i den tidlige del af den distale indviklede tubule. (B) intet tydeligt fluorescerende signal efter den optiske clearing af nyrevævet observeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af nyre perfusions kvalitet. (A) periodisk syre SCHIFF (pas)-farvet paraffinindlejret væv (5 μm tynde sektioner) viser få tubuler med en let åbnet lumen (typisk proksimale tubuler, der besidder pensel kant; Se pile). (B) alle tubuler åbnes efter god nyre perfusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fejlfinding i forbindelse med immunolabeling af hele monterer. (A,B) En tyk nyre skive blev plettet med et antistof mod natriumchloridcotransporter-2 (NKCC2), som udtrykkes i den tykke stigende del af løkken af Henle. Signalet er detekterbart på overfladen af vævet (pile i (B)). Antistoffet trænger imidlertid ikke ind i vævet [Se pilespids i (B)]. C) intravaskulær antistof injektion, som er rettet mod proteiner, som udtrykkes i beholderne (f. eks. CD31), giver mulighed for hurtig og homogen farvning af blodkar. De runde strukturer med et stærkt signal er glomeruli. D) antistoffer, der er rettet mod proteiner, som udtrykkes i den apiske membran i tubulus epitel (f. eks. fosforyleret natriumchloridcotransporter (phospho-NCC), som udtrykkes i den distale, indviklede tubuli), vil ikke krydse den glomerulære filtrerings barriere, hvilket medfører uspecifikke signaler i Vaskulaturen (Se pilespids, som peger på afferent arterioler og andre beholdere) og glomeruli (Se pilene). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater af immunolabeled optisk clearet nyre væv. (A,B) Denne protokol tillader optisk clearing af hele nyrerne. C) en repræsentativ z-stak, der viser fravær af ikke-specifik binding af sekundært antistof som kontrol uden forudgående inkubation. (D) 3-D visualisering af en repræsentativ z-stack viser prolifererende bromodeoxyuridine (brdu)+ celler i nyre medulla. E) Medullary-opsamlings kanaler visualiseres ved hjælp af et antistof mod aquaporin-2 (AQP2). (F,G) Analyse og kvantificering af brdu+ celler inden for AQP2+ medullær opsamlings kanaler. For (F, G), se også Movie 2. Dette tal er blevet modificeret fra Saritas et al.29. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1 (relateret til figur 3): 3-D visualisering af NKCC2+tyk stigende lemmer af løkken af Henle. Filmen demonstrerer dårlig antistof penetration i en optisk ryddet nyre skive. Venligst klik her for at downloade videoen.
Movie 2 (relateret til figur 4): 3-D visualisering af brdu+celler og AQP2+medullær indsamling kanaler i en optisk ryddet nyre skive. Brdu+ celler (i rødt) og AQP2+ medullær opsamlings kanaler (med grønt) vises. Imaris spot og Surface algoritmer blev brugt til at bestemme BrdU+ celler udenfor (turkis pletter) eller inde (Pink PLETTER) AQP2+tubuler (grønne overflader). Denne film oprindeligt dukkede op i Saritas et al. 29. Klik venligst her for at downloade videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk clearing teknikker har fået stor opmærksomhed for 3-D visualisering og kvantificering af mikroanatomi i forskellige organer. Her blev opløsningsmiddel baseret clearing metode (ECi) kombineret med immunolabeling for 3-D billeddannelse af hele tubuler i nyre skiver. Denne metode er enkel, billig og hurtig. Andre forskningsspørgsmål kan dog bedst besvares med andre clearing protokoller5. Det er også vigtigt at huske på, at opløsningsmidler baseret metoder forårsage vævs svind i varierende grader, hovedsagelig på grund af dehydrering trin14,18. De fleste opløsningsmidler baserede metoder (f. eks. ECi14) også i det mindste delvis slukke endogene fluorescens af journalister som Gfp eller tdtomato; således kan FDISCO32, CLARITY12, eller cubic11 fungere som alternative protokoller. Men, den dæmper effekt af ECi er variabel og afhænger af individuelle konstruktioner af hver reporter mus28. Desuden kan anvendelse af 1) et fluorescerende antistof mod gfp og andre journalister eller 2) modificerede opløsningsmiddelbaserede protokoller, der bevarer endogene fluorescens signaler30,32 også være en alternativ tilgang i denne sammenhæng. Det er værd at nævne, at flere grupper har testet foreneligheden af vandig-baserede protokoller24,33,34 at visualisere RNA i 3-D, mens opløsningsmiddel-baserede clearing metoder er endnu ikke blevet afprøvet. Derfor bør vandige baserede clea Rings metoder såsom den modificerede version af CLARITY33 foretrækkes, når der tages hensyn til RNA-analyse.
Celler eller genprodukter af interesse kan visualiseres ved hjælp af Transgene mus med endogene fluorescerende protein udtryk, men genereringen af genetisk manipulerede muse linjer er tidskrævende og dyrt. Derfor, antistof mærkning er mere praktisk og giver mere fleksibilitet, selv om immunolabeling af store væv er udfordrende. I modsætning til den oprindelige ECi-protokol14kombinerer vores tilgang en modificeret optisk clea Rings metode for ECI og immunolabeling, som bruger et trin til hentning af antigen. Varme induceret antigen-hentning vil denaturere proteiner, men hjælper med at genvinde tab af antigenicitet under PFA-fiksering35 og forbedrer antistof-binding.
Der er nogle få kritiske trin i denne protokol. For det første er det vigtigt at udføre god perfusion af nyrerne. Hæmoglobin indeholdende røde blodlegemer begrænser billedbehandlings dybden7 og ekspanderede tubuler med åbent lumen øge antistof penetration. Åbningen af tubuler giver også mulighed for bedre at skelne proteiner, der udtrykkes i epitelial apikale-membranen, fra andre apically udtrykte proteiner på den kontralaterale side. Kunstigt ekspanderede tubuli kan dog have en negativ indflydelse på tubulær strukturen og maskens specifikke patofysiologiske respons (f. eks. dilatation af skadede proksimale tubuli), men ikke af raske tubuli36. Anden, antistofinkubation ved 37 °C i stedet for 4 °C eller RT forbedrer antistof penetrationen27. Men, hvert antistof har unikke egenskaber; således, temperatur under antistof inkubation skal optimeres for individuelle sonder. For det tredje hjælper brugen af Alexa fluor-647 (far-Red Spectrum) sekundære antistoffer med at øge signal-til-støj-forholdet, især da nyrerne udsender en stor mængde autofluorescens i det blå-grønne spektrum37.
Retro-orbital injektion14 eller perfusion af nyre38 med fluorophore-konjugeret antistoffer mod proteiner udtrykt i blodkar er en elegant og hurtig måde at mærke nyre Vaskulaturen. Imidlertid forbliver proteiner i den apiske membran af tubuler utilgængelige ved intravaskulær injektion, da antistoffer ikke kan krydse den glomerulære filtrerings barriere med dens afskærings molekylvægt til filtrering af proteiner i intervallet 60-65 kDa. Derfor kan brugen af små antistof fragmenter og konstruerede varianter såsom Fab fragmenter (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), tandem scFv (~ 28 kDa) eller nukleinsyre aptamers (~ 6-30 kDa) med bevarede molekylære genkendelses egenskaber af antistoffer give en mulighed for at få adgang til den apikale membran tubuli38,39. Desuden er kombinationen af små antistof fragmenter med elektriske felter40 eller tryk13 eller brugen af natriumdodecyl sulfat (SDS)-baserede clearing protokoller til fjernelse af lipiderne24,41,42 kan muliggøre hurtig og effektiv antistof penetration af væv.
Flere grupper påviste, at perfusion med clea Rings reagens ikke blot reducerer protokol tiden, men også øger vævs gennemsigtigheden19,24,43,44. Derfor bør kanylering af abdominal aorta eller nyrearterie med efterfølgende perfusion af nyrerne med dehydrerende og brydningsindeks matchende opløsninger overvejes for at opnå bedre og hurtigere vævs rydning. Men vi ikke perfuse hele nyrerne med clearing reagenser og brugte skiver nyrer af flere grunde. For det første kan forskellige antigener visualiseres ved antistof mærkning af flere nyre skiver fra en nyre. Anden, mindre tid og antistof er nødvendige for at udføre immunolabeling af en nyre skive sammenlignet med en hel nyre. For det tredje genererer 3-D-billeddannelse af store prøver datasæt op til flere terabyte, hvilket kan være udfordrende at administrere for de fleste arbejdsstationer. Derfor er data fra vævs udsnit eller undersæt af større filer mere bekvemme at udføre komplekse operationer, såsom automatiseret optælling eller afstandsmålinger.
I denne protokol anvendes Konfokal mikroskopi til at udføre billeddannelse med en enkelt celle opløsning, hvilket er særlig relevant i samlokaliserings undersøgelser. Men, konfokale Imaging kræver Laserscanning, da dens billeddannelse hastighed er kun praktisk for små stykker af ryddet væv. For at udføre 3-D morfometrisk analyse af flercellede strukturer såsom lange tubulære segmenter eller endda hele organer er det nødvendigt med hurtigere mikroskop teknikker såsom lysplade fluorescerende mikroskoper (LSFM). LSFM giver mulighed for hurtig billeddannelse, når den højeste celle opløsning ikke er essentiel. For eksempel blev længden af distale indviklede tubuler for nylig vurderet ved at kombinere hel-Mount immunolabeling, optisk clearing baseret på CLARITY12, og lsfm29. Desværre er kommerciel LSFM dyr og ikke altid kompatibel med opløsningsmidler baseret clearing protokoller. Faktisk blev klarhed valgt for denne undersøgelse, da vores særlige LSFM med et mål, som er tilpasset til klarhed, ikke var forenelig med ECi29. Klingberg et al. har imidlertid påvist, at ECi principielt er kompatibelt med LSFM14.
Afslutningsvis, en simpel ECi-baseret optisk clearing metode er påvist, som kan anvendes til ethvert forskningsprojekt ved hjælp af faste væv skiver spænder fra ~ 100 μm til flere millimeter i tykkelse. Det giver også mulighed for gennemførlige analyser, der tidligere krævede næsten udtømmende bestræbelser på at fuldføre, og eliminerer de nødvendige antagelser og slutninger forbundet med to-dimensionelle analyse af morfologi. Kombinationen af hele Mount immunolabeling, optisk clearing, og avanceret lys mikroskopi vil bidrage til at fremme forståelsen af cellulære funktion i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
T. S. støttes af tilskud fra DFG German Research Foundation (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) og det medicinske fakultet i RWTH Aachen (RWTH returner-programmet). V. G. P. støttes af forskningsstipendier fra Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, Alexander von Humboldt Foundation, og det nationale sundheds-og medicinsk Forskningsråd i Australien. D. H. E understøttes af Fondation LeDucq. R. K. støttes af tilskud fra DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) og det tværfaglige Center for klinisk forskning ved RWTH Aachen Universitet (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al.
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M.
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
