Summary
Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.
Abstract
Optische Clearing-Techniken machen Gewebe transparent, indem der Brechungsindex in einer Probe für die nachfolgende dreidimensionale (3-D) Bildgebung ausgeglichen wird. Sie haben in allen Forschungsbereichen große Aufmerksamkeit auf das Potenzial zur Analyse mikroskopischer mehrzelliger Strukturen erhalten, die sich über makroskopische Entfernungen erstrecken. Angesichts der Tatsache, dass sich Nierentubuli, Vaskulatur, Nerven und Glomeruli in viele Richtungen ausdehnen, die bisher nur teilweise durch traditionelle zweidimensionale Techniken erfasst wurden, eröffnete die Geweberäumung auch viele neue Bereiche der Nierenforschung. Die Liste der optischen Clearing-Methoden wächst schnell, aber es bleibt schwierig für Anfänger in diesem Bereich, die beste Methode für eine bestimmte Forschungsfrage zu wählen. Hier ist eine einfache Methode, die Antikörper-Etikettierung von dicken Maus Nierenscheiben kombiniert; optische Clearing mit billigem, ungiftigem und gebrauchsfertigem chemischen Ethyl-Cinnamat; und konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Nieren durchsetzt und einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet, um die Antikörperbindung zu erhöhen, ohne spezielle Geräte zu benötigen. Seine Anwendung wird in der Bildgebung verschiedener multizellulärer Strukturen innerhalb der Niere vorgestellt, und wie man schlechte Antikörper-Penetration in Gewebe zu beheben wird behandelt. Wir diskutieren auch die potenziellen Schwierigkeiten der Bildgebung endogene Fluorophore und den Erwerb sehr großer Proben und wie sie überwunden werden können. Dieses einfache Protokoll bietet ein einfach einzurichtendes und umfassendes Werkzeug, um Gewebe in drei Dimensionen zu untersuchen.
Introduction
Das wachsende Interesse an der Untersuchung ganzer Organe oder großer mehrzelliger Strukturen hat zur Entwicklung optischer Clearingmethoden geführt, die die Abbildung von transparentem Gewebe in drei Dimensionen beinhalten. Bis vor kurzem waren die besten Methoden zur Schätzung der Zellzahl, -länge oder des Volumens ganzer Strukturen die Stereologie oder die erschöpfende serielle Schnitte, die auf der systemischen Probenahme von Gewebe für die nachfolgende Analyse in zwei Dimensionen basiert1, 2 , 3. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwändig und benötigen ein hohes Maß an Ausbildung und Fachwissen4. Optische Clearing-Methoden überwinden diese Probleme, indem sie den Brechungsindex in einer Probe ausdematrieren, um Gewebe transluzent für die 3D-Bildgebung5,6,7zu machen.
Es wurden mehrere optische Clearing-Methoden entwickelt, die in zwei Hauptkategorien unterteilt sind: lösemittelbasierte und wässrige Methoden. Wässrige Methoden können weiter unterteilt werden in einfaches Eintauchen8,9, Hyperhydration10,11und Hydrogel einbetten12,13. Lösemittelbasierte Methoden dehydrieren das Gewebe, entfernen Lipide und normalisieren den Brechungsindex auf einen Wert um 1,55. Einschränkungen der meisten lösungsmittelbasierten Methoden sind das Abschrecken der endogenen Fluoreszenz von häufig verwendeten Reporterproteinen wie GFP, Lösungsmitteltoxizität, die Fähigkeit, Klebstoffe aufzulösen, die in einigen Bildkammern oder Objektivlinsen verwendet werden, und die Schrumpfung von Gewebe während der Austrocknung14,15,16,17,18,19,20,21. Lösemittelbasierte Methoden sind jedoch einfach, zeitsparend und können in einer Reihe von verschiedenen Gewebetypen funktionieren.
Wässrige Methoden basieren auf dem Eintauchen des Gewebes in wässrige Lösungen, die Brechungsindizes im Bereich von 1,38-1,528,11,12,22,23,24 haben . Diese Methoden wurden entwickelt, um die emission von endogenen fluoreszierenden Reportern zu erhalten und dehydrationsinduzierte Schrumpfung zu verhindern, aber die Einschränkungen der meisten wässrigen Clearingmethoden umfassen eine längere Dauer des Protokolls, Gewebeausdehnung und Proteinmodifikation (d.h. partielle Denaturierung von Proteinen durch Harnstoff in hyperhydrierenden Protokollen wie ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS adressierte Gewebeexpansion durch die Kombination von Harnstoff mit Sorbitol, das durch Dehydrierung die Harnstoff-induzierte Gewebeexpansion ausbalanciert und die Gewebe-Ultrastruktur, wie durch Elektronenmikroskopie ausgewertet10. Die Schrumpfung oder Ausdehnung von Gewebe wirkt sich auf die absoluten Größen von Strukturen, Abstände zwischen Objekten oder die Zelldichte pro Volumen aus. So kann die Messung von Größenänderungen bei der Reinigung des Gewebes helfen, die erhaltenen Ergebnisse7,26zu interpretieren.
Im Allgemeinen besteht ein Protokoll für optisches Clearing aus mehreren Schritten, einschließlich Vorbehandlung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung (falls erforderlich), Brechungsindex-Matching und Bildgebung mit fortgeschrittener Lichtmikroskopie (z. B. Zweiphotonen, konfokale oder Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie). Die meisten Clearing-Ansätze wurden entwickelt, um neuronales Gewebe zu visualisieren, und neue Studien haben ihre Anwendung in anderen Organen validiert5. Dieses umfassende Tool wurde zuvor gezeigt, um eine zuverlässige und effiziente Analyse von Nierenstrukturen zu ermöglichen, einschließlich Glomeruli27,28, Immuninfiltrate28, Vaskulatur28und Tubule Segmente 29, und es ist ein idealer Ansatz, um das Verständnis der glomerulären Funktion und Tubule Umbau in Gesundheit und Krankheit zu verbessern.
Zusammengefasst ist hier eine lösungsmittelbasierte Methode, die Immunfärbung von Nierentubuli kombiniert; optische Clearing mit billigen, ungiftigen und gebrauchsfertigen chemischen Ethyl-Cinnamate (ECi); und konfokale Mikroskopie-Bildgebung, die eine vollständige Tubule-Visualisierung und Quantifizierung ermöglicht. Diese Methode ist einfach, kombiniert Antigen-Retrieval von Nierenscheiben mit Färbung von kommerziellen Antikörpern, und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die es für die meisten Laboratorien zugänglich macht.
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Protocol
HINWEIS: Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, USA, und den zuständigen lokalen Behörden in Aachen, Deutschland, genehmigt.
1. Retrograde Abdominalaortische Perfusion und Fixierung von Mausnieren
- Bereiten Sie Lösungen am selben Tag oder Abend vor und lagern Sie in einem Kühlschrank über Nacht. Warme Lösungen auf Raumtemperatur (RT) vor der Verwendung.
-
Machen Sie eine frische Charge von 3% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Pro Maus werden ca. 50-100 ml PFA benötigt.
- Um 1 L von 3% PFA zu machen: Wiegen Sie 30 g PFA und fügen Sie 800 ml destilliertes Wasser in die Dunstabzugshaube. Auf 50-60 °C umrühren und erhitzen. Nicht über 70 °C erhitzen.
VORSICHT: PFA ist giftig. Bereiten Sie PFA in der Dunstabzugshaube vor. - Fügen Sie langsam mehrere Tropfen 2N NaOH hinzu. Warten Sie ein paar Minuten, bis PFA in die Lösung geht, oder fügen Sie ein paar tropfenweitere hinzu. Einige kleine Brocken lösen sich nicht auf.
- Entfernen Sie die Lösung von der Hitze. Fügen Sie 50 ml von 20x PBS hinzu. Chill auf Eis zu RT.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7.3-7.4 mit HCl ein. Destilliertes Wasser auf 1 L hinzufügen.
- Entfernen Sie alle ungelösten Partikel, indem Sie 1x PBS und 3% PFA mit 0,22 m Filter filtern.
- Um 1 L von 3% PFA zu machen: Wiegen Sie 30 g PFA und fügen Sie 800 ml destilliertes Wasser in die Dunstabzugshaube. Auf 50-60 °C umrühren und erhitzen. Nicht über 70 °C erhitzen.
- Fügen Sie 1.000 Einheiten Heparin zu 1 L von 1x PBS hinzu. 1x PBS mit Heparin und 3% PFA in 1x PBS in separate 50 ml Kunststoffspritzen geben.
HINWEIS: Falls vorhanden, können druckgesteuerte Pumpen mit 80-100 mmHg oder hydrostatischem Druck (Tropfmethode, die Höhe der Perfusionslösungen: 160-200 cm über dem Tier) zur Nierenperfusion verwendet werden. - Schließen Sie die PBS, PFA und eine abgestumpfte 21 G Schmetterlingsnadel an einen Drei-Wege-Hahn an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im gesamten System befinden.
- Beschriften Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr und geben Sie 10 ml PFA hinein.
- Tief anästhesieren eine männliche oder weibliche C57BL/6 Maus 12-24 Wochen alt mit 120 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 16 mg/kg Körpergewicht Xylazin. Das Tier muss vor der Operation auf völlige Reaktionsfähigkeit überprüft werden, indem die Reflexe eingeklemmt werden (z. B. Zehen-Pinch-Reflex).
- Sobald das Tier eine chirurgische Anästhesieebene erreicht hat, legen Sie es auf den Rücken unter das Sezieren des Mikroskops. Öffnen Sie den Bauch mit einem Mittellinien-Bauchschnitt mit einer Operationsschere und belichten Sie die Bauchaorta.
- Klemmen Sie die Bauchaorta direkt über der Verzweigung zur Iliasarterie mit einem gekrümmten Hämostat. Dann klemmen Sie die Bauchaorta direkt unter den Nierenarterien mit einem Mikroserrefin. Machen Sie einen kleinen Schnitt (1 mm) auf der Bauchaorta zwischen den beiden Klemmen mit Vannas Schere. Setzen Sie die Schmetterlingsnadel langsam in den Einschnitt ein und achten Sie darauf, die Bauchaorta nicht zu reißen.
- Ligate die rechte Nierenarterie mit einer 5-0 Seidennaht und entfernen Sie die rechte Niere für andere Analysen, wenn nur eine Niere für Perfusion und Fixierung benötigt wird.
- Entfernen Sie die Mikroserrefin, transsektieren Sie die Portalvene mit der Vannasschere und durchdringen Sie sofort mit 50 ml PBS, die Heparin enthalten, und wechseln Sie sie dann mit 50 ml 3% PFA.
HINWEIS: Hoher Perfusionsdruck durch Abdominalaorta ist erforderlich, um Renaltubuli für eine bessere Antikörperdiffusion durch Gewebe zu öffnen. Perfusion durch Herz kann nicht Nierentubuli öffnen. - Sammeln Sie die durchnässte Niere sorgfältig und vermeiden Sie das Durchkreuzen oder Drücken des Gewebes.
- Entfernen Sie die Kapsel und schneiden Sie die Niere in 1 mm dicke koronale Scheiben. Verwenden Sie eine Slicermatrix (Materialtabelle), um die Schnittdicke zu standardisieren.
HINWEIS: Alternativ sollten Sie ein Vibratome verwenden. - Die Nierenscheiben mit dem vorbereiteten PFA in das beschriftete 15 ml konische Rohr eintauchen.
- 10 ml PFA in ein anderes beschriftetes 15 ml konisches Rohr geben. Spülen Sie den Drei-Wege-Hahn und die Schmetterlingsnadel mit PBS, bevor Sie zur nächsten Maus wechseln.
- Führen Sie die Post-Fixierung über Nacht bei RT vor Licht geschützt durch.
2. Gewebevorbereitung und Immunostainierung
- Nach der Nachfixierung die Nierenscheibe zweimal mit 1x Waschpuffer(Materialtabelle) für 1 h auf einer horizontalen Wippe bei RT waschen.
- Führen Sie Antigen-Retrieval durch. 300 ml 1x Antigen-Entlarmungslösung(T-materialfähig) in einem 500 ml Becher auf 92-98 °C erhitzen. Die Scheibe in einbettbarer Einbettkassette unter Rühren für 1 h bei 92-98 °C einschließen. Entfernen Sie das Becherglas von der Hitze und lassen Sie es zu RT abkühlen.
HINWEIS: Einige Anbieter testen ihre Antikörper für die Anwendung der Immunhistochemie und werden eine vorgeschlagene Antigen-Abrufmethode in das Datenblatt aufnehmen. Daher können einige Epitope einen grundlegenderen Puffer erfordern (z. B. pH 9). - Die Scheibe in 10 ml 1x Waschpuffer mit 0,1% Triton X-100 geben und über Nacht bei RT schaukeln. 2x mit 10 ml frischem 1x Waschpuffer für 1 h am nächsten Tag waschen.
- Verdünnen Sie den primären Antikörper in 500 l normales Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle). Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:50-1:100. Die Nierenscheibe in verdünntem Primärantikörper für 4 d bei 37 °C vorsichtig schaukeln.
HINWEIS: Da jeder Antikörper einzigartige Eigenschaften hat, müssen die Temperatur während der Antikörperinkubation und Verdünnungen von Antikörpern für einzelne Sonden optimiert werden. Für sekundäre Antikörper-only-Kontrollen, inkubieren Nierengewebe in Verdünnerohne ohne primären Antikörper. Anstelle von kommerziellem Antikörperverdünnungsmittel können 1x PBS mit 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid verwendet werden. - Waschen Sie die Nierenscheibe in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (z. B. 1:100 für Alexa Fluorkonjugierte Sekundärantikörper) in 500 l normaler Antikörperverdünnung. Die Nierenscheiben in verdünnten Sekundärantikörpern 4 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Von diesem Schritt an, schützen Sie die Nierenscheiben vor Licht.
- Waschen Sie die Nierenscheiben in 10 ml 1x Waschpuffer über Nacht bei RT mit einem Wechsel des Waschpuffers nach 8 h.
3. Gewebe-Clearing
- Nierenscheibe auf 5 ml hochwertiges 100% Ethanol (Materialtabelle) für 2 h bei RT mit sanftem Schaukeln (mit einer Änderung auf frisches Ethanol nach 1 h) übertragen. Dieser Schritt ist für Gewebedehydrierung.
HINWEIS: Hochgradig Ethanol ist erforderlich, um im nächsten Schritt eine hohe Gewebetransluzenz zu erreichen. Methanol oder Tetrahydrofuran sind alternative Dehydrierungsreagenzien mit hohem Delipidationspotenzial. - Nierenscheibe in 2 ml ECi (Materialtabelle) mit sanftem Schaukeln bei RT (mit einer Änderung auf frischen ECi nach 2 h) über Nacht eintauchen.
HINWEIS: Der Gefrier-/Schmelzpunkt von ECi beträgt 6-8 °C. Bewahren Sie daher Proben nicht im Kühlschrank auf. Führen Sie das Eintauchen in eine richtig belüftete Dunstabzugshaube und vermeiden Sie direkten Kontakt mit Kleidung und Haut (ECi ist eine ungiftige, von der Food and Drug Administration zugelassene Verbindung, hat aber einen starken Geruch). Verwenden Sie normale Eppendorf-Rohre oder Glasgefäße (keine Polystyrolgefäße). - Die Gewebetransluzenz kann nach dem ECi-Eintauchen und wenn die Nierenscheiben für die Bildgebung bereit sind, erreicht werden.
4. KonfokaleImaging- und Bildanalyse
HINWEIS: Für die Bildgebung können andere Mikroskopietechniken eingesetzt werden, solange die Refractive Index Matching-Lösung mit der Objektivlinse kompatibel ist. Dieses Protokoll verwendet ein invertiertes konfokales Mikroskop.
- Fügen Sie 600-1.000 l ECi in die Glasbodenschale(Materialtabelle ).
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von regulären Zellkultur-Gerichte, weil ECi ist ein organisches Lösungsmittel, das die Kunststoff-Gerichte auflösen wird. Ebenso kann ECi Kunststoffteile/Isolierringe auf Objektive angreifen. Eine Übersicht über kompatible Bildgebungsgeschirre30 und selbstgefertigte 3D-Druckkammern finden Sie in den entsprechenden Berichten28. - Die transluzente Nierenscheibe in die Schale geben. Legen Sie einen runden Deckelaufstrich auf die Nierenscheibe, um leichten Druck auf den Glasboden auszuüben. Versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie (Tabelleder Materialien), um Leckagen von ECi zu vermeiden.
HINWEIS: Ganze Organe oder mehrere Millimeter dicke Gewebescheiben können einen Rand (Dentalzement oder Silikonelastomer; siehe Tabelle derMaterialien) um das Gewebe erfordern, um einen ECi-Pool für die Probe zu bilden. - Legen Sie die Schale auf die Mikroskop-Bildplattform.
- Nehmen Sie mehrere Z-Stacks und führen Sie Nähte durch. Beginnen Sie mit einer Z-Schritt-Größe von 5 m.
HINWEIS: Erwägen Sie die Verwendung von Zielen mit langer Arbeitsdistanz (>5 mm) und hoher numerischer Blende (>0,9) für die Abbildung sehr dicker Gewebescheiben oder Organe. Nach der Bildgebung das Gewebe wieder in Ethanol übertragen und im Waschpuffer oder PBS mit 0,02% Natriumazid lagern. - Analysieren Sie das Bild mit 3D-Rendering mit Software (Tabelle der Materialien).
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Representative Results
Nieren sind komplexe Organe, die aus 43 verschiedenen Zelltypen31bestehen. Die meisten dieser Zellen bilden große mehrzellige Strukturen wie Glomeruli und Tubuli, und ihre Funktion ist in hohem Maße von Wechselwirkungen miteinander abhängig. Klassische 2-D-Histologische Techniken erfassen diese großen Strukturen teilweise und können fokale Veränderungen innerhalb intakter Strukturen vermissen31. So hilft die 3-D-Analyse mit optischen Clearing-Techniken zu verstehen, wie sie bei Gesundheit und Krankheit funktionieren.
Die meisten lösemittelbasierten optischen Clearing-Techniken werden das endogene fluoreszierende Reporterproteinsignal zumindest teilweise auslöschen. Das Quenching von Parvalbumin mit YFP-Tag wurde bei Dehydrierung und optischer Räumung mit ECi beobachtet (Abbildung 1). Andere starke fluoreszierende Proteine können jedoch signalabschrecken, und die Anpassung des pH-Wertes auf grundgehalte (pH 8-11) kann endogene fluoreszierende Proteine14,20,28,30stabilisieren. Darüber hinaus sollten wässrige Methoden in Betracht gezogen werden, wenn eine Fluoreszenz-Proteinemissionskonservierung gewünscht wird. In diesem aktuellen Bericht wird gezeigt, dass dieses lösungsmittelbasierte Clearingprotokoll mit der Antikörperkennzeichnung kompatibel ist; obwohl, Es bleibt schwierig, tiefe Immunolabeling von Gewebe zu erreichen, vor allem in einem dichten zellreichen Organ wie der Niere.
Retrograde abdominale Aortendurchblutung der Nieren wurde dann durchgeführt, um Blutzellen zu entfernen und Tubulen zu öffnen (Abbildung 2A,B). Dieser Ansatz verringert die Autofluoreszenz und verbessert die Antikörperdiffusion. Die Antikörperkonzentration hängt von der Größe des Gewebes und der Häufigkeit des Antigens ab. Daher kann sich das oberflächliche Signal entweder auf eine schlechte Antikörperdurchdringung oder eine unzureichende Menge an Antikörpern beziehen (Abbildung3A,B, siehe auch Film 1). Bei großen Proben oder extrem reichlichen Markern können höhere Konzentrationen von Antikörpern und eine Auffüllung von Antikörpern nach 1-2 Tagen erforderlich sein. Wenn das Antigen von Interesse in der Nierenvaskulatur ausgedrückt wird, sollte die intravaskuläre Abgabe des Antikörpers in Betracht gezogen werden (Abbildung 3C). Antikörper, die auf Proteine in der apikalen Membran von Tubuleepithelzellen abzielen, überschreiten jedoch aufgrund der molekularen Größe nicht die glomeruläre Filtrationsbarriere, wodurch unspezifische Signale in Blutgefäßen und Glomeruli verursacht werden (Abbildung 3D).
Dieses Protokoll kann auf Nierenscheiben oder ganze Nieren angewendet werden (Abbildung 4A,B). Um die Antikörper-Spezifität zu testen, wurden nur Kontrollen sekundären Antikörpern unterzogen (Abbildung 4C). Das Gewebe kann mit Antikörpern beschriftet werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu erkennen (z. B. vermehrende Zellen, Abbildung 4D) oder um ganze Tubulensegmente mit segmentspezifischen Antikörpern zu visualisieren (Abbildung 4E). Darüber hinaus bietet die Kombination mehrerer Antikörper die Möglichkeit, verschiedene Proteine in 3D zu kolokalisieren (z.B. segmentspezifische Tubulenhyperplasie zu erkennen, wie sie bei der Tubuli-Umgestaltung bei verschiedenen Reizen auftritt) (Abbildung 4F,G; siehe auch Film 2).
Abbildung 1: Abschrecken des endogenen fluoreszierenden Reporterproteinsignals. (A) Das endogene fluoreszierende Reporterprotein, das von der transgenen ParvalbuminYFP+-Mausgewonnen wurde, ist in 5-m dünnen PFA-fixierten gefrorenen Nierenabschnitten nachweisbar. Die Pfeile markieren einige fluoreszierend markierte Parvalbumin+ Zellen, die sich im frühen Teil des distalen verworrenen Tubuli befinden. (B) Es wird kein offensichtliches fluoreszierendes Signal nach der optischen Reinigung des Nierengewebes beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der Nierenperfusionsqualität. (A) Periodisch-saures Schiff (PAS)-gebeiztes Paraffin-eingebettetes Gewebe (5 m dünne Abschnitte) zeigt nur wenige Tubuli mit einem leicht geöffneten Lumen (typischerweise proximale Tubuli, die Pinselrand besitzen; siehe Pfeile). (B) Alle Tubuli werden nach guter Nierenperfusion geöffnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fehlerbehebung bei der Ganzkörper-Immunkennzeichnung. (A,B) Eine dicke Nierenscheibe wurde mit einem Antikörper gegen Natriumchlorid-Cotransporter-2 (NKCC2) gefärbt, der sich in der dick aufsteigenden Gliedmaße der Henle-Schleife ausdrückt. Das Signal ist an der Oberfläche des Gewebes nachweisbar (Pfeile in (B)). Der Antikörper drang jedoch nicht in das Gewebe ein [siehe Pfeilspitze in (B)]. (C) Die intravaskuläre Antikörperinjektion, die auf Proteine abzielt, die in den Gefäßen exprimiert werden (z. B. CD31), ermöglicht eine schnelle und homogene Blutgefäßfärbung. Die runden Strukturen mit einem starken Signal sind glomeruli. (D) Antikörper, die auf Proteine abzielen, die in der apikalen Membran der Tubuliepithel exprimiert werden (z. B. phosphorylierte Natriumchlorid-Cotransporter (Phospho-NCC), die in der distalen verworrenen Tubule exprimiert wird) Filtrationsbarriere, wodurch unspezifische Signale in der Vaskulatur verursacht werden (siehe Pfeilspitze, die auf afferent Arterioles und andere Gefäße zeigt) und Glomeruli (siehe Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von immunmarkiertem, optisch gereinigtem Nierengewebe. (A,B) Dieses Protokoll ermöglicht die optische Reinigung der gesamten Niere. (C) Ein repräsentativer Z-Stack, um das Fehlen einer unspezifischen Bindung von sekundärem Antikörper als Kontrolle ohne vorherige Inkubation nachzuweisen. (D) 3D-Visualisierung eines repräsentativen Z-Stacks zeigt proliferierende Bromodeoxyuridin (BrdU)+ Zellen in Nieren-Medulla. (E) Medulläre Sammelkanäle werden mit einem Antikörper gegen Aquaporin-2 (AQP2) visualisiert. (F,G) Analyse und Quantifizierung von BrdU+ Zellen innerhalb von AQP2+ medullären Sammelkanälen. Für (F,G), siehe auch Film 2. Diese Zahl wurde von Saritas et al.29geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1 (bezogen auf Abbildung 3): 3D-Visualisierung von NKCC2+dicke aufsteigende Gliedmaße der Schleife von Henle. Der Film zeigt eine schlechte Antikörperdurchdringung in einer optisch gereinigten Nierenscheibe. Bitte klicken Sie hier, um das Video herunterzuladen.
Film 2 (bezogen auf Abbildung 4): 3D-Visualisierung von BrdU+Zellenund AQP2+medulläre Sammelkanäle in einer optisch gereinigten Nierenscheibe. Gezeigt werden BrdU+ Zellen (rot) und AQP2+ medulläre Sammelkanäle (in grün). Imaris-Spot- und Oberflächenalgorithmen wurden verwendet, um BrdU+ Zellen außerhalb (türkisfarbene Flecken) oder innen (rosa Flecken) AQP2+Tubuli (grüne Flächen) zu bestimmen. Dieser Film erschien ursprünglich in Saritas et al. 29. Bitte klicken Sie hier, um das Video herunterzuladen.
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Discussion
Optische Clearing-Techniken haben große Aufmerksamkeit für die 3-D-Visualisierung und Quantifizierung der Mikroanatomie in verschiedenen Organen erhalten. Hier wurde die lösungsmittelbasierte Clearing-Methode (ECi) mit der Immunolabelierung zur 3-D-Bildgebung ganzer Tubuli in Nierenscheiben kombiniert. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und schnell. Andere Forschungsfragen können jedoch am besten mit anderen Clearingprotokollen beantwortet werden5. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass lösungsmittelbasierte Methoden Gewebeschrumpfung in variablen Graden verursachen, vor allem aufgrund des Dehydrierungsschritts14,18. Die meisten lösemittelbasierten Methoden (z. B. ECi14) löschen auch zumindest teilweise die endogene Fluoreszenz von Reportern wie GFP oder tdTomato; Daher können FDISCO32, CLARITY12oder CUBIC11 als alternative Protokolle dienen. Der Löscheffekt von ECi ist jedoch variabel und hängt von den einzelnen Konstrukten jeder Reportermaus28ab. Zusätzlich kann die Verwendung von 1) einem fluoreszierenden Antikörper gegen GFP und andere Reporter oder 2) modifizierten lösungsmittelbasierten Protokollen, die endogene Fluoreszenzsignale30,32 erhalten, in diesem Zusammenhang ebenfalls ein alternativer Ansatz sein. Es ist erwähnenswert, dass mehrere Gruppen die Kompatibilität der wässrigen Protokolle24,33,34 getestet haben, um RNA in 3D zu visualisieren, während lösungsmittelbasierte Clearing-Methoden noch nicht getestet wurden. Daher sollten wässrige Clearingmethoden wie die modifizierte Version von CLARITY33 bevorzugt werden, wenn rna-Analyse in Betracht gezogen wird.
Zellen oder Genprodukte von Interesse können mit transgenen Mäusen mit endogener fluoreszierender Proteinexpression visualisiert werden, aber die Erzeugung gentechnisch veränderter Mauslinien ist zeitaufwändig und teuer. Daher ist die Antikörperkennzeichnung praktischer und bietet mehr Flexibilität, obwohl die Immunkennzeichnung von großem Gewebe eine Herausforderung darstellt. Im Gegensatz zum ursprünglichen ECi-Protokoll14kombiniert unser Ansatz eine modifizierte optische Clearing-Methode und Immunlabeling, die einen Antigen-Retrieval-Schritt verwendet. Hitzeinduzierte Antigen-Retrieval wird Proteine denaturieren, hilft aber, den Verlust der Antigenität während der PFA-Fixierung35 wiederherzustellen und verbessert die Antikörperbindung.
Es gibt einige wichtige Schritte in diesem Protokoll. Erstens ist es wichtig, eine gute Durchblutung der Niere durchzuführen. Hämoglobin mit roten Blutkörperchen begrenzt die bildgebende Tiefe7 und erweiterte Tubuli mit offenem Lumen verbessern die Antikörperpenetration. Die Öffnung von Tubuli ermöglicht auch eine bessere Unterscheidung von Proteinen, die in der epitheliaalen apischen Membran exprimiert werden, von anderen apisch exprimierenden Proteinen auf der kontralateralen Seite. Künstlich erweiterte Tubuli können jedoch die Struktur der Tubuli negativ beeinflussen und die spezifische pathophysiologische Reaktion der Niere (z.B. Dilatation verletzter proximaler Tubuli,) verkörpern, aber nicht gesunde Tubuli36. Zweitens verbessert die Antikörperinkubation bei 37 °C statt 4 °C oder RT die Antikörperdurchdringung27. Jeder Antikörper hat jedoch einzigartige Eigenschaften; Daher muss die Temperatur während der Antikörperinkubation für einzelne Sonden optimiert werden. Drittens trägt die Verwendung von Alexa Fluor-647 (far-red spectrum) Sekundärantikörpern dazu bei, das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, zumal Nieren eine große Menge an Autofluoreszenz im blau-grünen Spektrum aussenden37.
Die retroorbitale Injektion14 oder die Perfusion der Niere38 mit fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen Proteine, die in den Blutgefäßen exprimiert werden, ist eine elegante und schnelle Möglichkeit, die Nierenvaskulatur zu kennzeichnen. Proteine in der apikalen Membran von Tubuli bleiben jedoch durch intravaskuläre Injektion unzugänglich, da Antikörper die glomeruläre Filtrationsbarriere mit ihrem abgeschnittenen Molekulargewicht zur Filtration von Proteinen im Bereich von 60-65 kDa nicht überschreiten können. Daher kann die Verwendung von kleinen Antikörperfragmenten und entwickelten Varianten wie Fab-Fragmenten (ca. 55 kDa), Diakörpern (ca. 50 kDa), Tandem-scFv (ca. 28 kDa) oder Nukleinsäure-Aptamern (ca. 6-30 kDa) mit erhaltenen molekularen Erkennungseigenschaften von Antikörpern Möglichkeit, auf die apikale Membran der Tubuli38,39zuzugreifen. Darüber hinaus ist die Kombination von kleinen Antikörperfragmenten mit elektrischen Feldern40 oder Druck13 oder die Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS)-basierten Clearing-Protokollen zur Entfernung von Lipiden24,41,42 kann eine schnelle und effiziente Durchdringung des Gewebes durch Antikörper ermöglichen.
Mehrere Gruppen zeigten, dass die Perfusion mit Clearing-Reagenz nicht nur die Protokollzeit reduziert, sondern auch die Gewebetransparenz19,24,43,44erhöht. Daher sollte die Cannulation der Bauchaorta oder der Nierenarterie mit anschließender Perfusion der Niere mit dehydrierenden und refraktiven Index-Matching-Lösungen in Betracht gezogen werden, um eine bessere und schnellere Gewebeklärung zu erreichen. Wir haben jedoch die ganze Nierebe nicht mit Clearing-Reagenzien durchdringend und aus mehreren Gründen in Scheiben geschnittene Nieren verwendet. Zunächst können verschiedene Antigene durch Antikörperkennzeichnung mehrerer Nierenscheiben aus einer Niere visualisiert werden. Zweitens werden weniger Zeit und Antikörper benötigt, um eine Nierenscheibe im Vergleich zu einer ganzen Niere immunetikettieren zu können. Drittens erzeugt die 3D-Bildgebung großer Samples Datensätze bis zu mehreren Terabyte, was für die meisten Workstations schwierig zu verwalten sein kann. Daher sind Daten aus Gewebeslices oder Teilmengen größerer Dateien bequemer, um komplexe Vorgänge wie automatisierte Zählungen oder Entfernungsmessungen durchzuführen.
In diesem Protokoll wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um Bildgebung mit einzelliger Auflösung durchzuführen, was besonders in Kolokalisierungsstudien relevant ist. Die konfokale Bildgebung erfordert jedoch laserscanning, da ihre Bildgebungsgeschwindigkeit nur für kleine Stücke von gereinigtem Gewebe praktisch ist. Um eine morphometrische 3D-Analyse von mehrzelligen Strukturen wie langen Tubulensegmenten oder sogar ganzen Organen durchführen zu können, sind schnellere Mikroskoptechniken wie Lichtbogenfluoreszenzmikroskope (LSFM) erforderlich. LSFM ermöglicht eine schnelle Bildgebung, wenn die höchste Zellauflösung nicht unbedingt erforderlich ist. Zum Beispiel wurden die Längen von distalen verworrenen Tubuli kürzlich durch die Kombination von ganzmontierter Immunolabeling, optischer Clearing auf Basis von CLARITY12und LSFM29bewertet. Leider ist kommerzielles LSFM teuer und nicht immer kompatibel mit lösemittelbasierten Clearing-Protokollen. Tatsächlich wurde CLARITY für diese Studie ausgewählt, da unser spezielles LSFM mit einem für CLARITY angepassten Ziel nicht mit ECi29kompatibel war. Klingberg et al. haben jedoch nachgewiesen, dass ECi grundsätzlich mit LSFM14vereinbar ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein einfaches optisches Clearing-Verfahren auf ECi-Basis demonstriert wird, das auf jedes Forschungsprojekt mit festen Gewebescheiben von 100 bis mehreren Millimeter Dicke angewendet werden kann. Es ermöglicht auch machbare Analysen, die zuvor fast erschöpfende Anstrengungen erforderten, und eliminiert die erforderlichen Annahmen und Schlussfolgerungen, die mit der zweidimensionalen Analyse der Morphologie verbunden sind. Die Kombination aus Ganzkörper-Immunolabeling, optischer Lichträumung und fortgeschrittener Lichtmikroskopie wird dazu beitragen, das Verständnis der zellulären Funktion bei Gesundheit und Krankheit zu fördern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
T. S. wird durch Stipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft DFG (332853055), der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) und der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (RWTH Returner Program) unterstützt. Unterstützt wird V. G. P. durch Forschungsstipendien der Deutschen Gesellschaft fur Nephrologie, der Alexander von Humboldt-Stiftung und des National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E wird von der Fondation LeDucq unterstützt. Gefördert wird R. K. durch Stipendien der DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), des Landes Nordrhein-Westfalen (MIWF-NRW) und des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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