Summary
A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.
Abstract
As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.
Introduction
O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões1, 2. º , 3. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização4. Os métodos de compensação óptica superam esses problemas equilibrando o índice de refração ao longo de uma amostra para tornar o tecido translúcido para imagens 3-D5,6,7.
Vários métodos de compensação óptica foram desenvolvidos, que se enquadram em duas categorias principais: métodos à base de solvente e aquosa. Métodos de base aquosa podem ser divididos emimersão simples8,9, hiperhidratação10,11e hidrogel incorporando12,13. Os métodos à base de solvente desidratam o tecido, removem os lipídios e normalizam o índice de refração para um valor em torno de 1,55. As limitações da maioria dos métodos baseados em solventes são a têmpera de fluorescência endógena de proteínas de repórter comumente usadas, como GFP, toxicidade por solventes, capacidade de dissolver colas usadas em algumas câmaras de imagem ou lentes objetivas, e encolhimento de tecido durante desidratação14,15,16,17,18,19,20,21. Entretanto, os métodos solvente-baseados são simples, tempo-eficientes, e podem trabalhar em um número de tipos diferentes do tecido.
Os métodos de base aquosa dependem da imersão do tecido em soluções aquosas que possuem índices de refração na faixa de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Estes métodos foram desenvolvidos para preservar a emissão de proteínas de repórter fluorescente endógena e prevenir o encolhimento induzido por desidratação, mas as limitações da maioria dos métodos de compensação à base de aquosa incluem uma duração mais longa do protocolo, expansão tecidual e modificação protéica (ou seja, desnaturação parcial de proteínas por ureia em protocolos hiperhidratantes como SCALea2)7,11,23,25. SCALeS abordou a expansão tecidual através da combinação de ureia com sorbitol, que contrapesos por desidratação a expansão tecidual induzida por ureia, e preservou a ultraestrutura tecidual avaliada pela microscopia eletrônica10. O encolhimento ou a expansão tecidual afetam os tamanhos absolutos das estruturas, as distâncias entre objetos ou a densidade celular por volume; assim, a mensuração das alterações de tamanho na compensação do tecido pode ajudar a interpretar os resultados obtidos7,26.
Em geral, um protocolo para compensação óptica consiste em várias etapas, incluindo pré-tratamento, permeabilização, imunolabeling (se necessário), correspondência de índice de refração e imagem com microscopia de luz avançada (por exemplo, dois fótons, confocal ou microscopia de fluorescência da luz-folha). A maioria das abordagens de compensação foram desenvolvidas para visualizar o tecido neuronal, e estudos emergentes validou sua aplicação em outros órgãos5. Esta ferramenta abrangente tem sido demonstrada anteriormente para permitir a análise confiável e eficiente de estruturas renais, incluindo glomérulos27,28, imune infiltrados28, vasculatura28, e segmentos túbulo 29, e é uma aproximação ideal para melhorar a compreensão da remodelação da função glomerular e do túbulo na saúde e na doença.
Resumido aqui é um método baseado em solvente que combina imunocoloração de túbulos renais; clareira óptica com produtos químicos de etilo (ECi), não tóxico e pronto a utilizar; e a imagem latente da microscopia confocal que permite a visualização e a quantificação completas do túbulo. Este método é simples, combina o antígeno-recuperação de fatias do rim com mancha de anticorpos comerciais, e não exige o equipamento especializado, que o faz acessível à maioria de laboratórios.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, EUA, e autoridades locais relevantes em Aachen, Alemanha.
1. perfusão aórtica abdominal retrógrada e fixação de rins de rato
- Prepare soluções no mesmo dia ou noite antes e armazene em uma geladeira durante a noite. Aqueça as soluções à temperatura ambiente (RT) antes de usar.
-
Fazer um novo lote de 3% paraformaldeído (PFA) em 1x fosfato-tampão salina (PBS). Cerca de 50-100 mL de PFA é necessário por mouse.
- Para fazer 1 L de 3% de PFA: pesar 30 g de PFA e adicionar 800 mL de água destilada na capa de fumos. Mexa e aqueça a 50-60 ° c. Não aqueça acima de 70 ° c.
Cuidado: o PFA é tóxico. Prepare o PFA na capa de fumos. - Adicione lentamente várias gotas de NaOH 2N. Aguarde alguns minutos até PFA entra na solução ou adicionar mais algumas gotas. Alguns pedaços pequenos não se dissolverão.
- Retire a solução do calor. Adicionar 50 mL de PBS 20x. Chill no gelo para RT.
- Ajuste o pH a 7.3-7.4 com HCl. adicionar água destilada a 1 L.
- Remova todas as partículas não dissolvidas filtrando 1X PBS e 3% PFA com filtro de 0,22 μm.
- Para fazer 1 L de 3% de PFA: pesar 30 g de PFA e adicionar 800 mL de água destilada na capa de fumos. Mexa e aqueça a 50-60 ° c. Não aqueça acima de 70 ° c.
- Adicionar 1.000 unidades de heparina a 1 L de 1X PBS. Transferência 1X PBS contendo heparina e 3% PFA em 1X PBS em separado 50 mL seringas de plástico.
Nota: Se disponível, a bomba pressão-controlada ajustou-se em 80-100 mmHg ou a pressão hidrostática (método do gotejamento, a altura das soluções da perfusão: 160-200 cm acima do animal) pode ser usado para a perfusão do rim. - Conecte o PBS, PFA e uma agulha de borboleta de 21 G Blunted a uma torneira de três vias. Certifique-se de que não há bolhas de ar em todo o sistema.
- Rotule um tubo cônico de 15 mL e dispense 10 mL de PFA nele.
- Profundamente anestesiam um macho ou fêmea C57BL/6 mouse 12-24 semanas de idade usando 120 mg/kg de peso corporal cetamina e 16 mg/kg de peso corporal xilazina. O animal deve ser verificado para a ausência completa de responsividade por beliscar os reflexos antes de prosseguir para a cirurgia (por exemplo, reflexo de pinça do dedo do pé).
- Uma vez que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo em suas costas o microscópio de dissecação. Abra cirùrgica o abdômen com uma incisão abdominal do midline usando uma tesoura de funcionamento e exponha a aorta abdominal.
- Aperte a aorta abdominal direita acima da ramificação para a artéria ilíaca com um hemostato curvo. Em seguida, aperte a aorta abdominal logo abaixo das artérias renais com um micro serrefine. Faça uma pequena incisão (1 mm) na aorta abdominal entre as duas braçadeiras com tesouras de Vannas. Insira a agulha borboleta na incisão lentamente e tenha cuidado para não rasgar a aorta abdominal aberta.
- Ligate a artéria renal direita com uma sutura de seda 5-0 e remova o rim direito para a outra análise se somente um rim é necessário para a perfusão e a fixação.
- Retire o micro serrefine, transecto a veia portal com as tesouras dos Vannas, e perfuse imediatamente com 50 mL de PBS que contem a heparina, a seguir interruptor e perfuse com 50 mL de PFA de 3%.
Nota: A pressão elevada da perfusão através da aorta abdominal é exigida para abrir túbulos renais para a melhor difusão do anticorpo através do tecido. A perfusão através do coração não pode abrir túbulos renais. - Colete o rim perfundidos com cuidado e evite perfurar ou espremer o tecido.
- Retire a cápsula e corte o rim em fatias coronais de 1 mm de espessura. Use uma matriz de segmentaçãode dados (tabela de materiais) para padronizar a espessura da fatia.
Nota: Alternativamente, considere usar um vibratome. - Mergulhe as fatias renais com a PFA preparada no tubo cônico de 15 mL rotulado.
- Dispense 10 mL de PFA para outro tubo cônico de 15 mL rotulado. Lave o torneira de três vias e a agulha de borboleta com PBS antes de passar para o próximo mouse.
- Realize a pós-fixação durante a noite em RT protegida da luz.
2. preparação do tecido e imunocoloração
- Após a pós-fixação, lave a fatia de rim duas vezes com 1x tampãode lavagem (tabela de materiais) para 1 h em um rocker horizontal em RT.
- Realize a recuperação do antígeno. Aqueça acima 300 mL da solução de desmascaramento do antígeno 1x (Tcapaz dos materiais) em um copo de 500 mL a 92-98 ° c. Coloque a fatia na gaveta de incorporação permeável ao amortecedor aquecido com agitação para 1 h em 92-98 ° c. Retire o copo do fogo e deixe esfriar a RT.
Nota: Alguns vendedores testam seus anticorpos para a aplicação immunohistochemistry e incluirão um método sugerido da recuperação do antígeno na folha de dados. Portanto, alguns resumos podem exigir um buffer mais básico (por exemplo, pH 9). - Transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e rock durante a noite no RT. Lave as fatias 2x com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco para 1 h no dia seguinte.
- Diluir o anticorpo primário em 500 μL de diluente de anticorpo normal (tabela de materiais). Comece com uma concentração de 1:50-1:100. Balanç delicadamente a fatia do rim no anticorpo preliminar diluído para 4 d em 37 ° c.
Nota: Desde que cada anticorpo tem propriedades originais, a temperatura durante a incubação do anticorpo e as diluições do anticorpo precisam de ser aperfeiçoadas para pontas de prova individuais. Para controles secundários do anticorpo-somente, incubar o tecido do rim no diluente sem anticorpo preliminar. Em vez de diluente de anticorpo comercial, 1X PBS com 0,1% Triton X-100 e 0, 1% de azida sódica pode ser usado. - Lave a fatia de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.
- Diluir os anticorpos secundários (por exemplo, 1:100 para os anticorpos secundários de Alexa fluor) em 500 μL de diluente de anticorpo normal. Incubar as fatias renais em anticorpo secundário diluído durante 4 dias a 37 ° c. A partir deste passo em diante, proteja as fatias de rim da luz.
- Lave as fatias de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.
3. esclarecimento do tecido
- Transfira a fatia de rim para 5 mL de etanol de alto grau 100% (tabela de materiais) para 2 h em RT com balanço suave (com uma mudança para o etanol fresco após 1 h). Esta etapa é para a desidratação do tecido.
Nota: O etanol de alto grau é necessário para alcançar uma alta translucidez tecidual na próxima etapa. O metanol ou o tetrahidrofurano são reagentes alternativos da desidratação com potencial elevado do delipidation. - Mergulhe a fatia de rim em 2 mL de ECi (tabela de materiais) com balanço suave em RT (com uma mudança para ECI fresca após 2 h) durante a noite.
Nota: O ponto de congelação/fusão de ECi é de 6-8 ° c. Portanto, não armazene amostras na geladeira. Conduza a imersão em um exaustor corretamente ventilado e evite o contato direto com a roupa e a pele (o ECi é um composto não-tóxico do alimento e da administração de droga-aprovado mas tem um odor forte). Use tubos Eppendorf regulares ou vasos de vidro (sem vasos de poliestireno). - O translucidez do tecido pode ser conseguido após a imersão do ECI e quando as fatias do rim estão prontas para a imagem latente.
4. ConfocalImaging e análise de imagem
Nota: Para a imagem latente, outras técnicas da microscopia podem ser usadas contanto que a solução de harmonização do índice refração for compatível com a lente objetiva. Este protocolo usa um microscópio confocal invertido.
- Adicionar 600-1000 μL de ECi no prato inferior de vidro (tabela de materiais).
Nota: Evite o uso de pratos de cultura de células regulares, porque ECi é um solvente orgânico que irá dissolver os pratos de plástico. Da mesma forma, ECi pode atacar peças plásticas/anéis de isolamento em lentes objetivas. Refira os relatórios apropriados para uma vista geral de pratos compatíveis da imagem latente30 e câmaras 3-D impressas auto-feitas28. - Transfira a fatia translúcida do rim no prato. Coloque uma lamínula redonda na fatia do rim para aplicar a pressão de luz em direção ao fundo de vidro. Selar o prato com película de parafina (tabela de materiais) para evitar fugas de IPI.
Nota: Órgãos inteiros ou várias fatias de tecido de espessura milímetro podem requerer uma borda (cimento dentário ou elastômero de silicone; ver tabela de materiais) ao redor do tecido para fazer um pool de IPI para a amostra. - Coloc o prato na plataforma da imagem latente do microscópio.
- Pegue vários z-Stacks e realizar costura. Comece com um tamanho z-Step de 5 μm.
Nota: Considere usar a distância de trabalho longa (> 5 milímetros) e os objetivos numéricos elevados da abertura (> 0.9) para a imagem latente de fatias ou de órgãos muito grossos do tecido. Após a imagem, transfira o tecido de volta para o etanol e armazene em tampão de lavagem ou PBS com 0, 2% de azida sódica. - Analise a imagem usando renderização 3-D com software (tabela de materiais).
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Representative Results
Os rins são órgãos complexos compostos por 43 diferentes tipos de células31. A maioria dessas células formam grandes estruturas multicelulares, como glomérulos e túbulos, e sua função é altamente dependente de interações entre si. As técnicas histológicas clássicas de 2-D capturam parcialmente estas grandes estruturas e podem faltar mudanças focais dentro das estruturas intactas31. Assim, a análise 3-D usando técnicas de compensação óptica ajuda a entender como elas funcionam na saúde e na doença.
A maioria das técnicas de compensação óptica à base de solvente irá, pelo menos parcialmente, saciar o sinal de proteína de repórter fluorescente endógena. A têmpera do Parvalbumin com a tag de YFP foi observada após a desidratação e o esclarecimento óptico com ECi (Figura 1). No entanto, outras proteínas fluorescentes fortes podem resistir à têmpera por sinal, e o ajuste do pH para os níveis básicos (pH 8-11) pode estabilizar as proteínas fluorescentes endógenas14,20,28,30. Além, os métodos aquosa-baseados devem ser considerados se a preservação fluorescente da emissão da proteína é desejada. Neste relatório atual, é demonstrado que este protocolo solvente-baseado do esclarecimento é compatível com rotulagem do anticorpo; embora, ele continua a ser desafiador para alcançar o Immunolabeling profundo do tecido, especialmente em um órgão denso de células ricas, como o rim.
A perfusão aórtica abdominal retrógrada dos rins foi executada então para remover pilhas de sangue e abrir túbulos (Figura 2a, B). Esta aproximação diminui o autofluorescence e melhora a difusão do anticorpo. A concentração de anticorpos depende do tamanho do tecido e da abundância do antígeno. Portanto, o sinal superficial pode se relacionar com má penetração de anticorpos ou quantidade insuficiente de anticorpos (Figura 3A, B, ver também filme 1). Para grandes amostras ou marcadores extremamente abundantes, maiores concentrações de anticorpos e reposição de anticorpos após 1-2 dias podem ser necessárias. Se o antígeno de interesse é expresso na vasculatura renal, a entrega intravascular do anticorpo deve ser considerada (Figura 3C). No entanto, anticorpos que visam proteínas na membrana apical de células epiteliais tubulares não atravessam a barreira de filtração glomerular devido ao tamanho molecular, causando sinais inespecíficos nos vasos sanguíneos e nos glomérulos (Figura 3D).
Este protocolo pode ser aplicado em fatias de rim ou rins inteiros (Figura 4a, B). Para testar a especificidade do anticorpo, apenas os controles foram submetidos ao anticorpo secundário (Figura 4C). O tecido pode ser rotulado com anticorpos para detectar uma população de células específicas (por exemplo, células proliferantes, Figura 4D) ou para visualizar segmentos túbulo inteiros usando anticorpos específicos do segmento (Figura 4e). Além disso, a combinação de múltiplos anticorpos oferece a oportunidade de colocalizar diferentes proteínas em 3-D (por exemplo, para detectar hiperplasia tubular específica do segmento, como ocorre na remodelação do túte em diferentes estímulos) (Figura 4F, g; Ver também o filme 2).
Figura 1: têmpera do sinal de proteína de repórter fluorescente endógena. (A) a proteína do repórter fluorescente endógena derivada do rato de parvalbuminYFP +transgênicas é detectável em seções congeladas PFA-fixas finas do rim de 5 μm. As setas marcam alguns parvalbumina+ Cells fluorescente-etiquetados situados na parte adiantada do tubule complicado longe do ponto de origem. (B) nenhum sinal fluorescente evidente depois que o esclarecimento ótico do tecido do rim é observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: avaliação da qualidade da perfusão renal. (A) o tecido embebido em parafina ácida periódica de Schiff (PAS) (secções finas de 5 μm) mostra poucos túbulos com um lúmen ligeiramente aberto (túbulos tipicamente proximais que possuem bordas de pincel; ver setas). (B) todos os túbulos são abertos após boa perfusão renal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: pesquisando defeitos o Immunolabeling da inteiro-montagem. (A,B) Uma fatia grossa do rim foi manchada com um anticorpo de encontro ao sódio-cloreto cotransporter-2 (NKCC2), que é expressado no membro de ascensão grosso do laço de Henle. O sinal é detectável na superfície do tecido (setas em (B)). No entanto, o anticorpo não penetrou no tecido [ver Arrowhead em (B)]. (C) a injeção de anticorpos intravascular visando proteínas expressas nos vasos (por exemplo, CD31) permite a coloração rápida e homogênea dos vasos sanguíneos. As estruturas redondas com um sinal forte são glomérulos. (D) no entanto, os anticorpos destinados a proteínas expressas na membrana apical do epíteto do túbulo (por exemplo, cotransportador de cloreto de sódio fosforilado (phospho-NCC), que é expresso no túbulo complicado distal) não cruzarão a barreira da filtração, causando assim sinais inespecíficos na vasculatura (veja a ponta de seta que aponta em arteríolas aferentes e em outras embarcações) e em glomérulos (veja setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados representativos de imunomarcado opticamente esclarecido tecido renal. (A,B) Este protocolo permite o esclarecimento óptico de todo o rim. (C) uma pilha z representativa para demonstrar ausência de ligação não específica do anticorpo secundário como controle sem incubação prévia. (D) a visualização 3-D de um z-Stack representativo mostra proliferating bromodeoxyuridine (BrdU)+ células na medula renal. (E) os ductos de coleta medular são visualizados com um anticorpo contra aquaporina-2 (AQP2). (F,G) Análise e quantificação de células BrdU+ dentro dos dutos de coleta de AQP2+ medular. Para (F, G), consulte também filme 2. Este número foi modificado de Saritas et al.29. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1 (relacionado com a Figura 3): visualização 3-D domembro ascendente de NKCC2+Thick do laço de Henle. O filme demonstra má penetração de anticorpos em uma fatia de rim opticamente limpa. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo.
Filme 2 (relacionado à Figura 4): visualização 3-D de BrdU+Cells e AQP2+medular que coletam dutos em uma fatia opticamente liberada do rim. BrdU+ Cells (em vermelho) e AQP2+ medular que coletam dutos (no verde) são mostrados. Imaris Spot e algoritmos de superfície foram utilizados para determinar BrdU+ células fora (manchas azul-turquesa) ou dentro (manchas-de-rosa) AQP2+túbulos (superfícies verdes). Este filme apareceu originalmente em Saritas et al. 29. Please clique aqui para baixar o vídeo.
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Discussion
Técnicas de compensação óptica receberam ampla atenção para visualização 3-D e quantificação de microanatomia em vários órgãos. Aqui, o método solvente-baseado do esclarecimento (ECI) foi combinado com o Immunolabeling para a imagem latente 3-D de túbulos inteiros em fatias do rim. Este método é simples, barato e rápido. No entanto, outras questões de pesquisa podem ser melhor respondidas com outros protocolos de compensação5. Também é importante ter em mente que os métodos baseados em solvente causam encolhimento tecidual em graus variáveis, principalmente devido à etapa de desidratação14,18. A maioria dos métodos baseados em solventes (por exemplo, ECI14) também, pelo menos parcialmente, extinguem a fluorescência endógena de repórteres como GFP ou tdtomato; assim, FDISCO32, clareza12, ou cúbico11 pode servir como protocolos alternativos. No entanto, o efeito de têmpera de ECi é variável e depende de construções individuais de cada rato de repórter28. Além, o uso de 1) um anticorpo fluorescente de encontro a GFP e a outros repórteres ou 2) protocolos solvente-baseados modificados que preservam sinais endógenos da fluorescência30,32 podem igualmente ser uma aproximação alternativa neste contexto. Vale ressaltar que vários grupos testaram a compatibilidade dos protocolos de base aquosa24,33,34 para visualizar o RNA em 3-D, enquanto os métodos de compensação à base de solvente ainda não foram testados. Assim, os métodos de compensação à base de aquosa, como a versão modificada do CLARITY33 , devem ser preferidos quando a análise do RNA é considerada.
Células ou produtos de genes de interesse podem ser visualizados usando camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente endógena, mas a geração de linhas de mouse geneticamente projetadas é demorada e cara. Conseqüentemente, a rotulagem do anticorpo é mais prática e fornece mais flexibilidade, embora o Immunolabeling do grande tecido seja desafiante. Em contraste com o protocolo de IPI original14, nossa abordagem combina um método de compensação óptica de ECI modificado e Immunolabeling, que usa uma etapa de recuperação de antígeno. O antígeno-recuperação calor-induzido desnaturar proteínas, mas ajuda a recuperar a perda de antigenicidade durante a PFA-fixação35 e melhora o anticorpo-emperramento.
Há algumas etapas críticas neste protocolo. Primeiro, é importante realizar uma boa perfusão do rim. A hemoglobina contendo glóbulos vermelhos limita a profundidade de imagem7 e os túbulos expandidos com lúmen aberto aumentam a penetração de anticorpos. A abertura dos túbulos também permite distinguir melhor as proteínas expressas na membrana epitelial apical de outras proteínas apicamente expressas no lado contralateral. No entanto, os túbulos artificialmente expandidos podem influenciar negativamente a estrutura do túbulos e mascarar a resposta fisiopatológica específica do rim (por exemplo, dilatação dos túbulos proximais feridos,), mas não de túbulos saudáveis36. Em segundo, a incubação do anticorpo em 37 ° c um pouco do que 4 ° c ou RT melhora a penetração27do anticorpo. No entanto, cada anticorpo tem propriedades únicas; assim, a temperatura durante a incubação do anticorpo precisa de ser aperfeiçoada para pontas de prova individuais. Em terceiro lugar, o uso de Alexa fluor-647 (espectro distante-vermelho) anticorpos secundários ajuda a aumentar a relação sinal-ruído, especialmente desde que os rins emitem uma grande quantidade de autofluorescência no espectro azul-verde37.
A injeção retro-orbital14 ou a perfusão do rim38 com anticorpos fluorophore-conjugados de encontro às proteínas expressadas em vasos sanguíneos são uma maneira elegante e rápida de etiquetar o vasculature do rim. No entanto, as proteínas na membrana apical dos túbulos permanecem inacessíveis por injeção intravascular, uma vez que os anticorpos não podem atravessar a barreira de filtração glomerular com seu peso molecular de corte para filtração de proteínas na faixa de 60-65 kDa. Conseqüentemente, o uso de fragmentos pequenos do anticorpo e de variações projetadas tais como fragmentos Fab (~ 55 KDa), diabodies (~ 50 kDa), scfv em tandem (~ 28 kDa) ou aptâmeros do nucleic-ácido (~ 6-30 kDa) com propriedades preservadas do recognition molecular dos anticorpos pode fornecer um oportunidade de acessar a membrana apical dos túbulos38,39. Além disso, a combinação de pequenos fragmentos de anticorpos com camposelétricos 40 ou pressão13 ou o uso de protocolos de compensação baseados em dodecilo sulfato de sódio (SDS) para remover lipídios24,41,42 pode permitir a penetração rápida e eficiente do anticorpo do tecido.
Vários grupos demonstraram que a perfusão com reagente de compensação não só reduz o tempo de protocolo, mas também aumenta a transparência tecidual19,24,43,44. Conseqüentemente, o canulação da aorta abdominal ou da artéria renal com perfusão subseqüente do rim com desidratação e as soluções de harmonização do índice refração devem ser considerados para conseguir o esclarecimento melhor e mais rápido do tecido. Entretanto, nós não perfuse o rim inteiro com reagentes de limpeza e rins cortados usados por diversas razões. Primeiramente, os antígenos diferentes podem ser visualizados pela rotulagem do anticorpo de fatias múltiplas do rim de um rim. Em segundo, menos tempo e o anticorpo são necessários executar Immunolabeling de uma fatia do rim comparado a um rim inteiro. Terceiro, a imagem latente 3-D de grandes amostras gera os conjuntos de dados até diversos terabytes, que podem ser desafiantes de controlar para a maioria de estações de trabalho. Portanto, os dados de fatias de tecido ou subconjuntos de arquivos maiores são mais convenientes para executar operações complexas, como a contagem automatizada ou medições de distância.
Neste protocolo, a microscopia confocal é usada para executar a imagem latente com a definição da único-pilha, que é particular relevante em estudos da colocalização. Entretanto, a imagem latente confocal exige a exploração do laser, desde que sua velocidade da imagem latente é somente prática para partes pequenas de tecido cancelado. Para realizar a Análise morfométrica 3-D de estruturas multicelulares, como segmentos túbulo longos ou até mesmo órgãos inteiros, são necessárias técnicas de microscópio mais rápidas, como microscópios fluorescentes de chapas leves (lsfm). O LSFM permite imagens rápidas quando a resolução celular mais alta não é essencial. Por exemplo, os comprimentos dos túbulos complicado longe do ponto de origem foram avaliados recentemente combinando o Immunolabeling da inteiro-montagem, o esclarecimento ótico baseado em claridade12, e em lsfm29. Infelizmente, o LSFM comercial é caro e nem sempre é compatível com protocolos de compensação baseados em solventes. De facto, a CLARITY foi escolhida para este estudo, uma vez que a nossa LSFM em particular com um objectivo personalizado para a CLARITY não era compatível com a ECi29. No entanto, Klingberg et al. demonstraram que a ECi é, em princípio, compatível com a LSFM14.
Em conclusão, um simples método de compensação óptica baseado em ECi é demonstrado, que pode ser aplicado a qualquer projeto de pesquisa usando fatias de tecido fixas variando de ~ 100 μm a vários milímetros de espessura. Também permite análises viáveis que anteriormente exigiam esforços quase exaustivos para completar, e elimina as premissas e inferências necessárias associadas à análise bidimensional da morfologia. A combinação do Immunolabeling da inteiro-montagem, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada ajudará a avançar a compreensão da função celular na saúde e na doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O T. S. é apoiado por concessões da Fundação de pesquisa alemão de DFG (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), e a faculdade médica do RWTH AIX-lo-Chapelle (programa do Returner de RWTH). V. G. P. é apoiado por bolsas de pesquisa da Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, da Fundação Alexander von Humboldt, e do Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica da Austrália. D. H. E é apoiado por Fondation LeDucq. R. K. é apoiado por subvenções do DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), o estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e o Centro Interdisciplinar de pesquisa clínica na Universidade RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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