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Biochemistry

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.

Abstract

Las nucleasas son una clase de enzimas que descomponen los ácidos nucleicos al catalizar la hidrólisis de los enlaces de fosfodiester que unen los azúcares ribosa. Las nucleasas muestran una variedad de funciones fisiológicas vitales en organismos procariotas y eucariotas, que van desde el mantenimiento de la estabilidad del genoma hasta la protección contra patógenos. La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con varias condiciones patológicas, incluyendo infecciones bacterianas y cáncer. Con este fin, la actividad de nucleasas ha demostrado un gran potencial para ser explotada como un biomarcador específico. Sin embargo, un método de cribado robusto y reproducible basado en esta actividad sigue siendo altamente deseable.

En este documento, introducimos un método que permite el cribado de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico como sustratos, con el alcance de la diferenciación entre condiciones patológicas y saludables. Este método ofrece la posibilidad de diseñar nuevas bibliotecas de sondeos, con una especificidad cada vez mayor, de forma iterativa. Por lo tanto, se realizan múltiples rondas de cribado para refinar el diseño de las sondas con características mejoradas, aprovechando la disponibilidad de ácidos nucleicos modificados químicamente. El considerable potencial de la tecnología propuesta reside en su flexibilidad, alta reproducibilidad y versatilidad para el cribado de la actividad de nucleasa asociada con las condiciones de la enfermedad. Se espera que esta tecnología permita el desarrollo de herramientas de diagnóstico prometedoras con un gran potencial en la clínica.

Introduction

Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros1. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariotas y eucariotas y se han utilizado, y siguen utilizándose, como herramientas de edición genética2. También son actores fundamentales en el mantenimiento y replicación del ADN, ayudando a mantener la estabilidad del genoma y participando en procesos de lectura de prueba3. En bacterias, por ejemplo, las nucleasas se han identificado como factores de virulencia importantes, capaces de promover la supervivencia bacteriana reduciendo la eficacia del sistema inmunitario del huésped4,5,6,7 ,8. En los mamíferos, se ha sugerido que las nucleasas están implicadas en la apoptosis9,la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento10 y la mediación de las respuestas inmunitarias innatas antibacterianas y antivirales11. No es de extrañar que las alteraciones de la actividad de nucleasa, ya sea la mejora o la falta de, se hayan visto implicadas en una amplia gama de enfermedades humanas. Estas enfermedades van desde una amplia variedad de cánceres12,13 a hipertrofia cardíaca10 o enfermedades autoinmunes14. Por lo tanto, las nucleasas se han convertido en candidatos interesantes como biomarcadores para un grupo heterogéneo de condiciones humanas. De hecho, las nucleasas ya han demostrado su potencial como herramientas de diagnóstico exitosas para la detección de infecciones causadas por agentes bacterianos específicos, como Staphylococcus aureus o Escherichia coli15, 16. En muchos tipos de cáncer, la expresión de la proteína de nuleas estafilocócica 1 (SND1) ribonucleasa es indicativa de mal pronóstico17. En pacientes con cáncer de páncreas, se han notificado niveles séricos elevados de ribonucleasa I (RNase I)18 y se ha propuesto asociarse con fenotipos de células cancerosas19. En afecciones cardíacas isquémicas, como el infarto de miocardio o la angina pecírica inestable, los niveles séricos de desoxirrionucleasa I (DNase I) han demostrado ser un marcador diagnóstico válido20,21.

Se ha planteado la hipótesis de que el plan global de actividad de nucleasa puede ser diferente en estados sanos y de enfermedades. De hecho, informes recientes han utilizado diferencias en la actividad de nucleasa para distinguir entre fenotipos sanos y cancerosos22 o para identificar infecciones bacterianas patógenas de una manera específica de cada especie15,23. Estos hallazgos han abierto una nueva vía para el uso de nucleasas como biomarcadores de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de que se elase un método de cribado integral que pueda identificar sistemáticamente las diferencias asociadas a la enfermedad en la actividad de nucleasa, que pueden ser de vital importancia en el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico.

En este documento, presentamos y describimos un nuevo enfoque de cribado in vitro(Figura 1) para identificar sondas sensibles y específicas capaces de discriminar entre la actividad de nucleasa en sano y insalubre, o la actividad específica de un tipo de célula o bacteria. Aprovechando la modularidad de los ácidos nucleicos, diseñamos una biblioteca inicial de sondas de oligonucleótidos fluorescentes apantallados que consiste en un conjunto completo de diferentes secuencias y químicas, siendo ambos parámetros importantes para el diseño de la biblioteca. Estas sondas de oligonucleótidos están flanqueadas por un fluoróforo (fluoresceína amidita, FAM) y un quencher (tide quencher 2, TQ2) en los extremos de 5' y 3' respectivamente(Tabla 1). Mediante el uso de este ensayo fluorométrico basado en transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) para medir la cinética de la degradación enzimática, pudimos identificar las sondas candidatas con el potencial de discriminar patrones diferenciales de actividad de nucleasa asociados con estados sanos o de enfermedad. Diseñamos un proceso iterativo, en el que se crean nuevas bibliotecas basadas en las mejores sondas candidatas, que permite la identificación de sondas candidatas cada vez más específicas en pasos de selección posteriores. Además, este enfoque aprovecha la naturaleza catalítica de las nucleasas para aumentar la sensibilidad. Esto se logra aprovechando la naturaleza activadezal de las sondas de reportero y la capacidad de las nucleasas para procesar continuamente moléculas de sustrato, ambas representando ventajas clave sobre anticuerpos alternativos o pequeños métodos de cribado basados en moléculas.

Este enfoque ofrece una herramienta de cribado altamente modular, flexible y fácil de implementar para la identificación de sondas específicas de ácido nucleico capaces de discriminar entre estados sanos y enfermedades, y una excelente plataforma para el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico que se pueden adaptar para futuras aplicaciones clínicas. Como tal, este enfoque se utilizó para identificar la actividad de nucleasa derivada de Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, Salmonella)para la identificación específica de esta bacteria. En el siguiente protocolo, informamos sobre un método para detectar la actividad de nucleasas bacterianas mediante el análisis cinético.

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Protocol

1. Diseño y preparación de la biblioteca oligonucleótidos

  1. Diseño de bibliotecas
    1. Basándose en los siguientes criterios, diseñe una biblioteca de sondas de oligonucleótidos fluorescentes alargadas de entre 8 y 12 mer de largo para evitar la formación de estructuras secundarias, con la misma longitud para todas las sondas.
      1. Incluir al menos un ADN y una secuencia aleatoria de ARN que contenga una combinación de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)/uracilo (U)(sondasde ADN y ARN en la Tabla 1).
        NOTA: Las secuencias de ADN y ARN descritas en la Tabla 1 han sido útiles como sustratos iniciales para clasificar un tipo desconocido de actividad de nucleasa, ya sea DNase o RNase. Estas dos secuencias se recomiendan como punto de partida para cualquier cribado, ya que han demostrado una amplia capacidad para detectar perfiles de actividad de nucleasa en bacterias y muestras de tejido. Si no se observa actividad de nucleasa con estas secuencias de ADN y ARN, se requiere el diseño de oligonucleótidos adicionales.
      2. Incluir secuencias de polinucleótidos que consistan en un único tipo de nucleótido para determinar la dependencia de la secuencia para una actividad de nucleasa determinada (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C y RNA-Poly G en la Tabla 1).
      3. Usando la misma secuencia de residuos de nucleótidos que las secuencias iniciales de ADN y ARN, incluye secuencias que contienen análogos de nucleósidos que albergan modificaciones químicas en la posición 2'del azúcar de ribosa, como 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl, como un paso estricto para aumentar la selectividad de las nucleasas.
        1. Incluir secuencias totalmente modificadas que consistan enteramente en análogos de nucleósidos de 2'-Fluoro o análogos de nucleósidos 2'-O-Methyl (Todos 2'-F y All 2'-OMe, Tabla 1)
        2. Incluir secuencias quiméricas consistentes en purinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pirimidina 2'-Fluoro (RNA Pyr-2'F, Tabla 1).
        3. Incluir secuencias quiméricas consistentes en purinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pirimidina 2'-O-Metil (RNA Pyr-2'OMe, Tabla 1).
        4. Incluir secuencias quiméricas consistentes en pirimidinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de pólines 2'-Fluoro (RNA Pur-2'F, Tabla 1).
        5. Incluir secuencias quiméricas consistentes en pirimidinas naturales no modificadas y análogos de nucleósidos de póuron de 2'-O-Metil (RNA Pur-2'OMe, Tabla 1).
  2. Preparación y almacenamiento de la sonda de oligonucleótidos
    NOTA: Los oligonucleótidos son sintetizados por el método de fosforamidia. Después de la síntesis, los oligonucleótidos se purifican utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la masa se mide por espectrometría de masas.
    1. Espíre las sondas liofilizadas de oligonucleótidos utilizando una centrífuga y diluyalas en el tampón Tris-EDTA (TE) para evitar la degradación de la nucleasa. Determinar el volumen de dilución de acuerdo con el rendimiento de cada sonda para renderizar una solución de stock con una concentración de 500 pmol/L.
    2. Conservar oligonucleótidos liofilizados a 4oC o a temperatura ambiente a corto plazo. Para el almacenamiento a largo plazo (meses a años), almacenar oligonucleótidos liofilizados a -20 oC. Tras la resuspensión de oligonucleótidos liofilizados en TE, almacene las soluciones de stock a -20 oC o, preferiblemente, a -80 oC.

2. Cultivo bacteriano

  1. Tome un cordón de vidrio poroso del vial de almacenamiento criogénico en condiciones estériles.
  2. Para aislar colonias bacterianas individuales (Salmonella y E. coli), utilice el método cuadrante24 rayando/enrollando el cordón directamente sobre un plato DeLi que contenga agar de soja tríptico (TSA) medio complementado con ovejas desfibriladas Sangre.
  3. Incubar el cultivo a 37oC durante 24 h.

3. Preparación de sobrenadantes

  1. Transfiera una sola colonia de medios sólidos a 50 ml de caldo de soja tríptica (TSB) e incubar a 37 oC durante 24 h a 200 rpm.
  2. Diluir el cultivo (1:500) en TSB (subcultivo) e incubar a 37 oC durante 24 h a 200 rpm en una incubadora de agitación.
    NOTA: Se espera que después de 24 h de incubación los cultivos bacterianos estén en fase estacionaria alcanzando valores superiores a 109 CFU/ml.
  3. Después del período de incubación, transfiera los cultivos a tubos estériles tapados y centrífuga a 4.500 x g durante 30 min.
  4. Recoge el sobrenadante y úsalo inmediatamente. Alternativamente, guarde los sobrenatantes a 4 oC o -20 oC.

4. Ensayo de actividad de nucleasa

  1. Preparación de soluciones de trabajo
    1. Preparar una solución de trabajo de 20 l para cada sonda en tubos de microcentrífuga libres de nucleasa de 1,5 ml diluyendo (1:10 de relación) la solución de stock (500 pmol/L) para una concentración de trabajo final de 50 pmol/L. Para ello, mezcle 18 ml de solución de tampón de fosfato (PBS) que contiene MgCl2 y CaCl2 con 2 ml de solución de material de sonda.
      NOTA: Tenga en cuenta que en la solución de trabajo, los oligonucleótidos son más vulnerables a la degradación de la nucleasa, por lo tanto, se recomienda preparar las soluciones de trabajo justo antes de configurar la reacción.
    2. Evite el contacto directo con la luz durante la preparación y manténgalo en la oscuridad (envuelto en papel de aluminio), cuando se trate de fluoróforos.
  2. Reacción configurada
    1. Precalentar el fluorómetro (p. ej., la sentencia 1) a 37oC.
    2. Preparar un conjunto (un tubo/sonda) de tubos de microcentrífuga libres de 1,5 ml para cada muestra (TSB, E. coli y Salmonella)y etiquetar en consecuencia.
    3. Añadir cuidadosamente 96 l de medios de cultivo estériles TSB, sobrenadante de Salmonella o sobrenadante de E. coli (desde el paso 3.4.). Posteriormente, añadir 4 l/tubo de solución de trabajo de la sonda en consecuencia. Realice este paso a temperatura ambiente.
      NOTA: Se utilizaron 10 sondas para la primera ronda del cribado y 6 sondas para la segunda ronda.
    4. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo para obtener una solución homogénea. Evite introducir burbujas de aire en las muestras durante la mezcla.
    5. Cargue 95 l de cada solución (sonda + sobrenadante o medio de cultivo) en un pozo separado de un fondo negro, no tratado 96 bien. Minimizar la formación de burbujas en los pozos al cargar mediante la dispensación cuidadosa con la punta cerca de la pared del pozo.
    6. Cubra la placa con la tapa. Inspeccione visualmente la tapa y compruebe si hay marcas de pluma o acumulación de partículas de polvo que puedan introducir artefactos de medición. Sustituya la tapa por una nueva, si ese es el caso.
  3. Configuración de medición
    1. Abra el software de adquisición (Gen5 3.05) haciendo clic en el icono de acceso directo del software(Figura S1A).
    2. Seleccione Leer ahora en la ventana del administrador de tareas y elija Nuevo... para crear el protocolo de medición cinética(Figura S1B).
    3. Haga clic en Establecer temperatura en la ventana de diálogo titulada Procedimiento y seleccione 37 oC. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1C).
    4. Haga clic en Iniciar kinetics en la ventana de diálogo titulada Procedimiento. A continuación, en la ventana de diálogo emergente, titulada Paso cinético, seleccione 2 h en el cuadro de entrada Tiempo de ejecución y 2 minutos en el cuadro de entrada Intervalo. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1D).
    5. Haga clic en Leer en la ventana de diálogo titulada Procedimiento. A continuación, en la ventana de diálogo emergente, titulada Método de lectura, seleccione Intensidad de fluorescencia como método de detección, Endpoint/Kinetic como tipo de lectura y Filtros como tipo óptico. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S1E).
    6. En la ventana de diálogo emergente titulada Leer paso (cinético),seleccione Verde en conjunto de filtros. Confirme y guarde la configuración pulsando OK (Figura S2A).
    7. En la ventana de diálogo titulada Procedimiento, seleccione Usar tapa y haga clic en validar para asegurarse de que el protocolo creado es válido. Esto se confirma mediante una ventana de diálogo emergente (Figura S2B).
    8. Seleccione el protocolo en la barra de menús y elija el procedimiento (figura S2C).
    9. En la ventana de diálogo titulada Procedimiento, defina los pozos a medir (Figura S2D).
    10. Escriba el nombre del experimento en el cuadro de entrada de nombre de archivo (Figura S2E).
    11. Cargue la placa con la tapa en el lector de placas. Asegúrese de que la placa esté en la orientación correcta.
    12. Inicie la adquisición haciendo clic en el botón Leer nuevo en la barra de herramientas (Figura S2F).
  4. Análisis de datos
    1. Haga clic en uno de los pozos medidos en la ventana de diálogo titulada Placa 1 (Figura S3A).
    2. Haga clic en Seleccionar pozos e incluya todos los pozos medidos en la ventana de diálogo de selección de pozos. Confirme y guarde los ajustes pulsando OK. (Figura S3B).
    3. Seleccione los datos en la ventana de diálogo titulada Placa 1 para visualizar los resultados tabulados(Figura S3C).
    4. Exporte los datos a una hoja de pliegos seleccionando la exportación rápida en el menú contextual(Figura S3C).
    5. En la hoja de pliegos, etiquete las columnas de datos en consecuencia para cada muestra y sonda.
    6. Generar gráficos cinéticos, utilizando línea con estilo de marcadores, trazando unidades de fluorescencia relativa (RFU) frente al tiempo (eje x: línea de tiempo de la reacción y eje Y: RPU).
      NOTA: La descripción de la generación de un gráfico es aplicable cuando se utilizan programas de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel). Sin embargo, cualquier otro programa se puede utilizar para generar gráficos a partir de los datos sin procesar obtenidos, trazando RFU frente al tiempo.
    7. Calcular la velocidad de la reacción enzimática para cada intervalo medido Equation 1 de acuerdo con la siguiente fórmula25: rate , donde If es RFU en el punto de tiempo de intervalo máximo y ii es RFU en el punto de tiempo de intervalo mínimo, y Tf y Ti son los puntos de tiempo de intervalo máximo y mínimo, respectivamente.
    8. Seleccione la tasa con el valor más alto (Rmax) para cada curva. Si hay más de unR máximo por muestra, seleccione el que se produce en el punto de tiempo de medición más temprano.
    9. Calcular la relación entre Rmax y el valor medio del intervalo de tiempo en el que se produce Rmax: coeficiente de tasaEquation 2
    10. Calcule la diferencia de pliegue (FD) entre el coeficiente de velocidad de Salmonella y E. coli para cada sonda.
    11. Considere un valor de diferencia de pliegue superior a 3 como significativo.
    12. Considere las sondas significativas con los valores de diferencia de pliegue más altos (FD) como sondeos candidatos y como la base para el diseño de la biblioteca en la siguiente ronda de selección.

5. Criterios de selección de las rondas de cribado (Figura 1)

  1. Primera ronda de detección
    1. Realice el ensayo de actividad de nucleasa (como se describe en la sección 4) utilizando sondas de ADN, ARN y polinucleótidos.
    2. Evalúe la preferencia por la química del ADN o la química del ARN comparando el número y el rendimiento (valor de FD) de las sondas candidatas al ADN y al ARN.
    3. Seleccione el tipo de química de ácido nucleico que representa el mayor número de sondas candidatas, como se ilustra en la Figura 1.
  2. Segunda ronda de detección
    1. Realizar el ensayo de actividad de nucleasa (como se describe en la sección 4) utilizando sondas totalmente modificadas y sondas quiméricas diseñadas sobre la base del sustrato de ácido nucleico seleccionado en la primera ronda de cribado.
    2. Evalúe la preferencia hacia las secuencias que contienen análogos de nucleósidos 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl comparando los resultados obtenidos para las sondas candidatas modificadas 2'-Fluoro y 2'-O-Methyl.
    3. Seleccione el tipo de modificación analógica de nucleósidos que representa el mayor número de sondeos candidatos, como se ilustra en la Figura 1.

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Representative Results

La Figura 1 muestra el flujo de trabajo de esta metodología, que se divide en dos rondas de cribado. En la primera ronda de cribado, utilizamos 5 sondas de ADN (ADN, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C y DNA Poly G) y también 5 sondas de ARN (ARN, RNA Poly A, RNA Poly U RNA Poly C y RNA Poly G). Los datos brutos de esta ronda de cribado se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. En la segunda ronda, las sondas modificadas químicamente se sintetizaron reemplazando la secuencia de ARN por nucleósidos modificados químicamente (Todos 2'-Fluoro y All 2'-OMethyl) o mediante la combinación de ARN y purinas o pirimidinas modificadas químicamente (RNA Pyr-2'F, RNA Pyr-2'OMe, RNA Pur-2'F y RNA Pur-2'OMe). Los datos brutos de esta ronda de cribado se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 2. Puede encontrar una descripción detallada de las secuencias en la Tabla 1. Los resultados obtenidos de la primera ronda de cribado se muestran en la Figura 2,donde los sobrenatantes de cultivo de Salmonella informan de una clara preferencia por las sondas de ARN sobre las sondas de ADN. Por el contrario, los controles de E. coli y de medios de cultivo muestran una capacidad muy limitada para degradar las sondas de ARN. Además, hemos calculado la diferencia de plegado (FD) entre los coeficientes de velocidad de Salmonella y E.coli (Tabla Suplementaria 3 y Tabla Suplementaria 4)con el fin de identificar las sondas de mejor rendimiento. Los cálculos se realizaron como se describe en la sección de protocolo.

Estos resultados sugieren la presencia de un tipo de actividad RNase derivada de Salmonella. Basándonos en la identificación del ARN como el tipo de ácido nucleico preferido para las nucleasas de Salmonella, hemos diseñado una nueva biblioteca utilizando nucleótidos modificados químicamente para ser utilizado en la segunda ronda de cribado destinado a aumentar la especificidad de la Sondas. La Figura 3 muestra los perfiles cinéticos de las sondas que contienen nucleótidos modificados químicamente. Curiosamente, RNA Pyr-2'OMe y RNA Pur-2'OMe muestran el mejor comportamiento cinético en comparación con EL ARN Pyr-2'F y el RNA Pur-2'F, respectivamente.

Estos resultados sugieren que Salmonella tiene una importante actividad De RNase que se puede utilizar para seleccionar sondas capaces de reconocer específicamente esta bacteria. Por otra parte, observamos que los nucleósidos modificados químicamente 2'-OMe son más adecuados para el tipo de ARN secretados por Salmonella. Teniendo esto en cuenta, el protocolo descrito en esta contribución ofrece la posibilidad de explorar el uso de la actividad de nucleasa como biomarcador.

Figure 1
Figura 1: Cultivos de bacterias y flujo de trabajo del proceso de cribado. Preparación de cultivos bacterianos y sobrenatantes (izquierda). Descripción del flujo de trabajo para las dos rondas de cribado. Primer cribado: La preferencia por el ADN o el ARN se evalúa utilizando 10 sondas. Segundo cribado: Sobre la base de la preferencia de ácido nucleico, se evalúan sondas adicionales que contienen nucleótidos modificados químicamente para identificar los sustratos de mejor rendimiento para una actividad de nucleasa determinada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Primera ronda decribado cinético. Perfiles cinéticos de Salmonella, E. coli y medios de cultivo (TSB) utilizando sondas de ADN y ARN. La actividad de nucleasa está representada por unidades de fluorescencia relativa (RFU). Los gráficos son representativos de al menos 3 experimentos realizados individualmente. Las diferentes muestras se etiquetan como se indica en la leyenda del gráfico. Los valores de diferencia de plegado (FD) se calcularon utilizando los coeficientes de velocidad de Salmonella y E. coli para cada sonda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Segunda ronda decribado cinético. Perfiles cinéticos de Salmonella, E. coli y medios de cultivo (TSB) utilizando sondas modificadas químicamente. La actividad de nucleasa está representada por unidades de fluorescencia relativa (RFU). Los gráficos son representativos de al menos 3 experimentos realizados individualmente. Las diferentes muestras se etiquetan como se indica en la leyenda del gráfico. Los valores de diferencia de plegado (FD) se calcularon utilizando los coeficientes de velocidad de Salmonella y E.coli para cada sonda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Secuencias de sondas de ácido nucleico. Lista de todas las sondas de ácido nucleico utilizadas en este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 1
Figura suplementaria 1: Configuración de la medición. Clics de botón y ventanas de diálogo que describen el proceso escalonado realizado en el software de adquisición para configurar los diferentes parámetros de medición. (A) Icono de escritorio. (B) Ventana de diálogo Administrador de tareas. (C) Procedimiento y temperatura Configurar ventanas de diálogo. (D) Ventanas de diálogo Procedimiento y Paso cinético. (E) Ventanas de diálogo Procedimiento y Método de lectura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 2
Figura suplementaria 2: Configuración de la medición. Clics de botón y ventanas de diálogo que describen el proceso escalonado realizado en el software de adquisición para configurar los diferentes parámetros de medición. (A) Procedimiento y lectura de pasos (kinetic) ventanas de diálogo. (B) Ventana de diálogo Procedimiento (C) Barra de menú "Protocolo". (D) Ventana de diálogo de selección de pozos. (E) Cuadro de entrada Nombre de archivo. (F) Ejecutar nuevo icono utilizado para iniciar la adquisición dentro del software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 3
Figura complementaria 3: Análisis de datos. Clics de botón y ventanas de diálogo que describen el proceso escalonado realizado en el software de adquisición para exportar los datos adquiridos en una hoja de pliegos para su posterior análisis. (A) Ventana de diálogo Matriz de placas. (B) Ventanas de diálogo Selección de placas y pozos. (C) Ventana de diálogo Placa y menú contextual Exportación rápida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 4
Figura suplementaria 4: Tercera ronda de cribado (optimización de preferencias de secuencia). Descripción de los diferentes pasos implicados en una ronda de selección adicional destinada a evaluar las variaciones de la secuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 5
Figura complementaria 5: Cuarta ronda de selección (Ronda de evaluación de la especificidad). Descripción de los diferentes pasos involucrados en una ronda de selección adicional destinada a aumentar la especificidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 6
Figura suplementaria 6: Quinta ronda de cribado (optimización de parámetros de reacción). Descripción de los diferentes pasos implicados en una ronda de cribado adicional destinada a reducir la reactividad cruzada no objetivo mediante la modulación de la actividad de nucleasas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Table 1
Tabla complementaria 1: Datos sin procesar de la primera ronda de selección. Para cada sonda (etiquetada en rojo, en la parte superior), se notificaron el tiempo de adquisición y los valores de fluorescencia en bruto para TSB, E. coli y Salmonella,junto con el valor de tasa calculado para cada intervalo. Los cálculos se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Supplementary Table 2
Tabla complementaria 2: Datos sin procesar de la segunda ronda de selección. Para cada sonda (etiquetada en rojo, en la parte superior), se notificaron el tiempo de adquisición y los valores de fluorescencia en bruto para TSB, E. coli y Salmonella,junto con el valor de tasa calculado para cada intervalo. Los cálculos se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Supplementary Table 3
Tabla complementaria 3: Análisis de datos para la primera ronda de selección. Para cada sonda (etiquetada en rojo, en la parte superior), se obtuvieron los siguientes valores para TSB, E. coli y Salmonella:valores de tasa máxima, puntos de tiempo de intervalo mínimo y máximo, coeficiente de tasa, valores de diferencia de pliegue entre Salmonella y E. coli sobre TSB y valores de diferencia de pliegue entre Salmonella y E. coli (resaltado en amarillo). Los cálculos se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos y las fórmulas de cálculo y los cálculos paso a paso se muestran en la hoja de cálculo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Supplementary Table 4
Tabla complementaria 4: Análisis de datos para la segunda ronda de selección. Para cada sonda (etiquetada en rojo, en la parte superior), se obtuvieron los siguientes valores para TSB, E. coli y Salmonella:valores de tasa máxima, puntos de tiempo de intervalo mínimo y máximo, coeficiente de tasa, valores de diferencia de pliegue entre Salmonella y E. coli sobre TSB y valores de diferencia de pliegue entre Salmonella y E. coli (resaltado en amarillo). Los cálculos se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos y las fórmulas de cálculo y los cálculos paso a paso se muestran en la hoja de cálculo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Las alteraciones de la actividad de nucleasa se han asociado con una amplia variedad de fenotipos de la enfermedad, incluyendo diferentes tipos de cáncer e infecciones bacterianas. Se propone que estas alteraciones sean el agente causal de una condición14,mientras que en otros casos son consecuencia de un evento fisiológico perjudicial20 o agente patógeno16,26. No es de extrañar que se hayan descrito los intentos de utilizar nucleasas y actividades de nucleasas como biomarcador de diagnóstico15,22,23,26, con considerable promesa. En consecuencia, el establecimiento de un enfoque de cribado sólido y reproducible para la evaluación sistemática de la actividad de nucleasa en enfermedades y para la identificación de reporteros específicos y sensibles parece pertinente. Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado una plataforma de cribado robusta, modular y fácil de implementar basada en un ensayo de fluorescencia, que permite el descubrimiento de nuevos biomarcadores de enfermedades y la identificación de sondas de ácido nucleico sensibles y específicas en paralelo, utilizando la acción catalítica de las nucleasas.

Se han notificado previamente potentes herramientas de cribado como el cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas (HTS)27,la evolución sistemática de los ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX)28 o la pantalla de fago29, que permiten el identificación de moléculas de reconocimiento de alta afinidad (por ejemplo, moléculas pequeñas, aptámeros o péptidos de unión). En comparación, el enfoque de cribado presentado aquí permite la selección de sondas que pueden identificar la actividad de nucleasa conocida y desconocida. Además, este enfoque es compatible con los modelos de cribado in vitro, ex vivo e in vivo. Además, la naturaleza reactiva de las nucleasas confiere una ventaja evidente sobre los enfoques antes mencionados, en el que la interacción sonda-nucleasa no es una estática, sino un proceso dinámico. Esto significa que la actividad de las nucleasas se convierte en un módulo de amplificación de señal intrínseca para las sondas de reportero, ya que varias sondas de reportero pueden interactuar con una sola nucleasa.

Como en cualquier otro método de cribado, la generación y gestión de la biblioteca inicial es esencial. La naturaleza de las sondas de ácido nucleico proporciona una gran flexibilidad en el diseño y la creación de una biblioteca y permite la introducción de diferentes grados de complejidad dependiendo de la aplicación de cribado. La complejidad de la biblioteca se puede introducir en diferentes niveles, incluyendo motivos de secuencia, química de nucleótidos, química de la columna vertebral de fosfato y longitud de oligonucleótido. La modulación de la complejidad de la biblioteca permite identificar sondas, no sólo por su capacidad para identificar con éxito la actividad de nucleasa asociada a la enfermedad, sino también por las propiedades compatibles con las aplicaciones in vivo posteriores. Además, una biblioteca base de ácido nucleico ofrece varias ventajas sobre sus contrapartes de anticuerpos o péptidos. Por un lado, la producción de anticuerpos es bien conocida por ser engorrosa, requiriendo animales o complejos sistemas de cultivo eucariota, que aumentan el coste e introducen la variabilidad de lotes30,31. Además, el alto peso molecular y la inmunogenicidad limitan su aplicación28,32. Por otro lado, la generación de bibliotecas de péptidos biológicos suele requerir sistemas de expresión viral o bacteriana29,30,aumentando la complejidad del proceso de cribado. Las bibliotecas de péptidos químicos evitan este problema, a expensas de utilizar sistemas enrevesados basados en cuentas o múltiples rondas de síntesis de péptidos caros33. Todos estos problemas se eluden mediante el uso de una biblioteca de ácido nucleico. Una vez establecida la biblioteca inicial, los métodos de selección son rápidos y sencillos. El método descrito en este documento sirve como una plataforma para rondas de cribado adicionales, tales como, optimización de secuencia(Figura suplementaria 4), evaluación de especificidad(Figura suplementaria 5) o optimización de elementos modulatorios de actividad de nucleasa, como cofactores metálicos (típicamente cationes divalentes) y quelantes, que son muy útiles para aumentar la especificidad de las sondas seleccionadas(Figura Suplementaria 6).

El ensayo fluorométrico cinético utilizado en este estudio se puede optimizar tanto para cultivos bacterianos como celulares, y el cribado se realiza en placas de microtíter fáciles de usar. En el caso de los ensayos celulares, este protocolo es compatible tanto con los cultivos de suspensión como monocapa, que, después de la optimización, se pueden utilizar de acuerdo con las necesidades del modelo in vitro que se está estudiando. Hemos identificado varios pasos críticos que requieren optimización antes del cribado. Estos incluyen el número de celda o densidad bacteriana a ensayar, la concentración de la sonda, los ajustes de ganancia del detector de fluorómetros o la implementación de métodos de corrección de fondo incorporados. Una limitación de esta tecnología es la necesidad de una actividad de nucleasa alterada asociada con la condición patológica de interés. Sin esta característica, el enfoque de selección para la selección de sondeos candidatos no es factible. Otra limitación es la capacidad de auto-enfriamiento de las guaninas cuando están cerca del fluoróforo. Esta característica debe tenerse en cuenta al diseñar la biblioteca.

La naturaleza enzimática de la reacción que se mide hace necesario tener en cuenta los tiempos de carga de la placa. Minimizar los tiempos de carga reducirá las diferencias de fondo entre diferentes condiciones experimentales. Existen varias opciones para superar este problema, como ralentizar la reacción enzimática durante la carga mediante el uso de reactivos de hielo frío, o el uso de sistemas de carga automatizados, aunque este último aumenta los costos considerablemente, pero también el rendimiento. Además, las mediciones cinéticas son una gran mejora con respecto a las mediciones estáticas, proporcionando una imagen completa y más realista de la dinámica de la actividad catalítica de las nucleasas.

En resumen, nuestro protocolo ofrece un método de cribado versátil, robusto y reproducible para la identificación de sondas de ácido nucleico sensibles y específicas para la detección de la actividad de nucleasa asociada con la enfermedad, que supera los principales obstáculos de métodos de cribado alternativos. Anticipamos que esta tecnología de cribado permitirá el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas en multitud de condiciones, con fácil traducibilidad a la clínica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores quisieran reconocer a Luiza I. Hernandez (Universidad de Link-ping) por su cuidadosa revisión del manuscrito y valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg y el área de investigación estratégica del gobierno sueco en ciencia de materiales sobre materiales funcionales avanzados en la Universidad de Link-ping (Faculty Grant SFO-Mat-LiU No. 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

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Balian, A., Garcia Gonzalez, J., Bastida, N., Akhtar, K. T. K., Borsa, B. A., Hernandez, F. J. Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes. J. Vis. Exp. (153), e60005, doi:10.3791/60005 (2019).

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