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Biochemistry

न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि का काइनेटिक स्क्रीनिंग

Published: November 1, 2019 doi: 10.3791/60005
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,3, 1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), 3Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University
* These authors contributed equally

Summary

बदल nuclease गतिविधि विभिन्न मानव स्थितियों के साथ संबद्ध किया गया है, एक biomarker के रूप में अपनी क्षमता अंतर्निहित. मॉड्यूलर और इस पत्र में प्रस्तुत स्क्रीनिंग पद्धति को लागू करने के लिए आसान रोग के एक biomarker के रूप में nuclease गतिविधि का दोहन करने के लिए विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच के चयन की अनुमति देता है.

Abstract

न्यूक्लीज एंजाइमों का एक वर्ग है कि फॉस्फोडीस्टर बांड है कि राइबोस शर्करा को जोड़ने के hydrolysis उत्प्रेरित द्वारा न्यूक्लिक एसिड टूट रहे हैं. Nucleases प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक जीवों में महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिकाओं की एक किस्म प्रदर्शित करते हैं, जीनोम स्थिरता को बनाए रखने से लेकर रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने के लिए. परिवर्तित न्यूक्लीज गतिविधि जीवाणु संक्रमण और कैंसर सहित कई रोग की स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है. यह अंत करने के लिए, nuclease गतिविधि महान क्षमता एक विशिष्ट biomarker के रूप में शोषण किया जा दिखाया गया है. हालांकि, इस गतिविधि के आधार पर एक मजबूत और पुन: उत्पादन योग्य स्क्रीनिंग विधि अत्यधिक वांछनीय बनी हुई है।

इसमें, हम एक विधि है कि nuclease गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है substrates के रूप में न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग शुरू, रोग और स्वस्थ स्थितियों के बीच differentiating के दायरे के साथ. इस विधि नए जांच पुस्तकालयों डिजाइन की संभावना प्रदान करता है, विशिष्टता में वृद्धि के साथ, एक पुनरावर्ती तरीके से. इस प्रकार, स्क्रीनिंग के कई दौर बढ़ाया सुविधाओं के साथ जांच डिजाइन को परिष्कृत करने के लिए आवश्यक हैं, रासायनिक संशोधित न्यूक्लिक एसिड की उपलब्धता का लाभ ले. प्रस्तावित प्रौद्योगिकी की काफी क्षमता रोग की स्थिति के साथ जुड़े nuclease गतिविधि की स्क्रीनिंग के लिए अपने लचीलेपन, उच्च reproducibility, और बहुमुखी प्रतिभा में निहित है. यह उम्मीद है कि इस तकनीक क्लिनिक में एक महान क्षमता के साथ होनहार नैदानिक उपकरणों के विकास की अनुमति देगा.

Introduction

न्यूक्लीज, फॉस्फोडाइस्टर आबंधों को बंद करने में सक्षम एंजाइमों का एक वर्ग है जो न्यूक्लिक अम्ल अणुओं की रीढ़ की संरचना बनाते हैं। nucleases के विशाल विविधता उनके वर्गीकरण बल्कि मुश्किल बना देता है. हालांकि, वहाँ कुछ आम मापदंड nucleases का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है, इस तरह के सब्सट्रेट वरीयता के रूप में (deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) या ribonucleic एसिड (RNA)), दरार साइट (endonucleases या exonucleases), या धातु आयन निर्भरता, दूसरों के बीच1. न्यूक्लेस अत्यधिक संरक्षित उत्प्रेरक एंजाइम हैं जिनकी दोनों में मौलिक भूमिका होती है, प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक जीवों और उपयोग किया गया है, और जीन संपादन उपकरण2के रूप में उपयोग किया जा रहा है। वे भी डीएनए रखरखाव और प्रतिकृति में मौलिक अभिनेता हैं, जीनोम स्थिरता रखने के लिए और सबूत पढ़ने की प्रक्रिया में भाग लेने में मदद3. बैक्टीरिया में, उदाहरण के लिए, nucleases महत्वपूर्ण उग्र कारकों के रूप में पहचान की गई है, मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रभावकारिता को कम करने में सक्षम4,5,6,7 ,8. स्तनधारियों में, न्यूक्लिएस को एपोप्टोसिस9, माइटोकोंड्रियाल बायोजेनेसिस और रखरखाव10 और जीवाणुरोधी और एंटीवायरल जन्मजात प्रतिरक्षाप्रतिक्रियाओंकी मध्यस्थता में फंसाने का सुझाव दिया गया है। आश्चर्य की बात नहीं है, nuclease गतिविधि परिवर्तन, चाहे वृद्धि या की कमी, मानव रोगों की एक विस्तृत सरणी में फंसाया गया है. ये रोग विभिन्न प्रकार के कैंसरों से लेकर12,13 से हृदय अतिवृद्धि10 या ऑटोम्यून्यून रोग14तक होते हैं . इसलिए, nucleases मानव स्थितियों के एक विषम समूह के लिए biomarkers के रूप में दिलचस्प उम्मीदवार बन गए हैं. वास्तव में, nucleases पहले से ही विशिष्ट जीवाणु एजेंटों की वजह से संक्रमण का पता लगाने के लिए सफल नैदानिक उपकरण के रूप में अपनी क्षमता दिखाया है, जैसे Staphylococcus ऑरियस या Escherichia कोलाई15, 16.कई प्रकार के कैंसर में, स्टैफिलोकोकल न्यूक्लेस डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएनडी1) राइबोन्यूलेस की अभिव्यक्ति खराब पूर्वानुमान17का संकेत है। अग्नाशय के कैंसर के रोगियों में, ऊंचा ribonuclease मैं (RNase मैं) सीरम का स्तर सूचित किया गया है18 और कैंसर सेल phenotypes के साथ जुड़े होने का प्रस्ताव19. इस्कीमिक हृदय की स्थिति में, जैसे मायोकार्डियल इंफार्क्शन या अस्थिर एंजिना पिक्टोरिस, deoxyribonuclease I (DNase I) सीरम स्तर को एक वैध नैदानिक मार्कर20,21दिखाया गया है।

यह अनुमान लगाया गया है कि nuclease गतिविधि के वैश्विक खाका स्वस्थ और रोग राज्यों में अलग हो सकता है. वास्तव में, हाल की रिपोर्टों में न्यूक्लेस गतिविधि में अंतर का उपयोग स्वस्थ और कैंसर phenotypes22 के बीच अंतर करने के लिए या एक प्रजाति विशेष तरीके से रोगजनक जीवाणु संक्रमण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कियाहै 15,23. इन निष्कर्षों ने रोग के बायोमार्कर के रूप में न्यूक्लीज के उपयोग के लिए एक नया अवसर खोल दिया है। इसलिए, वहाँ एक व्यापक स्क्रीनिंग विधि के विकास के लिए एक आवश्यकता मौजूद है व्यवस्थित nuclease गतिविधि में रोग जुड़े मतभेदों की पहचान करने में सक्षम है, जो नए नैदानिक उपकरणों के विकास में महत्वपूर्ण महत्व का हो सकता है.

इसमें, हम एक नए इन विट्रो स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का परिचय और वर्णनकरतेहैं ( चित्र 1 ) संवेदनशील और विशिष्ट जांचों की पहचान करने के लिए जो स्वस्थ और अस्वस्थ, या किसी प्रकार के सेल या बैक्टीरिया के लिए विशिष्ट गतिविधि के बीच भेदभाव करने में सक्षम होते हैं। न्यूक्लिक एसिड की प्रतिरूपकता का लाभ उठाते हुए, हम विभिन्न दृश्यों और chemistries की एक व्यापक सेट से मिलकर बुझा फ्लोरोसेंट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच के एक प्रारंभिक पुस्तकालय बनाया गया है, दोनों पुस्तकालय डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर जा रहा है. इन ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांचों को एक फ्लोरोफोर (फ्लोरेसीन ऐमिआइट, एएम) और एक क्वेन्चर (टाइड क्वेन्चर 2, TQ2) द्वारा क्रमशः 5' और 3' सिरा पर लगाया जाता है(तालिका 1)। एंजाइमी गिरावट की गतिकी को मापने के लिए इस फ्लोरोसेंट अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग करके, हम nuclease गतिविधि के अंतर पैटर्न भेदभाव करने की क्षमता के साथ उम्मीदवार जांच की पहचान करने में सक्षम थे स्वस्थ या रोग राज्यों के साथ जुड़े. हमने एक पुनरावर्ती प्रक्रिया तैयार की है, जिसमें सबसे अच्छे उम्मीदवार जांच के आधार पर नए पुस्तकालयों का निर्माण किया जाता है, जो बाद में स्क्रीनिंग चरणों में कभी अधिक विशिष्ट उम्मीदवार जांच की पहचान की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए nucleases के उत्प्रेरक प्रकृति का लाभ लेता है. यह रिपोर्टर जांच के सक्रिय प्रकृति का लाभ लेने और लगातार सब्सट्रेट अणुओं की प्रक्रिया करने के लिए nucleases की क्षमता का लाभ लेने के द्वारा हासिल की है, दोनों वैकल्पिक एंटीबॉडी या छोटे अणु आधारित स्क्रीनिंग तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ का प्रतिनिधित्व.

यह दृष्टिकोण एक अत्यधिक मॉड्यूलर प्रदान करता है, लचीला और विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड की पहचान के लिए स्क्रीनिंग उपकरण को लागू करने के लिए आसान स्वस्थ और रोग राज्यों के बीच भेदभाव करने में सक्षम जांच, और नए के विकास के लिए एक उत्कृष्ट मंच नैदानिक उपकरण है कि भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण का उपयोग इस बैक्टीरिया की विशिष्ट पहचान के लिए साल्मोनेला टाइफिमुरियम (यहां साल्मोनेलाके रूप में संदर्भित) से व्युत्पन्न न्यूकेलेस गतिविधि की पहचान करने के लिए किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम गतिज विश्लेषण का उपयोग करके जीवाणु न्यूक्लेस गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विधि पर रिपोर्ट करते हैं।

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Protocol

1. ओलिगोन्यूक्लिओटाइड पुस्तकालय डिजाइन और तैयारी

  1. लाइब्रेरी डिजाइन
    1. निम्नलिखित मानदंडों के आधार पर सभी जांच के लिए समान लंबाई के साथ, माध्यमिक संरचना गठन से बचने के लिए 8 और 12-मर लंबे समय के बीच शमन फ्लोरोसेंट ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच का एक पुस्तकालय डिजाइन।
      1. कम से कम एक डीएनए और एक आरएनए यादृच्छिक अनुक्रम शामिल करें जिसमें एडेनीन (ए), ग्वानीन (जी), साइटोसाइन (सी) और थाइमीन (टी)/यू)(डीएनए और आरएनए जांच)का संयोजन शामिल करें।
        नोट: तालिका 1 में वर्णित डीएनए और आरएनए अनुक्रम एक अज्ञात प्रकार की न्यूक्लेज गतिविधि को वर्गीकृत करने के लिए प्रारंभिक substrates के रूप में उपयोगी रहे हैं, या तो DNase या RNase. इन दो दृश्यों किसी भी स्क्रीनिंग के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में सिफारिश कर रहे हैं, के रूप में वे बैक्टीरिया और ऊतक के नमूने में nuclease गतिविधि प्रोफाइल का पता लगाने के लिए एक व्यापक क्षमता दिखाया है. यदि न्यूक्लेस गतिविधि इन डीएनए और आरएनए दृश्यों के साथ नहीं मनाया जाता है, अतिरिक्त ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के डिजाइन की आवश्यकता है।
      2. किसी दिए गए न्यूक्लीज गतिविधि के लिए अनुक्रम निर्भरता का निर्धारण करने के लिए न्यूक्लिओटाइड के एक एकल प्रकार से मिलकर पॉलीन्यूक्लिओटाइड अनुक्रम शामिल करें (डीएनए-पॉली ए, डीएनए-पॉली टी, डीएनए-पॉली सी, डीएनए-पॉली जी, आरएनए-पॉली ए, आरएनए-पॉली यू, आरएनए-पॉली सी और आरएनए-पॉली जी तालिका 1में )।
      3. प्रारंभिक डीएनए और आरएनए दृश्यों के रूप में न्यूक्लिओटाइड अवशेषों का एक ही अनुक्रम का उपयोग करना, एक कड़े कदम के रूप में इस तरह के 2'-Fluoro और 2'-O-मिथाइल के रूप में, ribose चीनी के 2'-स्थिति में रासायनिक संशोधनों शरण न्यूक्लिओसाइड एनालॉग होते हैं कि दृश्यों में शामिल nucleases के चयन को बढ़ाने के लिए.
        1. पूरी तरह से शामिल 2'-Fluoro न्यूक्लिओसाइड एनालॉग या 2'-O-मेथिल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग (सभी 2'-F और सभी 2'-OMe, तालिका 1)
        2. असंशोधित प्राकृतिक प्यूरीन और 2'-फ्लोरो पाइरिमिडीन न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स (आरएनए पिर-2'एफ, तालिका 1) से मिलकर चिमेरिक अनुक्रम शामिल करें।
        3. असंशोधित प्राकृतिक प्यूरीन और 2'-ओ-मेथिल पाइरिमिडीन न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स (RNA Pyr-2'OMe, Table 1)से मिलकर चिमेरिक अनुक्रम शामिल करें।
        4. असंशोधित प्राकृतिक पाइरिमिडिन्स और 2'-फ्लोरो प्यूरीन न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स (RNA Pur-2'F, Table 1) से मिलकर चिमेरिक अनुक्रम शामिल करें।
        5. असंशोधित प्राकृतिक पाइरिमिडीन और 2'-ओ-मेथिल प्यूरीन न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स (RNA Pur-2'OMe, Table 1)से मिलकर चिमेरिक अनुक्रम शामिल करें।
  2. ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच तैयारी और भंडारण
    नोट: ओलिगोन्यूक्लिओटाइड फॉस्फोरामिआइट विधि द्वारा संश्लेषित होते हैं। संश्लेषण के बाद, ओलिगोन्यूक्लिओटाइड उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग करके शुद्ध होते हैं और द्रव्यमान को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा जाता है।
    1. एक अपकेंद्रित्र का उपयोग कर lyophilized ओलिगोन्यूक्लिओटाइड जांच नीचे स्पिन और उन्हें Tris-EDTA (टीई) बफर में पतला nuclease गिरावट को रोकने के लिए. 500 pmol/$L की सांद्रता के साथ एक स्टॉक समाधान प्रदान करने के लिए प्रत्येक जांच की उपज के अनुसार कमजोर पड़ने की मात्रा निर्धारित करें।
    2. एक छोटी अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर lyophilized ओलिगोन्यूक्लिओटाइड स्टोर करें। दीर्घकालिक भंडारण (वर्षों के लिए महीने) के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर lyophilized ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की दुकान। TE में lyophilized ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के पुन: निलंबन पर, -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान की दुकान या, अधिमानतः, -80 डिग्री सेल्सियस पर।

2. जीवाणु संस्कृति

  1. बाँझ परिस्थितियों में क्रायोजेनिक भंडारण शीशी से एक छिद्रयुक्त कांच मनका लें।
  2. अलग-अलग जीवाणु कालोनियों(सैल्मोनेला और ई. कोलाई)को अलग करने के लिए, मनका को सीधे एक पेट्री डिश पर लकीरें लगाकर/रोलिंगकरके क्वाड्रीट विधि का उपयोग करें जिसमें ट्रिप्टिक सोया आगर (टीएसए) मध्यम शामिल हैं, जो डिब्रिनेट भेड़ के साथ पूरक हैं। रक्त.
  3. 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति इनक्यूबेट करें।

3. सुपरनेंट तैयारी

  1. ठोस मीडिया से 50 एमएल ट्रिप्टिक सोया ब्रोथ (टीएसबी) और 200 आरपीएम पर 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के लिए एक एकल कॉलोनी स्थानांतरित करें।
  2. टीएसबी (उप-संस्कृति) में संस्कृति (1:500) को नष्ट करें और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 200 आरपीएम पर 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह उम्मीद की जाती है कि 24 एच ऊष्मायन के बाद जीवाणु संस्कृतियों स्थिर चरण में 109 CFU/mL से अधिक मूल्यों तक पहुँचने रहे हैं।
  3. ऊष्मायन अवधि के बाद, 30 मिनट के लिए 4,500 x ग्राम पर बंधी बाँझ ट्यूबों और अपकेंद्रित्र के लिए संस्कृतियों को स्थानांतरित करें।
  4. supernatant लीजिए और इसे तुरंत उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर supernatants की दुकान।

4. न्यूक्लेस गतिविधि परख

  1. कार्य समाधान की तैयारी
    1. प्रत्येक जांच के लिए 20 डिग्री सेल्सियस कार्य समाधान तैयार करें 1.5 एमएल न्यूक्लेस मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टॉक समाधान (500 पीमोल/जेडएल) को अंतिम कार्य सांद्रता के लिए 50 पीमोल/ उस प्रयोजन के लिए, जांच स्टॉक समाधान के 2 डिग्री एल के साथ MgCl2 और CaCl2 युक्त फॉस्फेट बफर लवण (पीबीएस) के 18 डिग्री एल मिश्रण.
      नोट: ध्यान रखें कि काम कर रहे समाधान में, oligonucleotides nuclease गिरावट के लिए अधिक कमजोर हैं, इसलिए, यह सिर्फ प्रतिक्रिया स्थापित करने से पहले काम कर समाधान तैयार करने के लिए सिफारिश की है.
    2. तैयारी के दौरान सीधे प्रकाश संपर्क से बचें और फ्लोरोफोर ्स्ड से निपटने के दौरान अंधेरे में रखें (पत्रक में लिपटे)।
  2. रिएक्शन सेट अप
    1. फ्लोरोमीटर (उदा. Cytation 1) से 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए 1.5 एमएल न्यूक्लीज मुक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का एक सेट (एक ट्यूब/प्रोब) तैयार करें (टीएसबी, ई. कोलाई और साल्मोनेला) और तदनुसार लेबल करें।
    3. ध्यान से टीएसबी बाँझ संस्कृति मीडिया, साल्मोनेला supernatant या ई. कोलाई supernatant (चरण 3.4. से) के 96 डिग्री एल जोड़ें। इसके बाद, जांच कार्य समाधान के 4 डिग्री एल/ट्यूब को तदनुसार जोड़ें। कमरे के तापमान पर इस कदम को पूरा करें।
      नोट: 10 जांच स्क्रीनिंग के पहले दौर के लिए इस्तेमाल किया गया और 6 जांच दूसरे दौर के लिए.
    4. एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण करते समय नमूनों में हवा के बुलबुले शुरू करने से बचें।
    5. प्रत्येक समाधान के 95 डिग्री सेल्सियस लोड (प्रोब + supernatant या संस्कृति मीडिया) एक काले नीचे, गैर इलाज 96 अच्छी तरह से थाली के एक अलग अच्छी तरह से में. कुएं की दीवार के पास की नोक के साथ सावधानी से वितरण करके लोड होने पर कुओं में बुलबुले के गठन को कम करें।
    6. प्लेट को इसके ढक्कन से ढक दें। नेत्रहीन ढक्कन का निरीक्षण और माप कलाकृतियों परिचय हो सकता है कि कलम चिह्नों या धूल कण संचय के लिए जाँच करें। यदि ऐसा है तो किसी नए के लिए लिड बदलें.
  3. मापन सेट अप
    1. सॉफ़्टवेयर शॉर्टकट चिह्न पर क्लिक करके प्राप्ति सॉफ़्टवेयर (Gen5 3.05) खोलें (चित्र S1A).
    2. कार्य प्रबंधक विंडो से अभी पढ़ें चुनें और गतिज मापन प्रोटोकॉल बनाने के लिए नया चुनें (चित्र S1B).
    3. प्रक्रिया शीर्षक संवाद विंडो में तापमान सेट पर क्लिक करें और 37 डिग्री सेल्सियस का चयन करें। पुष्टि करें और ठीक दबाकर सेटिंग्स को बचाने के लिए (चित्र S1C)।
    4. प्रक्रियाशीर्षक संवाद विंडो में प्रारंभ Kinetics पर क्लिक करें. फिर पॉप-अप संवाद विंडो में, शीर्षक काइनेटिक चरण, रन टाइम इनपुट बॉक्स में 2 h और अंतराल इनपुट बॉक्स में 2 मिनट का चयन करें। पुष्टि करें और ठीक दबाकर सेटिंग्स को बचाने के (चित्र S1D)।
    5. प्रक्रियाशीर्षक संवाद विंडो में पढ़ें पर क्लिक करें. फिर पॉप-अप संवाद विंडो में, शीर्षक पढ़ें विधि,एक का पता लगाने की विधि के रूप में फ्लोरोसेंट तीव्रता का चयन करें, एक पढ़ने के प्रकार के रूप में एंडपॉइंट / पुष्टि करें और ठीक दबाकर सेटिंग्स को बचाने के लिए (चित्र S1E)।
    6. पढ़ें चरण (काइनेटिक)शीर्षक वाली पॉप-अप संवाद विंडो में, फ़िल्टर सेटसे हरा चुनें. पुष्टि करें और ठीक दबाकर सेटिंग्स को बचाने के (चित्र S2A)।
    7. प्रक्रियाशीर्षक संवाद विंडो में, लिड का उपयोग करें का चयन करें और यह सुनिश्चित करने के लिए मान्य पर क्लिक करें कि बनाया गया प्रोटोकॉल मान्य है. यह एक पॉप-अप संवाद विंडो द्वारा पुष्टि की है (चित्र S2B) .
    8. मेनू पट्टी में प्रोटोकॉल का चयन करें और प्रक्रिया चुनें (चित्र S2C) .
    9. प्रक्रियाशीर्षक संवाद विंडो में , मापा जा करने के लिए कुओं को परिभाषित (चित्र S2D) .
    10. फ़ाइल नाम इनपुट बॉक्स में प्रयोग का नाम दर्ज करें (चित्र S2E).
    11. प्लेट रीडर में अपने ढक्कन के साथ प्लेट लोड करें. सुनिश्चित करें कि प्लेट सही अभिविन्यास में है।
    12. उपकरण पट्टी में नया बटन पढ़ने पर क्लिक करके प्राप्ति प्रारंभ करें (चित्र S2F).
  4. डेटा विश्लेषण
    1. प्लेट 1 शीर्षक संवाद विंडो में मापा कुओं में से एक पर क्लिक करें (चित्र S3A) .
    2. क्लिक करें कुओं का चयन करें और अच्छी तरह से चयन संवाद विंडो में सभी मापा कुओं में शामिल हैं. पुष्टि करें और ठीकदबाकर सेटिंग्स को बचाने के लिए। (चित्रS3B)।
    3. सारणीबद्ध परिणामों की कल्पना करने के लिए प्लेट 1 शीर्षक वाली संवाद विंडो में डेटा का चयन करें (चित्र S3C).
    4. संदर्भ मेनू से त्वरित निर्यात का चयन करके डेटा को स्प्रेड शीट में निर्यात करें (चित्र S3C).
    5. स्प्रेड शीट में, प्रत्येक नमूने और जांच के लिए तदनुसार डेटा स्तंभों को लेबल करें.
    6. सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) बनाम समय (x-अक्ष: प्रतिक्रिया और y-अक्ष: RFUs) की साजिश रचने के द्वारा, मार्कर शैली के साथ लाइन का उपयोग कर, गतिज रेखांकन उत्पन्न.
      नोट: स्प्रेडशीट प्रोग्राम (उदा., Excel) का उपयोग करते समय ग्राफ़ जनरेट करने का वर्णन लागू होता है. हालांकि, किसी भी अन्य प्रोग्राम प्राप्त कच्चे डेटा से रेखांकन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, RFU बनाम समय की साजिश रचने के द्वारा.
    7. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार प्रत्येक मापा अंतराल के लिए एंजाइमी प्रतिक्रिया Equation 1 की दर की गणना25:दर $, जहां यदि अधिकतम अंतराल समय बिंदु पर RFU है और Ii न्यूनतम अंतराल समय बिंदु पर RFU है, और Tf और तिवारी क्रमशः अधिकतम और कम से कम अंतराल समय अंक हैं।
    8. प्रत्येक वक्र के लिए उच्चतम मान (Rअधिकतम) के साथ दर का चयन करें। यदि प्रति नमूना एक से अधिक Rअधिकतम है, तो जल्द से जल्द माप समय बिंदु पर होती है जो एक का चयन करें।
    9. Rअधिकतम और उस समय अंतराल का औसत मान के बीच अनुपात परिकलित करें जिस पर Rअधिकतम होता है: दर गुणांक ]Equation 2
    10. प्रत्येक जांच के लिए साल्मोनेला और ई. कोलाई के दर गुणांक के बीच गुना अंतर (एफडी) की गणना करें।
    11. एक गुना अंतर मूल्य 3 से अधिक के रूप में महत्वपूर्ण पर विचार करें.
    12. उम्मीदवार जांच के रूप में और अगले स्क्रीनिंग दौर में पुस्तकालय डिजाइन के लिए आधार के रूप में उच्चतम गुना अंतर मूल्यों (एफडी) के साथ महत्वपूर्ण जांच पर विचार करें।

5. स्क्रीनिंग राउंड्स चयन मानदंड (चित्र 1)

  1. स्क्रीनिंग का पहला दौर
    1. न्यूक्लीज गतिविधि परख प्रदर्शन (जैसा कि अनुभाग 4 में वर्णित है) डीएनए, आरएनए और पॉलीन्यूक्लिओटाइड जांच का उपयोग करते हुए।
    2. डीएनए और आरएनए उम्मीदवार जांच की संख्या और प्रदर्शन (एफडी मूल्य) की तुलना करके डीएनए रसायन विज्ञान या आरएनए रसायन विज्ञान के लिए वरीयता का मूल्यांकन करें।
    3. न्यूक्लिक अम्ल रसायन के प्रकार का चयन करें जो उम्मीदवार जांचों की सबसे बड़ी संख्या प्रदान करता है, जैसा कि चित्र 1में सचित्र है।
  2. स्क्रीनिंग का दूसरा दौर
    1. पहले स्क्रीनिंग दौर में चयनित न्यूक्लिक एसिड सब्सट्रेट के आधार पर डिजाइन पूरी तरह से संशोधित जांच और झंकार जांच का उपयोग कर न्यूक्लीज गतिविधि परख (के रूप में खंड 4 में वर्णित) प्रदर्शन।
    2. 2'-Fluoro और 2'-O-मिथाइल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग युक्त अनुक्रम ों की ओर वरीयता का मूल्यांकन 2'-Fluoro और 2'-O-मिथाइल संशोधित उम्मीदवार जांच के लिए प्राप्त परिणामों की तुलना करके।
    3. न्यूक्लिओसाइड एनालॉग संशोधन के प्रकार का चयन करें जो उम्मीदवार जांचों की सबसे बड़ी संख्या को प्रस्तुत करता है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है।

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Representative Results

चित्र 1 इस पद्धति के कार्य प्रवाह को दर्शाता है, जिसे दो स्क्रीनिंग राउंड में विभाजित किया गया है। स्क्रीनिंग के पहले दौर में, हम 5 डीएनए जांच (डीएनए, डीएनए पाली ए, डीएनए पाली टी, डीएनए पाली सी और डीएनए पाली जी) और भी 5 आरएनए जांच (RNA, आरएनए पाली ए, आरएनए पाली यू आरएनए पाली सी और आरएनए पाली जी) का इस्तेमाल किया। इस स्क्रीनिंग राउंड के कच्चे आंकड़े अनुपूरक तालिका 1 में पाए जा सकते हैं। दूसरे दौर में, रासायनिक संशोधित जांच रासायनिक संशोधित न्यूक्लिओसाइड्स (सभी 2'-Fluoro और सभी 2'-OMet) के साथ आरएनए अनुक्रम की जगह या आरएनए और purines या pyrimidines रासायनिक संशोधित (RNA Pyr-2'F, आरएनए) के संयोजन से संश्लेषित किया गया Pyr-2'OMe, आरएनए पुर-2'F और आरएनए Pur-2'OMe). इस स्क्रीनिंग राउंड के कच्चे आंकड़े अनुपूरक तालिका 2 में पाए जा सकते हैं। अनुक्रमों का विस्तृत विवरण तालिका 1 में पाया जा सकता है. पहले स्क्रीनिंग दौर से प्राप्त परिणाम चित्र 2में दिखाए गए हैं, जहां सालमोनेला संस्कृति सुपरनेट्स डीएनए जांच पर आरएनए जांच के लिए एक स्पष्ट वरीयता की रिपोर्ट करते हैं। इसके विपरीत, ई. कोलाई और संस्कृति मीडिया नियंत्रण आरएनए जांच नीचा करने के लिए बहुत सीमित क्षमता दिखाते हैं। इसके अतिरिक्त, हमने सर्वोत्तम निष्पादन जांचों की पहचान करने के लिए साल्मोनेला और ई.कोलाई (पूरक तालिका 3 और अनुपूरक तालिका 4) के दर गुणांकों के बीच गुना अंतर (एफडी) की गणना की है। परिकलन प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया.

इन परिणामों से पता चलता है कि साल्मोनेलासे प्राप्त एक RNase प्रकार की गतिविधि की उपस्थिति है . साल्मोनेला न्यूक्लीज के लिए पसंदीदा न्यूक्लिक एसिड प्रकार के रूप में आरएनए की पहचान के आधार पर, हमने स्क्रीनिंग के दूसरे दौर में रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लिओटाइड का उपयोग करके एक नया पुस्तकालय तैयार किया है जिसका उद्देश्य की विशिष्टता को बढ़ाना है जांच. चित्र 3 रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लियोटाइडों वाली जांचों की गतिज प्रोफाइल दर्शाता है। दिलचस्प है, आरएनए Pyr-2'OMe और आरएनए Pur-2'OMe सबसे अच्छा प्रदर्शन गतिज व्यवहार दिखाने के लिए जब आरएनए Pyr-2'F और आरएनए Pur-2'F, क्रमशः के साथ तुलना में.

इन परिणामों का सुझाव है कि Salmonella एक महत्वपूर्ण RNase गतिविधि है कि विशेष रूप से इस बैक्टीरिया को पहचानने में सक्षम जांच का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, हमने देखा कि 2'-OMe रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लिओसाइड साल्मोनेलाद्वारा स्रावित आरएनएज़ के प्रकार के लिए अधिक उपयुक्त हैं। इसे ध्यान में रखते, इस योगदान में वर्णित प्रोटोकॉल एक biomarker के रूप में nuclease गतिविधि के उपयोग की खोज की संभावना प्रदान करता है.

Figure 1
चित्र 1: बैक्टीरिया संस्कृतियों और स्क्रीनिंग प्रक्रिया के कार्यप्रवाह. बैक्टीरिया संस्कृतियों और supernatants की तैयारी (बाएं). दो स्क्रीनिंग राउंड के लिए वर्कफ़्लो का विवरण. पहली स्क्रीनिंग: डीएनए या आरएनए के लिए वरीयता 10 जांच का उपयोग कर मूल्यांकन किया है. दूसरी स्क्रीनिंग: न्यूक्लिक एसिड वरीयता के आधार पर, रासायनिक संशोधित न्यूक्लिओटाइड युक्त अतिरिक्त जांच एक दिया nuclease गतिविधि के लिए सबसे अच्छा प्रदर्शन substrates की पहचान करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रथम गतिज स्क्रीनिंग दौर। डीएनए और आरएनए जांच का उपयोग कर Salmonella, ई. कोलाई और संस्कृति मीडिया (TSB) के काइनेटिक प्रोफाइल। Nuclease गतिविधि रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. रेखांकन कम से कम 3 व्यक्तिगत रूप से प्रदर्शन प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि हैं. विभिन्न नमूनों के रूप में ग्राफ की कथा में संकेत लेबल हैं. फ़ोल्ड अंतर (FD) मानों की गणना प्रत्येक जांच के लिए साल्मोनेला और ई. कोलाई के दर गुणांकों का उपयोग करके की गई थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: द्वितीय गतिज स्क्रीनिंग दौर. रासायनिक संशोधित जांच का उपयोग कर Salmonella, ई. कोलाई और संस्कृति मीडिया (TSB) की काइनेटिक प्रोफाइल। Nuclease गतिविधि रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों (RFU) द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. रेखांकन कम से कम 3 व्यक्तिगत रूप से प्रदर्शन प्रयोगों के लिए प्रतिनिधि हैं. विभिन्न नमूनों के रूप में ग्राफ की कथा में संकेत लेबल हैं. फ़ोल्ड अंतर (FD) मानों की गणना प्रत्येक जांच के लिए साल्मोनेला और ई.कोलाई के दर गुणांकों का उपयोग करके की गई थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: न्यूक्लिक एसिड जांच दृश्यों. इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी न्यूक्लिक अम्ल जांचों की सूची। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: मापन सेट अप. बटन क्लिक और संवाद विंडो विभिन्न माप पैरामीटर सेट करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन stepwise प्रक्रिया का वर्णन. (एक)डेस्कटॉप आइकन. (बी) कार्य प्रबंधक संवाद विंडो. (सी) प्रक्रिया और तापमान सेट अप संवाद खिड़कियां. (डी)प्रक्रिया और काइनेटिक चरण संवाद खिड़कियां. (ई) प्रक्रिया और पढ़ें विधि संवाद खिड़कियां. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्र 2: मापन सेट अप. बटन क्लिक और संवाद विंडो विभिन्न माप पैरामीटर सेट करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन stepwise प्रक्रिया का वर्णन. (एक) प्रक्रिया और पढ़ें चरण (काइनेटिक) संवाद खिड़कियां. (B) प्रक्रिया संवाद विंडो (C) "प्रोटोकॉल" मेनू पट्टी. (डी) अच्छी तरह से चयन संवाद खिड़की. (ई) फ़ाइल नाम इनपुट बॉक्स. (एफ) सॉफ्टवेयर के भीतर अधिग्रहण शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया नया आइकन चलाएँ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 3
अनुपूरक चित्र 3: डेटा विश्लेषण. बटन क्लिक और संवाद खिड़कियों आगे विश्लेषण के लिए एक प्रसार पत्रक में अधिग्रहण डेटा निर्यात करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन stepwise प्रक्रिया का वर्णन. (ए)प्लेट मैट्रिक्स संवाद खिड़की. (बी)प्लेट और अच्छी तरह से चयन संवाद खिड़कियां. (सी) प्लेट संवाद विंडो और त्वरित निर्यात संदर्भ मेनू। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 4
अनुपूरक चित्र 4: तृतीय स्क्रीनिंग राउंड (क्रम वरीयता अनुकूलन)। अनुक्रम विविधताओं का आकलन करने के उद्देश्य से एक अतिरिक्त स्क्रीनिंग दौर में शामिल विभिन्न चरणों का विवरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 5
अनुपूरक चित्र 5: चौथा स्क्रीनिंग दौर (विशिष्टता मूल्यांकन दौर)। विशिष्टता बढ़ाने के उद्देश्य से एक अतिरिक्त स्क्रीनिंग दौर में शामिल विभिन्न चरणों का विवरण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 6
अनुपूरक चित्र 6: पाँचवाँ स्क्रीनिंग राउंड (प्रतिक्रिया पैरामीटर ऑप्टिमाइज़ेशन). एक अतिरिक्त स्क्रीनिंग दौर में शामिल विभिन्न चरणों का विवरण, जिसका उद्देश्य न्यूक्लीज गतिविधि को मॉडुलित करके गैर-लक्ष्य क्रॉस प्रतिक्रियाको कम करना है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Table 1
अनुपूरक तालिका 1: पहले स्क्रीनिंग दौर से कच्चे डेटा. प्रत्येक जांच के लिए (लाल रंग में लेबल, शीर्ष पर), अधिग्रहण समय और कच्चे फ्लोरोसेंट मूल्यों TSB, ई. कोलाई और साल्मोनेलाके लिए रिपोर्ट किया गया, प्रत्येक अंतराल के लिए गणना की दर मूल्य के साथ. गणना विधियों अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Table 2
अनुपूरक तालिका 2: दूसरे स्क्रीनिंग दौर से कच्चे डेटा. प्रत्येक जांच के लिए (लाल रंग में लेबल, शीर्ष पर), अधिग्रहण समय और कच्चे फ्लोरोसेंट मूल्यों TSB, ई. कोलाई और साल्मोनेलाके लिए रिपोर्ट किया गया, प्रत्येक अंतराल के लिए गणना की दर मूल्य के साथ. गणना विधियों अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Table 3
अनुपूरक तालिका 3: पहले स्क्रीनिंग दौर के लिए डेटा विश्लेषण. प्रत्येक जांच के लिए (लाल रंग में लेबल, शीर्ष पर), TSB, ई. कोलाई और साल्मोनेलाके लिए निम्नमान प्राप्त किए गए: अधिकतम दर मान, न्यूनतम और अधिकतम अंतराल समय अंक, दर गुणांक, साल्मोनेला के बीच अंतर मूल्यों गुना और TSB पर ई. कोलाई और साल्मोनेला और ई. कोलाई के बीच अंतर मूल्यों गुना (पीले रंग में प्रकाश डाला). गणना विधियों अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया और परिकलन सूत्र और कदम से कदम परिकलन स्प्रेडशीट में दिखाए जाते हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Table 4
अनुपूरक तालिका 4: दूसरे स्क्रीनिंग दौर के लिए डेटा विश्लेषण. प्रत्येक जांच के लिए (लाल रंग में लेबल, शीर्ष पर), TSB, ई. कोलाई और साल्मोनेलाके लिए निम्नमान प्राप्त किए गए: अधिकतम दर मान, न्यूनतम और अधिकतम अंतराल समय अंक, दर गुणांक, साल्मोनेला के बीच अंतर मूल्यों गुना और TSB पर ई. कोलाई और साल्मोनेला और ई. कोलाई के बीच अंतर मूल्यों गुना (पीले रंग में प्रकाश डाला). गणना विधियों अनुभाग में वर्णित के रूप में किया गया और परिकलन सूत्र और कदम से कदम परिकलन स्प्रेडशीट में दिखाए जाते हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

न्यूक्लीज गतिविधि के परिवर्तन कैंसर और जीवाणु संक्रमण के विभिन्न प्रकार सहित रोग phenotypes की एक विस्तृत विविधता के साथ जुड़ा हुआ है. ये परिवर्तन14शर्त के कारक एजेंट होने का प्रस्ताव है , जबकि अन्य मामलों में ये हानिकारक शारीरिक घटना20 या रोगजनक एजेंट16,26का परिणाम हैं . इसमें कोई आश्चर्य नहीं कि एक नैदानिक बायोमार्कर के रूप में न्यूक्लीज और न्यूक्लेस गतिविधि का उपयोग करने के प्रयासों को काफी वादे के साथ15,22,23,26बताया गया है। तदनुसार, रोग में न्यूक्लीज गतिविधि के व्यवस्थित मूल्यांकन के लिए और विशिष्ट और संवेदनशील रिपोर्टर की पहचान के लिए एक मजबूत और पुन: उत्पादनीय स्क्रीनिंग दृष्टिकोण की स्थापना उचित लगता है। इस आवश्यकता को संबोधित करने के लिए, हम एक मजबूत, मॉड्यूलर और एक फ्लोरोसेंट परख के आधार पर स्क्रीनिंग मंच को लागू करने के लिए आसान विकसित किया है, कि उपन्यास रोग biomarkers की खोज और संवेदनशील और विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच की पहचान की अनुमति देता है समानांतर, न्यूक्लीज की उत्प्रेरक क्रिया का उपयोग करके।

इस तरह के छोटे अणु उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस)27के रूप में शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण, घातीय संवर्धन द्वारा ligands के व्यवस्थित विकास (SELEX)28 या phage प्रदर्शन29 पहले सूचित किया गया है, जो अनुमति देते हैं उच्च आत्मीयता मान्यता अणुओं की पहचान (जैसे, छोटे अणुओं, aptamers या बाध्यकारी-पेप्टाइड्स). इसकी तुलना में, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीनिंग दृष्टिकोण जांच है कि ज्ञात और अज्ञात nuclease गतिविधि की पहचान कर सकते हैं के चयन की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण इन विट्रो, पूर्व vivo और विवो स्क्रीनिंग मॉडल में के साथ संगत है. इसके अलावा, nucleases के प्रतिक्रियाशील प्रकृति ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण पर एक स्पष्ट लाभ प्रदान, कि जांच-न्यूक्लेस बातचीत एक स्थिर नहीं है, लेकिन एक गतिशील प्रक्रिया. इसका मतलब यह है कि nucleases गतिविधि कई रिपोर्टर जांच के बाद से एक आंतरिक संकेत प्रवर्धन मॉड्यूल बन जाता है एक एकल nuclease के साथ बातचीत कर सकते हैं.

किसी भी अन्य स्क्रीनिंग विधि के रूप में, प्रारंभिक पुस्तकालय के उत्पादन और प्रबंधन आवश्यक है. न्यूक्लिक एसिड जांच की प्रकृति डिजाइन और एक पुस्तकालय के निर्माण में महान लचीलापन प्रदान करता है और स्क्रीनिंग आवेदन के आधार पर जटिलता की डिग्री बदलती की शुरूआत की अनुमति देता है. पुस्तकालय जटिलता अनुक्रम रूपांकनों, न्यूक्लिओटाइड रसायन विज्ञान, फॉस्फेट रीढ़ रसायन विज्ञान, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड लंबाई सहित विभिन्न स्तरों पर पेश किया जा सकता है। पुस्तकालय की जटिलता modulating जांच की पहचान करने के लिए न केवल उनकी क्षमता के लिए सफलतापूर्वक रोग के साथ जुड़े nuclease गतिविधि की पहचान करने के लिए, लेकिन यह भी vivo अनुप्रयोगों में बाद के साथ संगत गुणों के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक न्यूक्लिक एसिड आधार पुस्तकालय अपने एंटीबॉडी या पेप्टाइड समकक्षों पर कई फायदे प्रदान करता है. एक ओर एंटीबॉडी उत्पादन को बोझिल होने के लिए जाना जाता है, जिसके लिए जानवरों या जटिल यूकैरियोटिक संस्कृति प्रणालियों की आवश्यकता होती है, जो लागत में वृद्धि करती है और बैच परिवर्तनशीलता30,31पेश करती है। इसके अतिरिक्त उच्च आण्विक भार तथा प्रतिरक्षाजन्यता उनके अनुप्रयोग28, 32कोसीमित करतीहै। दूसरी ओर, जैविक पेप्टाइड पुस्तकालयों की पीढ़ी आमतौर पर या तो वायरल या जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली की आवश्यकताहै 29,30, स्क्रीनिंग प्रक्रिया की जटिलता बढ़ रही है. रासायनिक पेप्टाइड पुस्तकालयों इस समस्या से बचने, जटिल मनका आधारित सिस्टम या महंगी पेप्टाइड संश्लेषण के कई दौर का उपयोग करने की कीमत पर33. इन सभी समस्याओं को न्यूक्लिक एसिड लाइब्रेरी का उपयोग करके दरकिनार कर दिया जाता है। एक बार प्रारंभिक पुस्तकालय स्थापित किया गया है, स्क्रीनिंग तरीकों जल्दी और सीधा कर रहे हैं. यहाँ वर्णित विधि अतिरिक्त स्क्रीनिंग राउंड के लिए एक मंच के रूप में कार्य करती है, जैसे , अनुक्रम अनुकूलन (अनुपूरक चित्र 4), विशिष्टता मूल्यांकन ( अनुपूरक चित्र5) या न्यूनाधिक तत्वों का अनुकूलन न्यूक्लेस गतिविधि, जैसे धातु सहकारक (आमतौर पर द्विसंयोजक कोनों) और चेलेटर्स, जो चयनित जांचों की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं (अनुपूरक चित्र 6)।

इस अध्ययन में इस्तेमाल गतिज फ्लोरोमेट्रिक परख दोनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जीवाणु और सेलुलर संस्कृतियों, स्क्रीनिंग के साथ उपयोगकर्ता के अनुकूल microtiter प्लेटों में प्रदर्शन किया जा रहा है. सेलुलर assays के मामले में, इस प्रोटोकॉल दोनों के साथ संगत है, निलंबन और monolayer संस्कृतियों, जो, बाद अनुकूलन, इन विट्रो मॉडल की आवश्यकताओं के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता अध्ययन किया जा रहा है. हम कई महत्वपूर्ण कदम है कि स्क्रीनिंग से पहले अनुकूलन की आवश्यकता की पहचान की है. ये सेल संख्या या जीवाणु घनत्व परख किया जा करने के लिए शामिल हैं, जांच एकाग्रता, fluorometer डिटेक्टर लाभ सेटिंग्स या में निर्मित पृष्ठभूमि सुधार विधियों के कार्यान्वयन. इस प्रौद्योगिकी की एक सीमा ब्याज की रोग की स्थिति के साथ जुड़े एक बदल nuclease गतिविधि के लिए की जरूरत है. इस सुविधा के बिना, उम्मीदवार जांच के चयन के लिए स्क्रीनिंग दृष्टिकोण संभव नहीं है। एक और सीमा guanines के आत्म-शंका की क्षमता है जब वे fluorophore के करीब निकटता में हैं. पुस्तकालय को डिजाइन करते समय इस विशेषता पर विचार करने की आवश्यकता है।

मापे जा रहे अभिक्रिया की एंजाइमी प्रकृति प्लेट लोडिंग समय पर विचार करना आवश्यक बनाती है। लोडिंग समय को कम करने से विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच पृष्ठभूमि अंतर कम हो जाएगा। इस समस्या को दूर करने के लिए कई विकल्प मौजूद हैं, जैसे बर्फ-ठंडा अभिकर्मकों का उपयोग करके लोडिंग के दौरान एंजाइमी प्रतिक्रिया को धीमा करना, या स्वचालित लोडिंग सिस्टम का उपयोग करना, हालांकि बाद की लागत काफी बढ़ जाती है, लेकिन थ्रूपुट भी। इसके अलावा, गतिज माप स्थिर माप पर एक महान सुधार कर रहे हैं, nucleases उत्प्रेरक गतिविधि की गतिशीलता का एक पूर्ण और अधिक यथार्थवादी चित्र प्रदान करते हैं.

संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल रोग है, जो की प्रमुख बाधाओं पर काबू पाने के साथ जुड़े nuclease गतिविधि का पता लगाने के लिए संवेदनशील और विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच की पहचान के लिए एक बहुमुखी, मजबूत और reproduible स्क्रीनिंग विधि प्रदान करता है वैकल्पिक स्क्रीनिंग के तरीके. हम आशा करते हैं कि इस स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी की स्थिति की एक भीड़ में उपन्यास नैदानिक उपकरणों के विकास की अनुमति देगा, क्लिनिक के लिए आसान translationability के साथ.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि और मूल्यवान सलाह के उसे सावधान संशोधन के लिए Luiza I. Hernandez (लिंकिंग विश्वविद्यालय) को स्वीकार करना चाहते हैं. इस काम Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन और लिंकिंग विश्वविद्यालय में उन्नत कार्यात्मक सामग्री पर सामग्री विज्ञान में स्वीडिश सरकार सामरिक अनुसंधान क्षेत्र द्वारा समर्थित किया गया था (फैकली अनुदान SFO-Mat-LiU नहीं 2009-00971).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black bottom, non-treated 96 well plate Fisher Scientific 10000631
Cytation1 BioTek CYT1FAV
Eppendorf tubes Thermofisher 11926955
Escherichia coli ATCC 25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads Pro-Lab Diagnostics 22-286-155
Nucleic acid probes Biomers.net #
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 Gibco™ 14040117
Salmonella enterica subs. Enterica ATCC 14028
Tris-EDTA Fisher Scientific 10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood Thermo Fisher Scientific 10362223
Tryptic Soy Broth Sigma Aldrich 22092

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References

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