Summary
כאן, אנו מציגים שיטה אמינה, פולשנית, וחסכונית כדי להקליט ולפרש אינהלטורים דג בוגרים מורדם.
Abstract
. ואלה של בני אדם דומים להפליא קווי הדמיון החשמליים האלה לשפר את הערך של דג דג זברה לא רק כמודל מחקר לפיזיולוגיה ולmyopathies לב האדם, אלא גם כמודל פונדקאית ההקרנה התרופות בתפוקה גבוהה עבור cardiotoxicities פוטנציאליים כדי ל בני אדם, כגון הסתה לQT. ככזה, ב vivo אלקטרוקרדיוגרם עבור מבוגרים דג הוא כלי הפנוטיפים חשמלי כי הוא הכרחי, אם לא הכרחי, עבור חתך או האורך בתווים vivo electroפיזיולוגיים. עם זאת, לעתים קרובות מדי, העדר שיטת הקלטה אמינה, מעשית וחסכונית, נותרה אתגר מרכזי המונע זאת בכלי האבחון הvivo מלהפוך לנגישים יותר. כאן, אנו מתארים גישה מעשית, ברורה vivo אלקטרוקרדיוגרם עבור מבוגרים הדגים באמצעות תחזוקה נמוכה, חסכונית, מערכת מקיפה התשואות עקבית, הקלטות אמין. אנו ממחישים את הפרוטוקול שלנו באמצעות מבוגר בריא זכר דג זברה של 12-18 חודשים של גיל. אנו מציגים גם אסטרטגיית פרשנות מהירה בזמן אמת עבור אימות איכות כדי להבטיח דיוק נתונים וחוסן מוקדם בתהליך ההקלטה החשמלית.
Introduction
הדגים (danio rerio) הלב הוא ממוקם לחלל החזה בין הפעלה ומחוכים החזה. הלב הוא סגור למדי בתוך שק בצבע כסף קרום הלב. מבחינה אנטומית, לב הדגים שונה מלבבות היונקים האנושיים והאחרים בגלל קנה המידה הזעיר שלו (100 מתקפל קטן יותר מהלב האנושי) ומבנה שני הצ שלה, המורכב מאטריום אחד בלבד וחדר אחד. למרות זאת, צורות גל האלקטרוקרדיוגרם והמשך של מרווח ה-QT של שני המינים דומים במידה ניכרת (איור 1). בהתאם, דג זברה התפתחה כמודל פופולרי עבור הלומדים הפרעות קצב בירושה של האדם1,2,3 ועבור הקרנת סמים בתפוקה גבוהה של cardiotoxicities אנושי פוטנציאלי4,5 , כגון הארכה של QT.
בהערכה שגרתית של מחלות לב האדם, א. א. משטח הגוף הפך להיות בשימוש הנרחב ביותר שימוש מהשורה הראשונה לא פולשנית כלי אבחון מאז ההמצאה שלו על ידי Einthoven ב 1903. לעומת זאת, מאז העיבוד הראשון של משטח הגוף שיטת ההקלטה של א. ג. בוגרים דג זברה ב 20066 ומספר שינויים לאחר מכן7, טכניקה זו נשארה במידה רבה נגיש לחוקרים רבים בתחום למרות הפופולאריות של המודל החי הזה. עבור חוקרים אחרים שביצעו בחקירת vivo א למבוגרים דגים, וריאציות רחבות בקרב מפעילי הובילו חוסר עקביות בממצאי א. ג. ממחקרים שונים. סיבות נפוצות כוללות התקנים מסורבל ויקר מיוחדים ותוכנות, יחס האות לרעש נמוך, ובלבול לגבי מיקום האלקטרודה, כולם מחמירות יותר על ידי הבנה לא מלאה של תכונות בוגרים של א. א. ג. ו. מנגנוני הרקמה הבסיסיים. בהינתן כי ב vivo א הוא כלי האבחון היחיד החשמלית פניטיפים לחיות, יש צורך ברור עבור שיטה סטנדרטית כדי לשפר את הרגישות ואת הספציפיות, התוכסות ונגישות.
כאן, אנו מציגים גישה מעשית, אמין, ומאומת כדי להקליט ולפרש דג זברה ב vivo אינהלטורים (איור 2). באמצעות הפניה דו קוטבית אחת במישור החזיתי, חקרנו את השינויים בצורות גל א ' א ומשכי מרווח של חיות למבוגרים בריאים בעלי סוג פראי AB בוגרים.
Protocol
כל הניסויים במחקר זה נערכו בהתאם למוסדות הלאומיים של ארה ב מדריך בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל פרוטוקולי החיות במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת UCLA.
1. הכנת מערכת הניסוי
- שמור דג זברה בזרימה-דרך אקווריום מערכות על האור 14 h, 10 h photoperiod כהה ב 28 ° c ± 0.5 ° c. להאכיל עם מזון פתיתים מדי יום ולחיות שרימפס מלח החי (ארטמיה זוחלים) פעמיים ביום. Zebrafish במחקר זה שמרו והאכילו על ידי מרכז הדגים באוניברסיטת UCLA.
- ביום הניסוי, הובלה מדגים. מאקווריום למעבדה
- הגדר את מערכת ההקלטה vivo א על ידי חיבור החלקים החיוניים של ציוד והוספת שלוש בצבע אלקטרודות פלדת אל-חלד לתוך שלושת הצבעים התואמים פורטלים של המגבר (איור 3). הפעל את המערכת בתחילת הקלטת ו/או ניתוח.
- להשיג כלים הכרחי, כגון טיימר/סטופר, ספוג רטוב עם חתך להחזיק את הדג, מלקחיים, מספריים, מכשירי פסטר, ומנות תרבות (100 מ"מ x 20 מ"מ).
2. אינדוקציה הרדמה
- הכינו הרדמה לטבילה לשיכוך כאבים ושיקום דגים כדי להימנע מחפצי תנועה במהלך רכישת נתוני א. א. רוב המעבדות להשתמש הטבילה tricaine (אתיל 3-מתיונין מתושלח, MS-222).
- כדי להפוך את tricaine 0.4% פתרון מלאי, לשלב את הפריטים הבאים בבורג הכתיר בקבוק זכוכית כהה: 400 mg של אבקת tricaine, 98 mL של מים כפולים מזוקקים, ו 2 מ ל של 1 M טריס (pH 9). התאם ל-pH 7.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl לפי הצורך8.
- כדי להפוך את הפתרון הסופי לטבילה tricaine, לקבוע את הריכוז המינימלי המתאים לגיל דג זברה9, גודל, מצב חילוף חומרים, מאמץ, מודל המחלה, מטרות מדעיות, ומשך פרוצדורליים.
- לבצע ריכוז טריקיין-תגובה למחקר, titrating למעלה או למטה מן הריכוז המומלץ של 168 mg/L (או 0.0168%) אם יש צורך, כדי להשיג רמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות עם התרופות הפחות מינימום האפשרי. למשל, במחקר זה, טבילה של פראי סוג AB דג זברה של 12-18 חודשים של גיל לתוך 0.02-0.04% הפתרון tricaine יגרום לרמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות.
הערה: ברמה 4 של הרדמה, שיווי משקל שריר הטון הם אבודים לחלוטין שיעור התנועה הפעלה מופחת8. - במידת הצורך, יש להתייעץ עם הוטרינר בוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) לקבלת הנחיות נוספות על הצורך בבחירת ההרדמה ומסלול הניהול.
- לטבול בוגרים דג זברה לתוך תבשיל המכיל פתרון tricaine של הנמוך ביותר מראש והריכוז iacuc מאושר (g., 0.02-0.04% במחקר זה) כדי לגרום לרמה 4 של הרדמה בתוך 3 דקות (איור 2).
- לפרוטוקול הישרדות, שמור על הקלטת הקלטה קצרה ככל האפשר (פחות מ -10 דקות). לקבלת הקלטות קצרות הקלטה שנמשך פחות מ 15 דקות, תחזוקה הרדמה אינו הכרחי.
- עבור הפעלות ארוכות של הקלטת אק ג שעות ממושך, להשתמש משותק הפנים שרירי משתק ומערכת זלוף אוראלי לספק בשפע החמצן ו חמצון6.
3. מיקום מוביל א
- ברגע שהדג שומר על רמת 4 של הרדמה עבור 3 s, השתמש בזוג מלקחיים בוטים כדי להעביר את הדג מיד על הספוג הלח עם המשטח הגשלה כלפי מעלה למיקום של אלקטרודות עופרת א (איור 4).
- בעדינות להכניס את שלושת האלקטרודות העופרת א לתוך השרירים דגים כ 1 מ"מ לעומק כדי להקים עופרת דו-קוטבית במישור הקדמי המקביל הקבלה השמאלית caudal הימנית של הציר הראשי הלב.
- הצב את האלקטרודה החיובית (האדומה) בתוך קו האמצע במפלס העורקי הבולבוס, כלומר, ב-1-2 מ"מ מעל לקו דמיוני המחבר בין שני הקצוות התחתונים של המבצע (איור 4A).
- למקם את שלילית (שחור) האלקטרודות האלקטרודה ו 0.5-1.0 מ"מ שמאל האלקטרודה החיובית, במרחק גדול יותר מאשר האורך המקסימלי apicobasal של החדר המבוגר זברדג (איור 4A).
- למקם את ההפניה (ירוק) האלקטרודה במקום, ליד האזור אנאלי.
הערה: מאחר והציר העיקרי הלב משתנה במקצת מדגים לדגים, כדי למקסם את ההגברה של R ו-T, להתאים את עמדות ההובלה על-ידי הפיכת שינויים קטנים ושיטתיים בלבד באמצעות ניסוי וטעייה. לדוגמה, שינוי אלקטרודה אחת (חיובית או שלילית), במקום שתי האלקטרודות, בכל פעם ולבצע שינויים הדרגתיים בכיוון אחד שצוין לפני שינוי לכיוון אחר במקום לבצע שינויים בלתי יציבים בכיוונים אקראיים.
4. הקלטה של א. ג.
- פתח את תוכנית רכישת הנתונים של א. ג. א. בחר בהגדרה רצויה מהתפריטים הנפתחים עבור טווח, מעבר נמוך ומעבר גבוה. לדוגמה, ההגדרה הבאה במערכת ההקלטה vivo א בשימוש בניסוי זה התשואות עקבית, משביע רצון אות לרעש של דג מבוגר נורמלי: טווח "2 mV", נמוך לעבור "120 Hz", ו-high pass "0.03 s".
- לחץ על התחל כדי להתחיל הקלטה רציפה ללא מרווח בקצב דגימה של kHz 1.
- כדי לייעל את המיקום המוביל ליחס אות לרעש מקסימלי, לחץ על stop כדי להפסיק את ההקלטה ולסקור את מעקב ההקלטה הראשון של כל לב. כדי לאבחן את העובדה שג מבוגר הוא נורמלי, ודא שכל ארבעת הקריטריונים הבאים לאימות מסופקים (איור 1):
- קריטריון 1: ודא שכל צורות ה-גל (P, QRS ו-T) הן ברורות וגלויות.
- קריטריון 2: לוודא את הגל P חיובי.
- קריטריון 3: ודא כי הקומפלקס הנקי QRS הוא חיובי (כלומר, משרעת הגל R גדול יותר מסכום ההגברה של ה-Q ו-S).
- קריטריון 4: ודא כי גל ה-T הוא חיובי.
- אם נדרש אק ג רגיל, מקם מחדש את האלקטרודות (נסה את האלקטרודה השלילית תחילה) במידת הצורך, עד שכל ארבעת קריטריוני האימות מסופקים.
- אם מצפים גל רגיל, אבל הגל T הוא קטן מדי, למקם מחדש את האלקטרודות כדי למקסם את משרעת הגל T.
- חדש את הקלטת א לאחר אופטימיזציה מיצוב העופרת. שמור את מטאטא א. א. לניתוח הבא.
5. התאוששות מהרדמה
- בסיום ההקלטה, הסירו בזהירות את האלקטרודות מבלי לפגוע בדגים. העבירו את הדג למים של דגים טריים ומחמצן ללא טריקיין.
- כדי להקל על ההחלמה מהרדמה, מים להתיז על הזימים במרץ עם הפיפטה פסטר עד הדג מחדש תנועה הגיל הרגיל או שחייה.
- ניטור הדג להתאוששות מלאה מן ההרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות), כפי שמצוין על ידי היכולת הדג לשחות זקוף לפחות 5 s.
6. פרשנות אק ג
- הגדירו את הגדרות הניתוח.
- דע את ממשק התוכנה (טבלת חומרים) על-ידי קריאת מדריך ההפעלה של תוכנת ניתוח נתוני ה-א.
הערה: למרות שההנחיות הבאות הן ספציפיות לתוכנה המסחרית המשמשת במעבדה שלנו, המשימות הבסיסיות לביצוע הן ביסודו זהה בכל חבילת תוכנה לניתוח א. א. - פתח את תוכנית. ניתוח נתוני א. א מתפריט הקובץ , בחר באפשרות פתח לפתיחת קובץ ה-אק של הריבית והצג את מעקב האק המלא. השתמש בעכבר כדי לגרור קטע מעניין במעקב א. א. לניתוח.
- מתפריט ניתוח א, בחר הגדרות א לפתוח תיבת דו-שיח כדי להגדיר מראש הגדרות פרמטרים שונים עבור ניתוח אוטומטי של תוכנה (איור 5a).
- דע את ממשק התוכנה (טבלת חומרים) על-ידי קריאת מדריך ההפעלה של תוכנת ניתוח נתוני ה-א.
- . לנתח את קצב הלב והקצב
הערה: קצב הלב תלוי בכמה גורמים, כולל גיל דג זברה והזן, סוכני הרדמה (למשל, tricaine, isofלאנה, וכו ') וריכוז, שימוש בהרדמה (סוכן יחיד5,7 לעומת סוכנים משולבים5) ו זמן חשיפה5. לדוגמה, במחקר זה את קצב הלב של 12-18 בחודש בן בסוג פראי-AB הדגים לאחר 3-5 דקות של טבילה ב-0.02-0.04% הפתרון tricaine היה 116 ± 17 פעימות לדקה (n = 9), עקבי עם דוחות ספרות של קצב הלב עבור קבוצת גיל זו ו הרדמה5,7.- לקבוע אם קצב הלב הוא סינוס או לא, רגיל או לא סדיר.
הערה: הנוכחות (או היעדרות) של קצב סינוס מבוססת על הנוכחות (או היעדרות) של גל P זקוף לפני כל qrs על ידי מרווח יחסי הציבור הרגיל (למשל, 60-65 ms עבור ליו et al. של 10-12 חודש בן7 ו 12-18 חודש-סוג פראי של AB דג זברה במחקר זה). הקצב והמקצב החדרית (או אי-סדירות) מבוסס על סדירות (או אי-סדירות) של מרווחי PP או RR רצופים, בהתאמה. - כדי לקבוע את קצב הלב, ודא שהתוכנה מזהה כראוי את כל גלי P ו-R. בהתבסס על הזהויות האוטומטיות הללו (או תיקונים ידניים) של גלי P ו-R, התוכנה מודדת באופן אוטומטי את כל מרווחי ה-PP ו-RR בבחירת הג, מחשבת את ממוצע המרווח כדי להפיק את הקצב והתעריף החדרית.
הערה: שיעור הפרפור הוא מרווח PP הממוצע ואילו הקצב החדרית הוא מרווח RR הממוצע. כדי לקבוע את קצב הלב, זיהוי נכון של גלי P ו-R הוא קריטי. - תקן כל שגיאות זיהוי אוטומטי על-ידי הזזת הסמנים שאינם ממקומם לגלי P ו-R המתאימים (איור 5B).
הערה: אם הלב הוא בקצב סינוס, שיעור הפרפור ושיעור המוח זהים בגלל התכתובת של אחד-לאחד בין גלי P סינוס לבין מכלולי QRS. עם זאת, במקרה של מכבש מלוח (למשל, בטכיקרדיה חדרית או בלוק מדרגה שלישית), התכתבות אחת-אל-אחת בין גלי P לבין מתחמי QRS אבדה; לכן, יש שני שיעורי לב כי שיעור פרפור הוא שונה מקצב חדרית. - לקבוע את קצב הלב בהתבסס על לפחות חמישה מחזורי לב רצופים ברציפות אם קצב הלב הוא רגיל, או רצועה של לפחות 6 שניות אם קצב הלב הוא חריג.
- לקבוע אם קצב הלב הוא סינוס או לא, רגיל או לא סדיר.
- חישוב מרווחי זמן ומשכי גל.
- עבור אל ניתוח ≫ בממוצע התצוגה כדי לשרשר n (למשל, 5) מחזורי לב רצופים לאות ממוצע אחד (איור 5c).
הערה: אם הצורות של א. ג. א של מחזור לב יחיד מתפצל באופן משמעותי מהאות הממוצע, ללמוד כי מחזור הלב בנפרד ללא שרשור. - ודא שהתוכנה מזהה כראוי את ההתחלה והסיום של גל ה-P, מתחם QRS ו-T wave המוצג בחלון ' חישוב ממוצע ' (איור 5C). בהתבסס על הזהויות האוטומטיות האלה (או תיקונים ידניים) של הגלים ומרווחי הזמן הללו, התוכנה מודדת את המשכים בצורה מוגדרת באופן מקובל.
הערה: מרווח יחסי הציבור משתרע מתחילת גל P ועד לתחילת מכלול ה-QRS (או הקומפלקס RS אם גל Q אינו גלוי). המשך QRS משתרע מתחילתו של גל Q (או גל R אם גל Q אינו גלוי) עד סוף גל S (כלומר, נקודת J; איור 1). מרווח QT משתרע מתחילתו של גל Q (או גל R אם גל Q אינו גלוי) עד סוף גל T. לכן, כדי לחשב מרווחי זמן ומשכים, זיהוי נכון של ההתחלה והסיום של גל P, מורכבות QRS ו-R גל הוא קריטי. - תקן כל שגיאות זיהוי אוטומטי על-ידי הזזת הסמנים שאינם במקומם למיקומים המתאימים.
- בחר את השיא השלילי של גל s כסוף של מתחם qrs7 מכיוון הנקודה דג זברה J האותות את סוף גל s יכול להיות קשה במיוחד כדי לזהות במדויק. פעולה זו תגרום לחוסר הערכה קלה של משך הזמן האמיתי של QRS.
הערה: תוכנת ניתוח ה-א מתקנת באופן אוטומטי את מרווח ה-QT לקצב החדרית (או מרווח RR) כדי ליצור את מרווח ה-QT המתוקן QTc באמצעות השיטה שנבחרה מראש על ידי המשתמש בשלב 6.1.3, לדוגמה, בזלת (איור 5A). נוסחת בזלת (1920) Qtc = QT/√ RR היא הפופולרית ביותר והראשונה מבין מספר שיטות שהוצעו כדי לתקן את מרווח ה-QT האנושי לקצב הלב. מכיוון שהדיוק של נוסחת בייזל נחקר, עיין בשיטות אחרות המוצעות לבני האדם10,11 ו-דג זברה6 (איור 5d).
- עבור אל ניתוח ≫ בממוצע התצוגה כדי לשרשר n (למשל, 5) מחזורי לב רצופים לאות ממוצע אחד (איור 5c).
- פענוח חריגות א-ג על-ידי זיהוי חריגים עבור ארבעת קריטריוני האימות בשלב 4.3.
- זהה חריגים עבור קריטריון 1. בהעדר גלי P (המציין את היעדר קצב הסינוס), יש להסתמך על מרווחי ה-RR והמשך ב-QRS כדי לאבחן את קצב הלב. לדוגמה, אם מרווחי ה-RR אינם חריגים בצורה לא סדירה, אבחן פרפור פרוזדורים; אם מרווחי RR הם קבועים והqrs הוא בדרך כלל צר, לאבחן קצב בריחה junctional; מצד שני, אם מרווחי RR הם קבועים ו QRS הוא ממושך באופן חריג, לאבחן קצב הבריחה החדרית.
- זיהוי חריגים עבור קריטריון 2. כאשר גל P הוא שלילי (או הפוכה), לאבחן הפעלת פרפור הנסיגה מתוך קוצב לב רחמי (כגון אתר פרפור במורד הצומת של הסינוס, הצומת מלוח, או החדר).
- זיהוי חריגים עבור קריטריון 3. כאשר גלים גבוהים וצרים הנוכחי עם P שלילית וגלי T שליליים, לאבחן היפוך העופרת בשל בורר שגוי של עמדות האלקטרודה חיוביים ושליליים, כי אלה גלים גבוהים וצרים היו גלים של אמת R הפוכה בטעות (איור 6D ). לעומת זאת, כאשר הגלים רחב Q נוכח גלי P חיובי בעקבות פגיעה משמעותית בליבו, לאבחן אוטם שריר הלב כי אלה גלים רחבים אלה הם האמת הפתולוגית Q גלים.
- זיהוי חריגים עבור קריטריון 4. כאשר גל T הוא הפוך, בדוק הפעלה חדרית כדי לזהות אם סטייה מחודשת החדרית הוא ראשי או משני. להסתמך על התרחיש הקליני כדי לצמצם את האבחנה הנכונה מתוך רשימה דיפרנציאלית של סטייה העיקרי החדרית (מהשפעות התרופה או איסכמיה שריר הלב; איור 6C) לעומת סטייה משנית החדרית (בגלל הפעלה המוח החריג מפני עירור, החדרית ectopy, או הצעדים החדרית).
- ייצוא ממצאי א. ג.
- בחר תצוגת טבלה כדי לסקור את כל מדידות א. ג. בחר את מדידות הריבית שיש להעתיק ולהדביק למסמך הרצוי (לדוגמה, גיליון אלקטרוני של Excel).
- לייצוא מעקב א, הדגש קטע מעניין בניקוי א-אק באמצעות סמל זכוכית המגדלת. העתק והדבק את המסמך הרצוי (לדוגמה, Word או PowerPoint).
Representative Results
איור 1 ממחיש את הרלוונטיות הקלינית של השיטה המוצגת כאן. בתוך vivo המשטח אלקטרוקרדיוגרפיה עבור המבוגר דג זברה הוא כלי הפנוטיפים חיוניים חשמל בגלל הדמיון מדהים בין הדגים האדם ואת א. א. למרות ההבדלים האנטומיים העצומים שלהם. הלב של דג דג זברה יש רק אטריום אחד וחדר אחד בניגוד ללב האדם עם שתי האטריה ושני חללי הגוף (השורה העליונה; ימין ושמאל, בהתאמה). עם זאת, למרות הפשטות האנטומית לכאורה שלה, לב דג זברה משתף מספר תכונות א. א. עם הלב האנושי (השורה התחתונה; ימין ושמאל, בהתאמה) לכן, לב הדגים הגיח כמודל מחליף לליבו של אדם . אלקטרופיזיולוגיה5,12,13 איור 1 ממחיש גל Q קטן אך ברור מן הדגים חי, בריא 14 חודשים העתיקה. עם זאת, ב-א. ג. א., מיצוב העופרת אינו ממוטב בדרך כלל כדי להדגים את גל Q. לכן, גל Q הוא בלתי נראה בדרך כלל, ומתחם RS הוא נראה נפוץ יותר מאשר מתחם QRS מלא ב-א. ג. א.
איור 2 מסכמת את ארבעת צעדי הפעולה החיוניים לביצוע פולשני מינימלית בvivo אלקטרוקרדיוגרפיה למבוגרים בלבד. בעקבות אינדוקציה הרדמה (שלב 1) ומיקום האלקטרודה (שלב 2), הקלטנו אותות א. א בסיסיים (שלב 3) מ-AB בריא פראי סוג הדגים של 12 עד 18 חודשים של גיל (n = 9). טכניקת החדרת האלקטרודה שלנו הייתה רק פולשנית משום שלא היינו צריכים לקלף מאזני דגים או לבצע ביצוע של פתיחת קרום הלב. בעקבות רכישת נתונים, הבחנו ובדקנו באופן ידני כל הקלטה של א. ג. א. כדי למנוע אי התאמות פוטנציאליות על-ידי ניתוח אוטומטי של תוכנה.
איור 3 מציג את שלושת המרכיבים החיוניים של מערכת הרכישה והעיבוד של נתוני ה-אק א: חומרה לרכישת נתונים בעלת ביצועים גבוהים, מגבר דיפרנציאלי בעל מרווח גבוה ומחשב שהועלה עם תוכנה לנתוני א רכישה וניתוח. במעבדה שלנו, התאמתי מסחרית קיימת במערכת הקלטה vivo א שתוכננה במקור עבור דגמי יונקים קטנים (כגון עכברים, חולדות, ארנבים) כדי להכיל את המודל המבוגר בדגים.
איור 4 מדגים כי המיקום המוביל הנכון דורש יישור העופרת עם הציר הראשי הלב המשוער. ב דג זברה ב vivo אק הקלטה, כי רק מוביל אחד בודד משמש, מיקום המוביל הנכון כדי למקסם במקביל הן R ו-T הגברה גל קריטי. כדי למקסם R ו-T הגברה גל המוני, אנו מיישרת את האלקטרודות חיובי ושלילי עם הציר הראשי הלב, ככל הנראה בכיוון השמאלי caudal לכיוון הגולגולת הימנית. בעקבות כריתת האונה ופתיחת קרום הלב כדי לפתוח את שק קרום הלב ולחשוף את הלב, הציר העיקרי הלב הופך לגלוי (איור 4B לבנים קו מקווקו). למעשה, הניתוח לחשיפת הלב הוא אסטרטגיה בשימוש נפוץ כדי להגדיל את היחס אות לרעש7 על המחיר של המרת הקלטת אק מ פולשנית מינימלית לתוך הליך פולשני מאוד.
איור 5 ממחיש שלבים קריטיים בניתוח א. ג. ראשית, הגדרתי מראש את הגדרות הפרמטרים השונות עבור ניתוח אוטומטי של תוכנה באמצעות תיבת הדו הגדרות א (איור 5A). מכיוון שאנו מקימים מחדש ציוד הקלטה של א. א. המיועדים למודלים של יונקים למבוגרים, הגדרת האיתור והניתוח של דגי הדגים אינה זמינה. בחרנו את ההגדרה הקבועה מראש של האדם במקום, בהתחשב בדמיון הבלתי רגיל של א. ק. ל. א האנושי (איור 5A). שנית, אנו מאומתים ידנית את התוכנה הזיהוי האוטומטי של ה-אק ג (בשחור) של פסגות גל R ונכון (באדום) כל שגיאות זיהוי אוטומטי גל-R לפני המפקד התוכנה כדי לחשב מחדש את קצב החדרית הממוצע. לדוגמה, באיור 5B, גל P גדול ביחס גל r שיטה את התוכנה לתוך מטעה את גלי r, המוביל את החישוב האוטומטי אוטומטית של מרווח RR או קצב המוח. לכן, אימות האדם והתיקונים המתאימים בהתאם לצורך הם קריטיים בניתוח א. ג. שלישית, במהירות העריכו את הקצב בקביעות וחישב את המשך הממוצע של גלים ומרווחי זמן באמצעות חישוב ממוצע (איור 5c) לשרשור מספר מחזורי לב רצופים (ירוק) לאות ממוצעת אחת (שחור). כאן באיור 5C, את הסטייה הזניחה בין כל אחד מתשעת מחזורי הלב ואת האות הממוצע מתווכח על הקצב המעולה של הלב הזהבפיש הזה. לבסוף, התוכנה איפשרה לתקן באופן אוטומטי את מרווח ה-QT לקצב הלב באמצעות בזלת, אחת משבע השיטות השונות הזמינות (איור 5D).
איור 6A -C מדגים כיצד עומק של מיקום האלקטרודה משפיע על המוני אותות א. א. א. כאשר הוספת בטעות את האלקטרודות שטחי מדי בצורה שטחית יותר מדי ב-דרמיס (איור 6a), ההובלה הייתה "עקיפה"-כמו (יותר משני קטרים לבבות מהלב, בדומה לאיבר בלתי ישיר של א. א. א. האדם מוביל אני, II, ו III) והמתח אותות היו קטנים. כאשר אנו מוכנסים כראוי את האלקטרודות 1 מ"מ עמוק לתוך השרירים הפקביים (איור 6B), העופרת הפכה" למחצה "(בסמיכות אבל לא במגע ישיר עם הלב) ואותות מתח גדל. צורות גל א-א הפכו לגלויות. עם זאת, כאשר הוספת באופן שגוי את האלקטרודות אפילו עמוק יותר לתוך החדר (איור 6C), העופרת הפכה "ישירה" (במגע ישיר עם הלב) ואותות מתח גדל יותר. גל R משרעת באיור 6C גדל על ידי קיפול שמונה לעומת איור 6c ו-4 קיפול לעומת איור 6c. עם זאת, מעקב א באיור 6C חשף סימנים חדשים של פציעה בשריר הלב, כגון הדיכאון החדש ST היפוך גל חדש.
איור 6D מדגים כיצד האינטפורסטיות יוצא דופן של כל צורות גל א (P, Q, R, S, ו-T) צריך לאותת טעות היפוך הפניה, שבו אלקטרודות חיוביות ושליליות החליפו את המקום. שים לב כי לפי ההגדרה Q ו-S הם תמיד שליליים, ואילו R תמיד חיובי.
איור 6E -F מראה איך עומק הרדמה לא הולמת יכול לפגוע באיכות של vivo אק הקלטה. באיור 6E, הרדמה מספקת (0.017% tricaine) הובילו לכישלון לשתק את הדגים באופן מוחלט. ממצאים של התנועה הנובעת מהורדת יחס האות לרעש על-ידי שניהם מזהם את האות (כוכבית) ומגדילים את הרעש (חיצים). לעומת זאת, באיור 6F, הרדמה ממנת יתר (0.08% tricaine) המושרה בקצב לב איטי בסינוסים, כמו גם שינויים של קטע ST ו גל.
איור 1: אנטומיה מנוגדים ו-אק ג של לבבות בני אדם ודגים. בניגוד ללב האנושי עם שתי האטריה ושני חללי הגוף, לב הדגים יש רק אטריום אחד וחדר אחד (בשורה העליונה). קיצורים: RA, אטריום ימני; LA, אטריום שמאל; . קרוואן, חדר ימני LV: חדר שמאל. לב הדגים משתף מספר תכונות משותפות של א. א. עם לב האדם (בשורה התחתונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פולשני מינימלית בפרוטוקול ההקלטה vivo. תרשים זרימה סכמטי ממחיש ארבעה צעדי פעולה קריטיים בניהול חקירה בvivo א: לגרום להרדמה, להציב אלקטרודות לעופרת של א. ג. א ולנתח את ההקלטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מערכת הרכישה והעיבוד של נתונים. שלושת המרכיבים העיקריים של מערכת הקלטה משולבת בvivo א כוללים חומרה לרכישת נתונים, מגבר ותוכנת מחשב לצורך רכישת נתונים וניתוח. המגבר מגיע עם שלושה מוכנים לשימוש 29 מד מיקרואלקטרודות נירוסטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: . מיקום עופרת- אק 3 29-כיול מקודד צבע אלקטרודות נירוסטה מוכנסים באופן מאובטח לתוך השרירים דגים כ 1 מ"מ לעומק. מיקום השלילי (שחור) האלקטרודה והאלקטרודה החיובית (אדום) קובע עופרת דו-קוטבית במישור הקדמי, לאורך caudal שמאל לכיוון הגולגולת הימנית. קיצור: ref, אלקטרודה הפניה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: C צעדים בניתוח א. א. (א) הגדר מראש את הגדרות הפרמטרים השונות עבור ניתוח אוטומטי של תוכנה. (ב) נכון באופן ידני (אדום) שני מיסיומגיה אוטומטית על-ידי התוכנה (שחור) של גלי P ו-R כדי לתקן את התוכנה שחישוב מוטעה של הקצב ואת שיעור המוח. (ג) לשרשר תשעה מחזורי לב רצופים (ירוק) לתוך אות ממוצע אחד (שחור) כדי להעריך במהירות regularities/חריגות הקצב ולחשב את המשכים הממוצעים של גלים ומרווחי זמן. (ד) תקן את מרווח ה-QT לקצב הלב באמצעות אחת מהשיטות השונות, כגון בזלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השפעות מיקום העופרת ועומק ההרדמה על אותות א. א. שני השלבים הקריטיים ביותר הקובעים את ההצלחה של הקלטת vivo א הם מיקום מוביל (A-D) ואת עומק ההרדמה (E-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
כאשר ההקלטה vivo א ' ל דג זברה מבוגרים באמצעות מוביל אחד כפי שהדגמנו במחקר זה, יש מספר האזהרות בנוגע לאיכות ולתוקפו של תוצאות ההקלטה א. א. א. ראשית, בבחירת ההרדמה המתאימה וקביעת ריכוז מינימלי ההרדמה הדרושים, עומק, ומשך, איזון cardiotoxicities הרדמה נגד הצורך הקריטי כדי לדכא את ממצאים התנועה ואת הנחישות פריורי ל הישרדות לעומת תכנון ניסיוני מסוף. הוספת ההשפעה על העוצמה הסינגיסטית של שילוב של חומרי הרדמה מרובים משיעורי סמים שונים5,14 ו משתק1,6 כדי להקטין את המינון של סוכנים בודדים5 או ניהול מינון תחזוקה נמוכה בעקבות מינון אינדוקציה גבוה יותר הם אסטרטגיות טיפוסיות. עם זאת, למרות הפוטנציאל הידוע הנודע שלו toxicities, כולל המוות8, tricaine הוא עדיין הנפוץ ביותר, הטוב ביותר הזמין, ואת ההרדמה היחידה שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) עבור דג דג זברה רדמה. Tricaine כבר בשימוש העממי הקלטה של בוגרים דג זברה או כסוכן יחיד או בשילוב עם הרדמה אחרת או משתק.
שנית, דיוק המיקום הראשי יכול להיות מובטחת לפחות עבור בריאה בריא דג זברה באמצעות הקריטריונים שלנו בארבע אימות עבור מבוגר נורמלי בדג א. מבין ארבעת הקריטריונים לאימות שאנו מציעים כאן, שני הקריטריונים האחרונים יחד לאשר את הקונקורדנציה הבסיסית בין הקוטביות של גל ה-R והגל של ה-T בתוך א רגיל5,7,15. זו הקונקורדנציה של R ו-T הוא מקרי, עדיין קריטי, הדמיון בין זברפיש והאדם16,17 א ' א רגיל שתורם לרלוונטיות הקלינית של המודל לב דג זברה כפונדקאית ללב האדם אלקטרופיזיולוגיה. עם זאת, מספר תנאים שפירים או ממאירים עלולים לפסול כל אחד מארבעת הקריטריונים לאימות. לדוגמה, הקונקורדנציה R ו-T אבדו באיסכמיה של אוטם שריר הלב7,15. אובדן זה של R ו-T הקונקורדנמיה אוטם שריר הלב הוא דמיון נוסף מרשים בין הדגים דג זברה ו-אק ג האנושי שתורם לרלוונטיות הקלינית של המודל אוטם שריר הלב דג זברה.
לבסוף, אנו ממליצים על פרקטיקה סטנדרטית בניתוחי א. א. עם הופעתו של הטכנולוגיה, תוכנת ניתוח א. א. ב. יכולה ליצור פרשנות אוטומטית של א. א. עם זאת, אנו ממליצים מאוד כי בני אדם מיומנים צריכים תמיד לפרש מחדש ולאמת את כל ECGs מבוסס על התרחיש הקליני המתאים המוביל הקלטה אק. הסתמכות שגרתית על פרשנות אוטומטית באופן אוטומטי על-ידי תוכנת ניתוח א-א מומלצת, בעיקר בנוכחות של משתני א-א רגילים, בפתווגיות לב, או במיקום מוביל מיטבי.
מחקר זה מתמקד שיטה מינימלית פולשנית לפגישות קצרות הקלטה. עם זאת, יש צורך להתעורר הפעלות הקלטה ממושכת של א. א. שעות העבודה, שינויים נחוצים כדי לספק חמצן מספקת, לחות, והרדמה על ידי זלוף רציף6.
בנוסף, הגבר את היחס בין האות לרעש באחת לפחות משלוש דרכים. בחירת מגבר חזק יותר היא לעתים קרובות יקר, אם לא מעשי, אופציה. פתיחת שק קרום הלב כדי להפחית את מנצח עוצמת הקול היא סבירה, למרות פולשנית, גישה שאומצה7. מיקום מוביל אסטרטגי כדי ליישר את ציר העופרת בכיוון המקביל לציר הלב הראשי (איור 4B) יביא להגדלת אותות המתח של ה-אק ג, אך הדבר עלול לדרוש ניסוי וטעייה, במיוחד בהיעדר המשך הפיום.
שיטת החקירה הvivo של א. ג. א. בוגרים שהוצגו כאן מציעה ארבעה יתרונות עיקריים. ראשית, הגישה פולשנית שלנו דורש רק החדרת אלקטרודה, אבל לא הסרת בקנה מידה של דגים או להסרת כריתת קרום החזה. לכן, על ידי מזעור הכאב לדגים, הגישה שלנו מאפשרת חקירות א חוזרות ונשנות במחקרי הישרדות האורך. שנית, כאשר הרדמה כראוי לדכא את תנועת הדגים, מערכת ההקלטה vivo א במחקר שלנו בעקביות מניב יחס אות לרעש משביע רצון עם אותות raw ללא רעש. שלישית, בדיקת האיכות של ארבעת הקריטריונים שאנו מציעים כאן מבטיחה דיוק נתונים וחוסן מוקדם ברכישת נתוני ה-א ומזעור וריאציות תלויות-מרכזיה. לבסוף, במיוחד, הקריטריון האחרון שלנו אימות (t הרגיל גל הוא זקוף) מחלק את הקונקורדנציה של גל R ו-t גל, תכונה חשובה של אדם כמו דג דג זברה רגיל (איור 1).
עם זאת, עדיין קיימים ארבעה מגבלות עיקריות לנוכחי במתודולוגיה vivo א עבור דגי מבוגרים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים.
ראשית, חוסר שיתוף הפעולה מחייב את הצורך בהרדמה עם ההשלכות המגבילות הרעילות שלו. עבור בחקירה vivo, בעוד המטופלים האנושיים לעולם לא צריך הרגעה, דגי הדגים תמיד דורשים הרדמה או משתק, כולם לגרום למחלה משתנה של רעלים.
שנית, הצורך לאבטח את ה-אק א המצורף מרומם מעט את הפלישה של הליך לא פולשני אחרת. בעוד מיקום העופרת בהקלטת הגוף הקלטה א של בני אדם הוא לגמרי לא פולשני כי אלקטרודות לדבוק האפידרמיס האנושית, המיקום המוביל בהקלטה vivo א של דג דג זברה הוא פולשני יותר כי, לכל הפחות, אלקטרודות פלדה חייב נקב את עור הדג לכניסה מאובטחת לתוך השרירים הדגים.
שתי המגבלות האחרונות נובעות האילוצים האנטומיים של החזה והלב דג זברה. שלישית, הגודל הזעיר של לב הדגים המבוגר מחייבת ירידה דרסטית במספר מוביל ה-אק ג. בעוד בני אדם להכיל שנים עשר מוביל בהקלטת התקן א רגיל, דג זברה מבוגרים יכול בדרך כלל להכיל רק אחד יחיד הקצה הקוטבי או דו קוטבית. הרמיפיקציה של עופרת אק ג בודד היא האתגר למטב במקביל את הגברה של כל שלושת P, R ו-T גלים. מכאן, החשיבות של מיקום העופרת האופטימלי והמדויק בחקירת א. א. א. לא ניתן לציין ביתר. ב-zebrafish, גל T מציג אתגר זיהוי ייחודי כי הוא לעתים קרובות הקטן מבין שלושת הגלים האלה. לכן, משרעת הגל T של דג דג זברה צריך לקבל עדיפות אופטימיזציה מעל גלי P ו R הגדול בדרך כלל.
רביעית, קביעת ציר הלב הראשי דג זברה כדי למקסם את משרעת גל R יכול להיות מאתגר. הסיבה לכך היא כי לב דג זברה יש יותר חופש תנועה בתוך שק הלב הרופף שלה לעומת הלב האנושי בתוך הצורה המתאימה הכפפה שלה, כמו קרום הלב.
באופן כללי, מגבלות אלה יעוררו חדשנות בשיטה עתידית. עם הופעתו של הדפסה תלת-ממדית ואלקטרוניקה deformable18, יש תקווה השתלת עופרת ישירה יום אחד ער, התראה, דג שחייה באמצעות ' גרב לב ' של חיישני האלקטרודה האלחוטית.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות R01 HL141452 כדי TPN. Adאינסטרומנטס סיפקה באדיבות מימון נדיב כדי לבטל את העלות של פרסום גישה פתוחה, אך לא היה כל תפקיד בתכנון ניסיוני, רכישת נתונים, ניתוח נתונים של מחקר זה או כל גישה לכתב היד לפני הפרסום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
| Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
| FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
| Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
| LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
| Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
| Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
| PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
| Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |
References
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Hassel, D., et al. Deficient zebrafish ether-a-go-go-related gene channel gating causes short-QT syndrome in zebrafish reggae mutants. Circulation. 117 (7), 866-875 (2008).
- Meder, B., et al. Reconstitution of defective protein trafficking rescues Long-QT syndrome in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communication. 408 (2), 218-224 (2011).
- Sieber, S., et al. Zebrafish as a preclinical in vivo screening model for nanomedicines. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2019).
- Lin, M. H., et al. Development of a rapid and economic in vivo electrocardiogram platform for cardiovascular drug assay and electrophysiology research in adult zebrafish. Science Reports. 8 (1), 15986 (2018).
- Milan, D. J., Jones, I. L., Ellinor, P. T., MacRae, C. A. In vivo recording of adult zebrafish electrocardiogram and assessment of drug-induced QT prolongation. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 291 (1), H269-H273 (2006).
- Liu, C. C., Li, L., Lam, Y. W., Siu, C. W., Cheng, S. H. Improvement of surface ECG recording in adult zebrafish reveals that the value of this model exceeds our expectation. Science Reports. 6, 25073 (2016).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Sagie, A., Larson, M. G., Goldberg, R. J., Bengtson, J. R., Levy, D. An improved method for adjusting the QT interval for heart rate (the Framingham Heart Study). American Journal of Cardiology. 70 (7), 797-801 (1992).
- Luo, S., Michler, K., Johnston, P., Macfarlane, P. W. A comparison of commonly used QT correction formulae: the effect of heart rate on the QTc of normal ECGs. Journal of Electrocardiology. 37 Suppl, 81-90 (2004).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels (Austin). 10 (2), 101-110 (2016).
- Tsai, C. T., et al. In-vitro recording of adult zebrafish heart electrocardiogram - a platform for pharmacological testing). Clinica Chimica Acta. 412 (21-22), 1963-1967 (2011).
- Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of American Association of Lab Animal Sciences. 53 (2), 198-203 (2014).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Disease Model and Mechanism. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Franz, M. R., Bargheer, K., Rafflenbeul, W., Haverich, A., Lichtlen, P. R. Monophasic action potential mapping in human subjects with normal electrocardiograms: direct evidence for the genesis of the T wave. Circulation. 75 (2), 379-386 (1987).
- Chiale, P. A., et al. The multiple electrocardiographic manifestations of ventricular repolarization memory. Current Cardiology Reviews. 10 (3), 190-201 (2014).
- Xu, L., et al. 3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium. Nature Communications. 5, 3329 (2014).
