Summary
여기에서, 우리는 살아있는 마취된 성숙한 얼룩말어에 있는 심전도를 기록하고 해석하는 믿을 수 있고, 최소침습, 비용 효과적인 방법을 제시합니다.
Abstract
성인 얼룩말물고기와 인간의 심전도 파형은 현저하게 유사합니다. 이러한 심전도 유사성은 인간의 심장 전기 생리학 및 근병증에 대한 연구 모델뿐만 아니라 잠재적 인 심장 독성에 대한 높은 처리량 제약 스크리닝의 대리 모델로제브라피쉬의 가치를 향상시킵니다. QT 연장과 같은 인간. 이와 같이, 성인 제브라피시에 대한 생체 내 심전도는 생체 내 전기 생리학적 특성화에서 단면 또는 세로에 필수적이지 않은 경우 필요한 전기 표현형 도구이다. 그러나, 너무 자주, 신뢰할 수 있는, 실용적인, 그리고 비용 효율적인 기록 방법의 부족 이 생체 내 진단 도구더 쉽게 액세스할 수 없게 하는 주요 도전 남아. 여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 기록을 생성하는 낮은 유지 보수, 비용 효율적이고 포괄적인 시스템을 사용하여 성인 제브라피시를 위한 생체 내 심전도에 대한 실용적이고 간단한 접근 방식을 설명합니다. 우리는 생후 12-18개월의 건강한 성인 남성 얼룩말어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 또한 심전도 기록 프로세스 초기에 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 실시간 해석 전략을 도입했습니다.
Introduction
제브라피시(Daniorerio)심장은 피퍼럼과 가슴 거들 사이의 흉강으로 전방에 위치한다. 마음은 은색 의 회낭 안에 오히려 느슨하게 둘러싸여 있습니다. 해부학적으로, 제브라피쉬 심장은 작은 규모 (인간의 심장보다 100 배 작은)와 하나의 심방과 하나의 심실로 구성된 2 개의 챔버 구조로 인해 4 챔버 인간 및 기타 포유류 심장과 다릅니다. 그럼에도 불구하고, 심전도(ECG) 파형 및 두 종의 QT 간격의지속 기간은 현저하게 유사하다(도 1). 이에 따라, 제브라피쉬는 인간 상속 부정맥 1,2,3 및 잠재적 인 인간 심장 독성의 고처리량 약물 스크리닝을 위한 인기있는 모델로 부상하고있다 4,5 QT 연장과 같은.
인간의 심장 질환의 일상적인 평가에서, 신체 표면 심전도는 1903 년에 아인토벤에 의해 발명 된 이후 가장 광범위하게 사용되는 첫 번째 라인 비 침습적 진단 도구가되었다. 대조적으로, 2006년 6년 6년 성체 얼룩말어에 대한 체표면 심전도 기록 방법의 첫 번째 적응 이후,이기술은 현장에서 많은 연구자들이 접근할 수 없는 상태로 남아 있다. 이 동물 모델의 인기. 성인 얼룩말물고기에 대한 생체 내 심전도 심문을 수행 한 다른 연구원의 경우, 운영자 들 간의 넓은 변화는 다른 연구에서 심전도 발견의 불일치로 이어졌다. 일반적인 이유는 성가신 고가의 특수 장치 및 소프트웨어, 낮은 신호 대 잡음 비율, 전극 배치에 대한 혼란, 성인 제브라피시 ECG 기능의 불완전한 이해에 의해 더욱 악화 및 기본 조직 메커니즘. 생체 내 심전도가 전기적으로 표현형 살아있는 얼룩말어에 유일한 진단 도구임을 감안할 때, 감도 및 특이성, 재현성 및 접근성을 개선하기 위한 표준화된 방법에 대한 명확한 필요성이 있습니다.
여기서, 우리는 생체 내 심전도에서 제브라피시를 기록하고 해석하기 위한실용적이고 신뢰할 수 있고 검증된 접근법을 제시합니다(그림 2). 정면 평면에서 단일 양극성 리드를 사용하여, 우리는 살아있는 마취 건강한 야생 형 AB 성인 얼룩말피의 심전도 파형 및 간격 기간의 변화를 조사했다.
Protocol
이 연구에서 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 따라 실시 되었다. 이 연구결과에 있는 모든 동물 프로토콜은 UCLA 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 실험 설정의 준비
- 28 °C ± 0.5 °C에서 14 시간 빛, 10 h 어두운 광주기에 흐름을 통해 수족관 시스템에서 제브라피시를 유지합니다. 매일 플레이크 음식과 라이브 소금물 새우(아르테미아 nauplii)를하루에 두 번 먹이. 본 연구에서 제브라피쉬는 UCLA 제브라피쉬 코어에 의해 유지및 공급되었습니다.
- 실험 당일, 수족관에서 실험실로 얼룩말 물고기를 운반합니다.
- 필수 장비의 일부를 연결하고 앰프의 3가지 색상 일치 액세스 포털에 3개의 컬러 코딩스테인리스 스틸 전극을 삽입하여 생체 내심전도 기록 시스템을 설정합니다(그림 3). ECG 기록 및/또는 분석 세션이 시작될 때 시스템을 시작합니다.
- 타이머/스톱워치, 생선, 집게, 가위, 파스퇴르 피펫 및 문화 요리(100mm x 20mm)를 담을 수 있는 슬릿이 있는 젖은 스폰지와 같은 필요한 도구를 조달합니다.
2. 마취 유도
- ECG 데이터 수집 중에 모션 아티팩트를 피하기 위해 통증 제어 및 물고기 고정을 위한 침지 마취를 준비합니다. 대부분의 실험실은 침지 트리카인 (에틸 3-아미노 벤조에이트 메탄설포네이트, MS-222)을 사용합니다.
- 트리카인 을 0.4 % 스톡 용액으로 만들려면, 스크류 캡 어두운 유리 병에 다음 항목을 결합 : 트리카인 분말 400 mg, 이중 증류수 98 mL, 1 M Tris (pH 9)의 2 mL. 필요에 따라 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH 7.0으로조정8.
- 트리카인 최종 침지 용액을 만들려면 제브라피쉬 나이 9,크기, 대사 상태, 변형, 질병 모델, 과학적 목표 및 절차 기간에 적합한 최소 농도를 결정합니다.
- 트리카인 농도 응답 연구를 수행, 의 권장 농도에서 위 또는 아래로 적정 168 mg/L (또는 0.0168%)9 필요한 경우, 내에서 마취의 수준 4를 달성하기 위해 3 분 이내에 가능한 가장 적은 심장 호흡 독성. 예를 들어, 본 연구에서, 생후 12-18개월의 야생형 AB 제브라피시를 0.02-0.04% 트리카인 용액에 담그는 것은 3분 이내에 마취의 레벨 4를 유도할 것이다.
참고 : 마취의 수준 4에서 평형과 근육 톤이 완전히 손실되고 안구 운동 속도가8감소합니다. - 필요한 경우, 마취제 선택의 적합성 및 투여 경로에 대한 추가 지침은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 수의사와 상의하십시오.
- 성인 제브라피시를 가장 낮은 소정의 및 IACUC 승인 농도(예: 본 연구에서 0.02-0.04%)의 트리카인 용액을 함유한 접시에 담그고3분 이내에 마취의 레벨 4를 유도합니다(그림 2).
- 생존 심전도 프로토콜의 경우, 심전도 기록 세션을 가능한 한 짧게 유지하십시오(10분 미만). 15분 미만의 짧은 심전도 기록 세션의 경우 마취 유지보수가 필요하지 않습니다.
- 긴 심전도 기록 세션 지속 시간 동안, 충분한 수화 및 산소를 제공하기 위해 긴 연기근육 중마비 및 경구 관류 시스템을 사용하여 6.
3. 심전도 리드 배치
- 일단 제브라피쉬가 3s의 마취 수준 4를 유지하면, ECG 납 전극의 배치를 위해 복부 표면이 있는 젖은 스폰지 슬릿에 즉시물고기를 옮기기 위해 무딘 집게 한 쌍을 사용합니다(그림 4).
- 세 개의 심전도 리드 전극을 물고기 근육에 약 1mm 깊이로 부드럽게 삽입하여 심장 주축의 왼쪽 꼬리 오른쪽 두개골 방향과 평행한 정면 평면에 양극성 리드를 설정합니다.
- 전구 동맥의 수준에서 복부 중간선에 양수(빨간색) 전극을 위치, 즉, 1-2 mm 에서 오퍼컬럼의 두 하부 가장자리를 연결하는 가상선 위에 (그림4A).
- 음의 전극을 좌측으로 0.5-1.0 mm를 양극에 좌측으로 위치시키고, 성체 얼룩말 심실의 최대 양액 점액질 보다 큰 거리에서(도4A).
- 기준 (녹색) 전극을 항문 영역 근처에 caudally 배치합니다.
참고 : 심장 주축은 물고기마다 다소 다르기 때문에 R 및 T 파진을 최대화하기 위해 시행 착오를 통해 작고 체계적인 변화만하여 리드 위치를 조정합니다. 예를 들어, 한 번에 두 전극 대신 하나의 전극(양극 또는 음수)을 변경하고 임의의 방향으로 불규칙한 변경을 하는 대신 다른 방향으로 변경하기 전에 지정된 방향으로 점진적으로 변경합니다.
4. 심전도 기록
- 심전도 데이터 수집 프로그램을 엽니다. 범위, 로우 패스 및 하이 패스에 대한 드롭다운 메뉴에서 원하는 설정을 선택합니다. 예를 들어, 본 실험에 사용된 생체 내 심전도 기록 시스템에서 다음 설정은 일반 성체 얼룩말어에 대해 일관되고 만족스러운 신호 대 잡음 비를 산출합니다: 범위 "2 mV", 로우 패스 "120 Hz", 및 하이 패스 "0.03 s".
- 1kHz의 샘플링 속도로 연속 갭 없는 심전도 녹화를 시작하려면 시작을 누릅니다.
- 최대 신호 대 잡음 비를 위해 리드 포지셔닝을 최적화하려면 정지를 눌러 심전도 기록을 중지하고 각 심장에 대한 첫 번째 기록 시도 직후 심전도 추적을 검토합니다. 성체 얼룩말 피시 심전도 정상임을 진단하기 위해 다음 네 가지유효성 검사 기준이 모두 충족되어 있는지 확인합니다 (그림 1)
- 기준 1: 모든 ECG 파형(P, QRS 및 T)이 뚜렷하고 쉽게 볼 수 있는지 확인합니다.
- 기준 2: P 웨이브가 양수인지 확인합니다.
- 기준 3: 순 QRS 복합체가 양수인지 확인합니다(즉, R파 진폭이 Q 및 S 파 진폭의 합보다 큽니다).
- 기준 4: T 웨이브가 양수인지 확인합니다.
- 정상적인 심전도가 예상되는 경우, 네 가지 검증 기준이 모두 충족될 때까지 필요한 경우 전극을 재배치합니다(음극을 먼저 사용해 보십시오).
- 정상적인 T 파가 예상되지만 T 파가 너무 작으면 전극을 재배치하여 T 파 진폭을 최대화합니다.
- 리드 포지셔닝을 최적화한 후 심전도 기록을 다시 시작합니다. 후속 분석을 위해 심전도 스윕을 저장합니다.
5. 마취에서 회복
- 심전도 기록 세션이 끝나면 물고기를 손상시키지 않고 조심스럽게 전극을 제거하십시오. 생선을 트리카인이 없는 신선하고 산소가 공급된 생선물로 옮김을 옮김.
- 마취로부터 회복을 촉진하기 위해, 물고기가 규칙적인 아가미 운동이나 수영을 재개 할 때까지 파스퇴르 피펫으로 아가미에 물을 힘차게 분출하십시오.
- 적어도 5 s에 대 한 똑바로 수영 하는 물고기 능력에 의해 표시 된 마 취 (일반적으로 1-2 분)에서 전체 복구에 대 한 물고기를 모니터링 합니다.
6. 심전도 해석
- 해석 설정을 정의합니다.
- 심전도 데이터분석 소프트웨어의 작동 설명서를 읽고 소프트웨어 인터페이스(재료 표)를 알 수 있습니다.
참고: 아래 지침은 당사 실험실에서 사용되는 상용 소프트웨어에 만연하지만, 달성해야 할 기본 작업은 본질적으로 ECG 분석을 위한 모든 소프트웨어 패키지에서 동일합니다. - 심전도 데이터 분석 프로그램을 엽니다. 파일 메뉴에서 열기를 선택하여 관심 있는 ECG 파일을 열고 전체 심전도 추적을 표시합니다. 마우스를 사용하여 ECG 추적에서 관심 있는 부분을 드래그하여 분석합니다.
- 심전도 분석 메뉴에서 심전도 설정을 선택하여 대화 상자를 열어 소프트웨어 자동 분석을 위한 다양한 매개변수 설정을 미리 정의합니다(그림5A).
- 심전도 데이터분석 소프트웨어의 작동 설명서를 읽고 소프트웨어 인터페이스(재료 표)를 알 수 있습니다.
- 심장 리듬과 속도를 분석합니다.
참고: 심박수는 제브라피쉬 연령 및 균주, 마취제(예: 트리카인, 이소플루란 등) 및 농도, 마취 사용량(단일 제제5,7 대 결합제5)및 노출 시간5. 예를 들어, 본 연구에서 는 0.02-0.04% 트리카인 용액에 3-5분 간 침지한 후 12-18개월 된 야생형 AB 제브라피쉬의 심박수는 분당 116±17회(n=9)였으며, 이 연령대에 대한 심박수의 문헌 보고와 일치하고 마취 5,7.- 심장 리듬이 부비동인지 아닌지, 규칙적인지 불규칙한지 결정합니다.
참고: 부비동 리듬의 존재(또는 부재)는 정상적인 PR 간격에 의해 각 QRS 앞에 있는 수직 P파의 존재(또는 부재)를 기반으로 합니다(예: 이 연구에서 는 10-12개월 된7개월 및 12-18개월 된 야생형 ABfish에 대한 60-65ms). 심방 및 심실 리듬 규칙성(또는 불규칙성)은 각각 연속적인 PP 또는 RR 간격의 규칙성(또는 불규칙성)에 기초한다. - 심박수를 확인하려면 소프트웨어가 모든 P 및 R 파를 올바르게 식별했는지 확인하십시오. P 및 R 파의 이러한 자동 식별(또는 수동 보정)을 기반으로 소프트웨어는 심전도 선택의 모든 PP 및 RR 간격을 자동으로 측정하고 심방 및 심실 속도를 생성하는 간격 평균을 계산합니다.
참고: 심방 비율은 평균 PP 간격인 반면 심실 비율은 평균 RR 간격입니다. 심박수를 결정하려면 P 파와 R 파의 정확한 식별이 중요합니다. - 잘못 배치된 커서를 적절한 P 및 R 파동(그림5B)으로이동하여 자동 식별 실수를 수정합니다.
참고 : 심장이 부비동 리듬에있는 경우, 심방 속도와 심실 속도는 부비동 P 파와 QRS 복합체 사이의 일대일 대응때문에 동일합니다. 그러나, 방실 해리의 경우 (예를 들어, 심실 빈맥 또는 3도 방실 블록에서), P 파와 QRS 복합체 사이의 이 일대일 대응은 손실됩니다; 따라서 심방 비율이 심실 속도와 다르기 때문에 두 가지 심박수가 있습니다. - 심장 리듬이 규칙적인 경우 적어도 5회 연속 완전한 심장 주기에 따라 심박수를 결정하거나 심장 리듬이 불규칙한 경우 최소 6초의 스트립을 결정합니다.
- 심장 리듬이 부비동인지 아닌지, 규칙적인지 불규칙한지 결정합니다.
- 간격 및 웨이브 지속 시간을 계산합니다.
- ECG 분석 > 평균 보기로 이동하여 n(예를 들어, 5) 연속적인 심장 주기를 단일 평균 신호로 연결합니다(그림 5C).
참고: 개별 심장 주기의 심전도 파형이 평균 신호와 크게 차이가 나는 경우, 연결없이 심장 주기를 별도로 연구하십시오. - 소프트웨어가 평균 뷰 창(그림 5C)에 표시되는 P파, QRS 컴플렉스 및 T파의 시작과 끝을 올바르게 식별해야 합니다. 이러한 파도와 간격의 이러한 자동 식별 (또는 수동 수정)에 따라, 소프트웨어는 자동으로 기존의 정의 된 대로 기간을 측정합니다.
참고: PR 간격은 P파의 시작부터 QRS 컴플렉스(또는 Q파가 보이지 않는 경우 RS 복합체)의 시작까지 확장됩니다. QRS 지속 시간은 Q웨이브의 시작으로부터(또는 Q파가 보이지 않는 경우 R파)로부터 S파(즉, J포인트)의 끝까지 연장된다. 그림1). QT 간격은 Q 웨이브의 시작부분(또는 Q웨이브가 보이지 않는 경우 R파)에서 T파의 끝까지 연장됩니다. 따라서 간격과 지속 시간을 계산하려면 P파, QRS 복합체 및 R파의 시작과 끝을 올바르게 식별하는 것이 중요합니다. - 잘못 배치된 커서를 적절한 위치로 이동하여 자동 식별 실수를 수정합니다.
- S파의 단말을 신호하는 제브라피시 J포인트가 특히 정확하게 식별하기 어려울 수 있기 때문에 QRS 복합체7의 끝으로 S파의 음의 피크를 선택한다. 이렇게 하면 실제 QRS 기간이 약간 과소평가됩니다.
참고: 심전도 분석 소프트웨어는 6.1.3단계에서 사용자가 미리 선택한 방법을 사용하여 보정된 QT 간격 QTc를 생성하기 위해 심실 속도(또는 RR 간격)로 QT 간격을 자동으로 보정합니다(예: Bazett(도5A). Bazett의 공식 (1920) QTc = QTC / √RR은 가장 인기 있고 심박수에 대한 인간 QT 간격을 해결하기 위해 제안된 여러 가지 방법 중 첫 번째입니다. Bazett의 공식의 정확성에 의문을 제기했기 때문에, 인간10,11 및 제브라피시6 (그림5D)에대해 제안된 다른 방법을 참조하십시오.
- ECG 분석 > 평균 보기로 이동하여 n(예를 들어, 5) 연속적인 심장 주기를 단일 평균 신호로 연결합니다(그림 5C).
- 4.3단계에서 4개의 검증 기준에 대한 예외를 인식하여 심전도 이상을 해석합니다.
- 기준에 대한 예외를 인식 1. 어떤 P 파의 부재 (부비동 리듬의 부재를 나타내는), 심장 리듬을 진단 하는 RR 간격 및 QRS 기간에 의존. 예를 들어, RR 간격이 불규칙하게 불규칙한 경우 심방 세동을 진단하십시오. RR 간격이 규칙적이고 QRS가 일반적으로 좁은 경우, 접합 탈출 리듬을 진단; 다른 한편으로는, RR 간격이 정규이고 QRS가 비정상적으로 머리말을 붙인 경우에, 심실 탈출 리듬을 진단합니다.
- 기준에 대한 예외를 인식 2. P 파가 음수(또는 반전)인 경우, 자궁외 심박동기(예: 부비동 노드의 심방 부위 하류, 내실 노드 또는 심실)에서 역행식 심방 활성화를 진단합니다.
- 기준에 대한 예외를 인식 3. 음의 P와 음의 T 파와 함께 존재하는 키가 크고 좁은 Q 파동이 음수 P와 음의 T 파동으로 존재할 때, 그 키가 크고 좁은 Q 파가 실수로 반전된 진정한 R 파이기 때문에 양극 및 음극 위치의 잘못된 스위치로 인해 리드 반전을 진단합니다 (그림6D ). 대조적으로, 넓은 Q 파는 중요한 심장 상해 다음 양성 P 파와 함께 제출할 때, 그 넓은 Q 파는 참병리학적인 Q 파이기 때문에 심근 경색을 진단합니다.
- 기준에 대한 예외를 인식 4. T 파가 반전되면 심실 활성화를 검사하여 심실 재분극 이상이 1 차 또는 이차인지 여부를 확인합니다. 1 차적인 심실 재분극 이상의 차동 목록에서 정확한 진단을 좁히기 위하여 임상 시나리오에 의존합니다 (약 효력 또는 심근 허혈에서; 그림 6C) 대. 이차 심실 재분극 이상 (전 여기에서 비정상적인 심실 활성화로 인해, 심실 ectoy, 또는 심실 간격).
- 심전도 조사 결과를 내보냅니다.
- 모든 심전도 측정을 검토하려면 테이블 뷰를 선택합니다. 원하는 문서(예: Excel 스프레드시트)에 복사하여 붙여넣을 관심 측정값을 선택합니다.
- ECG 추적을 내보내려면 돋보기 아이콘을 사용하여 ECG 스윕에 대한 관심 부분을 강조 표시합니다. 복사하여 원하는 문서(예: Word 또는 PowerPoint)에 붙여넣습니다.
Representative Results
도 1은 여기에 제시된 방법의 임상적 관련성을 도시한다. 성체 얼룩말 피시에 대한 생체 내 표면 심초음파는 거대한 해부학적 차이에도 불구하고 제브라피시와 인간 심전도 사이의 현저한 유사성 때문에 필수적인 전기 자표명 도구입니다. 제브라피시 심장에는 두 개의 심방과 두 개의 심실을 가진 인간의 심장과 는 달리 하나의 심방과 하나의 심실이 있습니다 (상단 행; 오른쪽과 왼쪽, 각각). 그러나, 그것의 명백한 해부학적인 단순함에도 불구하고, zebrafish 심혼은 인간적인 심혼 (맨 아래 행; 좌우, 각각) 따라서, zebrafish 심혼을 위한 대리 모형으로 나타났습니다 몇몇 ECG 특징을 공유합니다 전기 생리학5,12,13. 그림 1은 14개월 된 건강한 제브라피시의 작지만 뚜렷한 Q 웨이브를 보여줍니다. 그러나 제브라피쉬 심전도에서 리드 포지셔닝은 일반적으로 Q파를 시연하기 위해 최적화되지 않습니다. 따라서, Q파는 일반적으로 보이지 않으며, RS 복합체는 제브라피시 심전도의 전체 QRS 복합체보다 더 일반적으로 볼 수 있다.
도 2는 성체 제브라피시에 대한 생체 내 심전도에서 최소침습을 수행하기 위한 4가지 필수 작용 단계를 요약한 것입니다. 마취 유도(1단계) 및 전극 배치(2단계)에 이어, 12~18개월의 건강한 야생형 AB 제브라피시로부터 기준선 심전도 신호(3단계)를 기록하였다(n=9). 우리의 전극 삽입 기술은 우리가 물고기 비늘을 벗기거나 심근 절제술을 수행 할 필요가 없기 때문에 최소 침습적이었습니다. 데이터 수집 후 소프트웨어 자동 분석에 의한 잠재적 오해를 피하기 위해 각 ECG 기록(4단계)을 수동으로 검토하고 검증했습니다.
그림 3은 일반적인 ECG 데이터 수집 및 처리 시스템의 필수 요소 세 가지, 즉 고성능 데이터 수집 하드웨어, 고이득 차동 증폭기 및 ECG 데이터를 위한 소프트웨어와 함께 업로드된 컴퓨터를 보여 주며, 인수 및 분석. 우리의 실험실에서는, 우리는 성숙한 얼룩말 물고기 모형을 수용하기 위하여 작은 포유류 모형 (마우스, 쥐 및 토끼와 같은)를 위해 원래 디자인된 생체 내 ECG 기록 체계에 기존 상업적인 적응했습니다.
그림 4는 적절한 리드 배치가 추정된 심장 주축과 리드를 정렬해야 한다는 것을 보여줍니다. 생체 내 심전도 기록에서 zebrafish는 단 하나의 리드만 사용되기 때문에 R 및 T 파진폭을 동시에 최대화하는 적절한 리드 위치 가 중요합니다. R 및 T 파진을 최대화하기 위해 양극 및 음극 전극을 심장 주축(아마도 왼쪽 꼬리에서 오른쪽 두개골 방향)과 정렬했습니다. 흉부 절제술과 심근 절제술에 이어 심낭을 열고 심장을 노출하면 심장 주축이 명백해집니다 (그림4B 흰색 파선). 사실, 심장을 노출하는 심근 절제술은 심전도 기록을 최소 침습적 절차로 변환하는 비용으로 신호 대 잡음 비 7을 증가시키는 일반적으로 사용되는 전략입니다.
그림 5는 심전도 분석에서 중요한 단계를 보여 줍니다. 먼저, ECG 설정 대화 상자(그림 5A)를 사용하여 소프트웨어자동 분석을 위한 다양한 파라미터 설정을 미리 정의했습니다. 포유류 모델을 위해 설계된 기존 ECG 기록 장비를 용도 변경하여 성인용 얼룩말물고기를 수용할 수 있기 때문에 제브라피시의 감지 및 분석 설정을 사용할 수 없습니다. 우리는 인간 심전도에 얼룩말 물고기 심전도의 현저한유사성을 감안할 때, 대신 인간 사전 설정을 선택했습니다 (그림 5A). 둘째, 우리는 R 파 피크의 소프트웨어 자동 심전도 식별 (검은 색)을 수동으로 검증하고 평균 심실 속도를 다시 계산하기 위해 소프트웨어를 명령하기 전에 R 웨이브 자동 식별 실수를 올바른 (빨간색) 확인했습니다. 예를 들어, 그림 5B에서R 파와 관련하여 큰 P 파는 소프트웨어를 잘못 식별하여 R 파를 잘못 식별하여 RR 간격 또는 심실 속도를 자동으로 잘못 계산합니다. 따라서 ECG 분석에서는 필요에 따라 인간의 검증과 적절한 수정이 중요합니다. 셋째, 리듬 규칙성을 신속하게 평가하고 평균 보기(그림 5C)를 사용하여파도와 간격의 평균 지속 시간을 계산하여 여러 연속적인 심장 주기(녹색)를 단일 평균 신호(검정)로 연결했습니다. 여기서 그림5C에서, 9개의 심장 주기와 평균 신호 사이의 무시할 수 있는 편차는 이 얼룩말물고기 심장의 우수한 리듬 규칙성을 주장한다. 마지막으로, 사용할 수 있는 7가지 방법 중 하나인 Bazett를 사용하여 심박수에 대한QT 간격을 자동으로 수정할 수 있었습니다(그림 5D).
그림 6A -C는 전극 배치의 깊이가 심전도 신호의 진폭에 미치는 영향을 보여줍니다. 진피(그림 6A)에 너무 피상적으로 전극을삽입했을 때, 리드는 "간접"과 유사(간접 표준 인간 심전도 사지 리드 I, II 및 III와 유사한 심장에서 두 개 이상의 심장 직경)과 전압이었습니다. 신호가 작아졌습니다. 우리가 적당히 가슴 근육에 1mm 더 깊은 전극을 삽입할 때 (그림6B),리드는 "반간접적"이되었다 (가까운 근접하지만 심장과 직접 접촉하지 않음) 전압 신호가 증가했습니다. 심전도 파형이 쉽게 보입니다. 그러나 전극을 심실로 더 깊숙이 삽입했을 때(그림6C),리드는 "직접"(심장과 직접 접촉)되고 전압 신호는 더욱 증가했습니다. 도 6C의 R파 진폭은 도 6A에 비해 8배, 도 6B에비해 4배 증가했다. 그러나, 그림 6C에 있는 심전도 추적은 새로운 ST 불경기 및 새로운 T 파 반전과 같은 심실 심근에 상해의 새로운 표시를 밝혔습니다.
그림 6D는 모든 심전도 파형(P, Q, R, S 및 T)의 비정상적인 반전이 양극과 음극이 전환되는 리드 반전 실수를 신호하는 방법을 보여 줍니다. 정의에 따라 Q와 S는 항상 음수이지만 R은 항상 양수입니다.
그림 6E -F는 부적절한 마취 깊이가 생체 내 심전도 기록의 품질을 손상시킬 수있는 방법을 보여줍니다. 도6E에서, 부적당한 마취 (0.017% 트리카인)는 제브라피시를 완전히 움직이지 못하게 하였다. 그 결과 모션 아티팩트는 신호(별표)를 오염시키고 노이즈(화살표)를 증가시킴으로써 신호 대 잡음 비율을 낮췄습니다. 대조적으로, 도6F에서, 과다 복용 마취 (0.08% 트리카인) 심한 부비동 부대 부정맥뿐만 아니라 ST 세그먼트및 T 파의 변화를 유도하였다.
그림 1: 인간과 얼룩말의 심장의 해부학 및 심전도 대조. 두 개의 심방과 두 개의 심실을 가진 인간의 심장과는 달리, 제브라피시 심장에는 하나의 심방과 하나의 심실 (상단 행)이 있습니다. 약어: RA, 오른쪽 심방; LA, 왼쪽 아트리움; RV, 우심실; LV: 좌심실. 제브라피시 심장은 인간의 심장(맨 아래 줄)과 몇 가지 일반적인 심전도 특징을 공유합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 생체 내 심전도 기록 프로토콜에서 최소 침습. 회로도 흐름 도표는 생체 내 심전도 심문을 수행하는 네 가지 중요한 작업 단계를 보여줍니다: 마취를 유도, 심전도 리드 전극을 배치, 심전도 기록, 및 심전도 기록을 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 심전도 데이터 수집 및 처리 시스템. 생체 내 ECG 기록 시스템의 세 가지 주요 구성 요소는 데이터 수집 및 분석을 위한 데이터 수집, 증폭기 및 컴퓨터 소프트웨어를 획득하는 하드웨어를 포함합니다. 이 앰프에는 바로 사용할 수 있는 3개의 29게이지 스테인리스 스틸 마이크로 전극이 함께 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 심전도 리드 배치. 3개의 29게이지 컬러 코딩 스테인리스 스틸 전극이 어묵에 약 1mm 깊이로 단단히 삽입됩니다. 음수(검정) 전극과 양수(빨간색) 전극의 배치는 좌측 검을 따라 오른쪽 두개골 방향으로 정면 평면에 양극성 리드를 설정합니다. 약어: 참조, 참조 전극이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: C 심전도 분석의 ritical 단계. (A) 소프트웨어 자동 분석을 위한 다양한 매개변수 설정을 미리 정의합니다. (B) 심방 및 심실 속도의 소프트웨어 오산을 정류하기 위해 P 및 R 파의 소프트웨어(검정)에 의한 자동 오인(빨간색) 2개를 수동으로 수정(빨간색)한다. (C) 9회 연속 심장 주기(녹색)를 단일 평균 신호(검정)로 연결하여 리듬 규칙/불규칙성을 신속하게 평가하고 파도와 간격의 평균 기간을 계산합니다. (D) Bazett와 같은 다양한 방법 중 하나를 사용하여 심박수에 대한 QT 간격을 수정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 심전도 신호에 대한 납 배치 및 마취 깊이의 영향. 생체 내 심전도 기록의 성공을 결정하는 두 가지 가장 중요한 단계는 리드 배치(A-D)및 마취 깊이 (E-F)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구에서 입증한 바와 같이 단일 리드를 통해 성인 제브라피시에 대한 생체 내 심전도를 기록할 때, 심전도 기록 결과의 품질 및 유효성에 관한 많은 주의 사항이 있습니다. 첫째, 적절한 마취제를 선택하고 필요한 최소한의 마취 농도, 깊이 및 기간을 결정할 때, 마취 심독성과 운동 아티팩트를 억제하는 중요한 필요성 및 선험적 결정을 결정하는 데 있습니다. 생존 대 말단 실험 설계. 상이한 약물 클래스5,14 및 마비제1,6에서 여러 마취제의 조합의 상승 효능을 활용하여 개별 제제5 또는 투여의 용량을 낮춥니다. 더 높은 유도 복용량다음 낮은 유지 보수 복용량은 전형적인 전략. 그러나, 죽음을 포함하여 그것의 잘 알려진 잠재적인심장 호흡 독성에도 불구하고 8, 트리카인은 아직도 가장 널리 이용되고, 제브라피시(FDA)에 대한 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된 유일한 마취제입니다. 마 취. 트리카인은 단일 제제 또는 다른 마취제 또는 마비와 함께 성인 제브라피시의 심전도 기록에 널리 사용되어 왔습니다.
둘째, 일반 성인용 제브라피시 심전도에 대한 네 가지 검증 기준을 사용하여 건강한 정상 제브라피시에 대해 적어도 납 배치 정확도를 보장할 수 있습니다. 여기서 제안하는 4가지 검증 기준 중, 마지막 두 가지 기준은 함께 정상 심전도 5,7,15에서R파의 극성과 T파의 극성 사이의 근본적인 일치를 확인한다. 이 R 및 T 웨이브 일치는 인간 심장에 대한 대리로 제브라피시 심장 모델의 임상 적 관련성에 기여하는 제브라피쉬와 인간16,17 정상 심전도 사이의 운이, 아직 중요한 유사성입니다. 전기 생리학. 그러나, 몇몇 양성 또는 악성 조건은 4개의 검증 기준 중 어느 것을 무효화할 수 있습니다. 예를 들어, R 및 T 파의 일치는 심근허혈 7,15에서손실됩니다. 심근 허혈에서 R 및 T 파 의 일치의 이 손실은 제브라피시 심근 경색 모형의 임상 관련성에 기여하는 zebrafish와 인간 심전도 사이 또 다른 눈에 띄는 유사입니다.
마지막으로, 심전도 분석에서 표준 사례를 권장합니다. 기술의 출현으로 ECG 분석 소프트웨어는 자동 심전도 해석을 생성할 수 있습니다. 그러나, 우리는 강하게 훈련된 인간은 항상 ECG 기록으로 이끌어 내는 각각의 임상 시나리오에 근거를 둔 모든 ECGs를 재해석하고 확인해야 한다는 것을 추천합니다. ECG 분석 소프트웨어에 의한 자동 해석에 대한 일상적인 과의존은 특히 일반적인 정상적인 심전도 변이체, 심장 병리 또는 최적이 아닌 납 배치가 있는 경우 바람직하지 않습니다.
이 연구는 간단한 심전도 기록 세션을 위한 최소 침습 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 말단 장기간 심전도 기록 세션에 대한 필요성이 발생하는 경우, 연속 관류 6에 의한 적절한산소화, 수화 및 마취를 제공하기 위해 수정이 필요하다.
또한 신호 대 잡음 비율을 세 가지 방법 중 하나이상 향상시킵니다. 더 강력한 앰프를 선택하는 것은 종종 비실용적이지 않은 경우 비용이 많이 드는 옵션입니다. 볼륨 컨덕토리를 줄이기 위해 심낭을 여는 것은 7을 채택한침습적이지만 합리적인 접근 방식입니다. 주요 심장 축에 평행한 방향으로 리드 축을 정렬하는 전략적 리드 배치 (그림4B)는심전도 전압 신호를 최대화하지만 특히 심근 절제술이없는 경우 시행 착오가 필요할 수 있습니다.
우리가 여기에서 제시한 성인 얼룩말 물고기를 위한 생체 내 ECG 심문 방법은 4개의 주요 이점을 제안합니다. 첫째, 우리의 최소 침습 적 접근법은 전극 삽입만 필요하지만 물고기 스케일 제거 또는 흉부 절제술은 필요하지 않습니다. 따라서, 물고기에 대한 통증을 최소화함으로써, 우리의 접근 방식은 종방향 생존 연구에서 반복 된 심전도 심문을 가능하게합니다. 둘째, 마취제가 물고기의 움직임을 적절히 억제할 때, 당사의 연구에서 생체 내 심전도 기록 시스템은 지속적으로 무소음 원시 신호로 만족스러운 신호 대 잡음 비를 산출합니다. 셋째, 여기에서 제안하는 4가지 기준 품질 검증은 ECG 데이터 수집 초기에 데이터 정확성과 견고성을 보장하고 운영자에 대한 변동을 최소화합니다. 마지막으로, 우리의 마지막 검증 기준(정상 T파는 수직)은 제브라피시 정상 심전도의 중요한 인간과 같은 특징인 R파와 T파의 일치를캡슐화합니다(그림 1).
그러나, 여전히 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 성인 얼룩말 물고기에 대 한 생체 내 ECG 방법론에 4 개의 주요 제한 사항이 존재.
첫째, 주제 협력의 부족은 그것의 제한적인 심호흡 독성 결과로 마취를 위한 필요를 필요로 합니다. 생체 내 심전도 심문을 위해, 인간 환자는 결코 과실을 필요로 하지 않는 반면, zebrafish는 항상 마취제 또는 마비를 필요로 하며, 이 모든 것은 가변적인 심폐 독성을 유발합니다.
둘째, 부착 된 심전도 리드를 고정 할 필요성은 그렇지 않으면 비 침습적 절차의 침략성을 약간 상승시킵니다. 인간의 신체 표면 심전도 기록에 납 배치는 전극이 인간의 표피에 부착하기 때문에 전적으로 비 침습적이지만, 제브라피시의 생체 내 심전도 기록에 대한 리드 배치는 최소한 강철 전극이 있어야하기 때문에 더 침습적입니다. 물고기 근육에 안전한 삽입을 위해 물고기 피부를 뚫습니다.
마지막 두 가지 제한은 제브라피시 가슴과 심장의 해부학적 제약에서 비롯됩니다. 셋째, 성인 제브라피시 심장의 작은 크기는 심전도 리드의 수의 급격한 감소를 필요로한다. 인간은 표준 심전도 기록에서 12개의 리드를 쉽게 수용하지만, 성인용 제브라피쉬는 일반적으로 단극성 또는 양극성 납 하나만 수용할 수 있습니다. 단일 ECG 리드의 파급 효과는 세 가지 P, R 및 T 파의 진폭을 동시에 최적화하는 과제입니다. 따라서 zebrafish ECG 심문에서 최적이고 정확한 리드 배치의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 제브라피시에서 T웨이브는 이 세 가지 파도 중 가장 작은 파도이기 때문에 독특한 검출 과제를 제시합니다. 따라서, 제브라피쉬 T파진폭은 통상적으로 더 큰 P 및 R파에 비해 최적화 우선순위를 받아야 한다.
넷째, R파진폭을 최대화하기 위해 제브라피쉬 주 심장축을 결정하는 것은 어려울 수 있다. 그 이유는 제브라피쉬 심장이 형태에 맞는 장갑과 같은 심낭 내의 인간의 심장에 비해 느슨한 심낭 내에서 더 많은 움직임을 가지고 있다는 것입니다.
전반적으로, 이러한 제한은 미래의 방법 혁신을 자극할 것입니다. 3D 프린팅과 변형 가능한 전자 장치18의출현으로 무선 전극 센서의 '심장 양말'을 사용하여 제브라피시를 깨우고, 경고하고, 수영하는 첫 날에 직접 납 이식에 대한 희망이 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 TPN에 건강 R01 HL141452의 국가 학회에 의해 지원되었다. ADInstruments 친절 하게 오픈 액세스 게시의 비용을 무시 하기 위해 관대 한 자금을 제공 하지만 실험 디자인, 데이터 수집, 이 연구의 데이터 분석 또는 출판 하기 전에 원고에 대 한 액세스에 아무 역할.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
| Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
| FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
| Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
| LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
| Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
| Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
| PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
| Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |
References
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