Summary
Her præsenterer vi en mekanisk dissociations protokol til hurtigt at isolere makrofager fra rygroden ganglion til fænotypebestemmelse og funktionel analyse.
Abstract
Der er voksende interesse for at studere den molekylære og cellulære interaktioner mellem immunceller og sensoriske neuroner i rygroden ganglier efter perifer nerveskade. Perifere monocytiske celler, herunder makrofager, er kendt for at reagere på en vævsskade gennem fagocytose, antigen præsentation, og cytokinfrigivelse. Nye beviser har impliceret bidraget fra dorsale root basale ganglier makrofager til neuropatiske smerte udvikling og axonal reparation i forbindelse med nerveskade. Hurtigt fænotypebestemmelse (eller "hurtig isolering af") responsen af dorsale root basale ganglier makrofager i forbindelse med nerveskade ønskes at identificere de ukendte Neuro immune faktorer. Her demonstrerer vi, hvordan vores laboratorium hurtigt og effektivt isolerer makrofager fra dorsalrodsganglier ved hjælp af en enzym fri mekanisk dissociations protokol. Prøverne holdes på is hele for at begrænse cellulære stress. Denne protokol er langt mindre tidskrævende i forhold til standard enzymatisk protokol og er rutinemæssigt blevet brugt til vores fluorescens-aktiverede celle sortering analyse.
Introduction
Der er nu betydelige beviser for, at immunceller bidrager til neuropatiske smerter efter perifer nerveskade1,2. Perifere monocytiske celler, herunder modne makrofager, er kendt for at reagere på vævsskade og systemisk infektion gennem fagocytose, antigen præsentation, og cytokinfrigivelse. Parallelt med nerveskade-induceret microglia aktivering i rygmarvs dorsale horn, makrofager i rygroden basale ganglier (DRG) også ekspandere betydeligt efter nerveskade3,4. Især er der stigende interesse for at afgøre, om makrofager bidrage til neuropatiske smerte udvikling efter perifer nerveskade ved at interagere med sensoriske neuroner i DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Endvidere implicerer nylige undersøgelser også bidraget fra DRG-makrofager i den axonale reparation efter nerveskade12,13. En anden undersøgelse tyder endvidere på, at makrofag subpopulationer (dvs., CD11b+Ly6CHi og CD11b+Ly6Clav/- celler) kan spille en anden rolle i den mekaniske overfølsomhed14. Derfor, hurtigt fænotypebestemmelse reaktionen af DRG makrofager i forbindelse med nerveskade kan hjælpe os med at identificere Neuro immune faktorer, som bidrager til neuropatiske smerter.
Konventionelt, protokollen til at isolere makrofager i DRG involverer flere trin, herunder enzymatisk fordøjelse15,16. Teknikken er ofte tidskrævende og kan være bekostelig for storstilede eksperimenter. Selv om mild fordøjelse med kollagenase type II (4 mg/ml) og dispase type II (4,7 mg/ml) i 20 min blev anbefalet tidligere15, er det tænkeligt, at celler efter eksponeringen for dette enzym er tilbøjelige til celle skade eller celledød, hvilket kan føre til lav Udbytte. Desuden kan forskellen i kvaliteten af enzymer fra batch til parti yderligere påvirke effektiviteten af denne proces. Endnu vigtigere er det, at makrofager, der eksponeres for enzym fordøjelsen, kan blive uønsket stimuleret og dermed kan være meget forskellig fra in vivo-status. Ændringerne kan potentielt komplicere resultatet af den funktionelle undersøgelse.
Her beskriver vi en enzym-fri protokol til hurtigt at isolere DRG-makrofager ved 4 °C ved hjælp af mekanisk dissociation. Prøverne holdes på is for at begrænse cellulære stress. Som følge heraf giver vores tilgang en fordel for at opretholde ensartethed i isolationen, og de isolerede celler er formentlig sundere og mindre stimulerede. Vi fremlægger yderligere dokumentation for at validere kvaliteten af de isolerede celler med fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS) analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug ved University of California San Francisco og blev udført i overensstemmelse med NIH guide for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Saml lumbale DRG fra eksperimentelle mus
- Før eksperimentet påbegyndes, forberedes arbejdsopløsningen på massefylde gradient mediet (f. eks. Percoll) ved at blande 9 volumener af mediet med 1 volumen af ca+ +/mg+ +-fri 10x hbss. Hold den på is.
- Anesthetize musen med 2,5% Avertin. Bekræft, at dyret er fuldt bedøvet af den manglende reaktion på bagpote knivspids.
Bemærk: både mandlige og hunmus i alderen 6-8 uger blev brugt. - Perfuse musen transcardially med 10 mL forkølet 1x PBS.
- Placer musen i liggende position med fire poter fastgjort med båndet inde i en kemisk røg hætte. Løft huden under ribburet ved pincet, og lav et lille snit med kirurgisk saks for at udsætte leveren og membranen.
- Fortsæt med at bruge en saks til at skære membranen og ribburet, åbne pleural hulrum for at afsløre det bankende hjerte.
- Hurtigt skære den rigtige atrieflimren vedhæng med iris saks. Når blødningen er noteret, skal du indsætte en 30 G nål i den bageste ende af venstre ventrikel, og langsomt injicere 10 mL forkølet 1x PBS at perfuse dyret.
- Udfør dorsale laminektomi15 på musen placeret på den udsatte position.
Bemærk: Hvis cellekulturen er planlagt, skal du sprøjte musen med 70% ethanol før indsnit og bruge præ-steriliserede kirurgiske instrumenter til dissektion.- Brug en størrelse 11 skalpel til at lave en langsgående lateral dybe snit begyndende fra thorax regionen ned til sakrale regionen. Fjern huden ved saksen for at udsætte rygmuskulaturen lag.
- Brug Friedman-Pearson rongeur til at skrælle bindevæv og muskler, indtil de Sakral rygsøjlen processer og bilaterale tværgående processer er udsat.
- Brug en Noyes fjeder saks til forsigtigt at åbne rygmarvs søjlen, og skift derefter til en Friedman-Pearson Rongeur for at fjerne vertebrale knogler for at udsætte rygmarven med intakt rygmarvs nerver vedhæftet.
- Forsigtigt dissekere ipsilaterale og kontralateral lumbale DRG (L4/L5 DRG i vores undersøgelse) og placere den i 1 mL iskold ca+ +/mg+ +-fri 1x Hbss i en dounce vævs homogenisator. Nu er vævene klar til trin 2.
Bemærk: trim rygmarvs nerven fastgjort til DRG, hvis det er muligt.
2. Isoler enkeltceller fra musen lænde DRG
- Homogeniser DRG vævet med en løs Pestle i Dounce homogenisator 20-25 gange.
- Placer en steril 70 μm nylon cellefilter i et sterilt 50 mL konisk rør. Våd celle sien med 800 μL iskold 1x HBSS, og gennemstrømningen opsamles i det koniske rør.
- Saml den homogeniserede vævs suspension fra homogenisator ved hjælp af en pipette og passere gennem den våde 70 μm nylon celle si i 50 mL konisk rør.
- Skyl homogenisator to gange med 800 μl iskold 1x hbss og derefter dekanteres i samme 50 ml koniske rør med celle sien for at øge udbyttet.
- Tilsæt 1,5 mL ækvibreret iskold isotonisk densitet gradient medium (forberedt i trin 1,1) i en steril 5-mL polystyren FACS rør.
- Overfør celle homogenatet fra 50 mL konisk slange (i trin 2,4) ind i FACS-røret, bland godt med tæthed gradient medium ved pipettering op og ned. Tilsæt yderligere 500 μL 1x HBSS for at forsegle toppen.
- Cellerne centrifugeres ved centrifugering ved 800 x g i 20 minutter ved 4 °c.
- Aspirer forsigtigt den supernatanten, der indeholder myelin, i mediet uden at forstyrre celle pellet i bunden af FACS-røret.
- Cellerne i PBS eller FACS buffer, der indeholder 5% føtal bovint serum (FBS), resuspenderes for FACS-analyse.
Bemærk: mindst 50.000 til 100.000 celler forventes fra L4/L5 DRG af en mus.- De mekanisk isolerede DRG-celler (L4/L5) resuspenderes i 100 μL PBS, der indeholder 5% føtal bovint serum, hvorefter der inkuberes med α-Mouse CX3CR1-APC-antistof (1:2000) i mørket ved 4 °C i 1 time.
- Cellerne vaskes med 5 mL PBS én gang; cellerne centrifugeres 360 x g i 8 minutter ved 4 °c.
- Aspirér supernatanten, og resuspender derefter celle pellet i 300 μL PBS for FCAS-analyse. Hvis celle sortering er planlagt, bør du i stedet gensuspendere cellerne i FACS-bufferen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at validere de isolerede celler valgte vi først Macro Phage FAS-induceret apoptose (MAFIA) Transgene mus17. Denne linje udtrykker et lægemiddel-inducerbart FK506 bindende protein (FKBP)-FAS Suicide fusion gen og grønt fluorescerende protein (eGFP) under kontrol af promotoren af CSF1 receptor (CSF1R), som er specifikt udtrykt i både makrofager og microglia. Systemisk injektion af FK-bindende protein dimerizer, AP20187 (AP), inducerer apoptose af cellerne, som udtrykker transgenet. Udtrykket EGFP giver os også mulighed for at overvåge makrofager i DRG. For at nedbryder makrofager i MAFIAEN mus, vi begyndte vores studier med 3 daglige intraperitoneale injektioner af AP (1 mg/kg). Efter den sidste injektion blev DRG sektioneret til immun farvning af GFP. Vi registrerede et betydeligt tab af GFP+ celler i DRG af de AP-behandlede mus sammenlignet med Veh-behandlede mus (figur 1a-B). I et separat eksperiment brugte vi denne protokol til mekanisk at adskille DRG-makrofager efter behandlingen. Efterfølgende FACS-analyser afslørede en vellykket nedbrydning af GFPHi -populationen i AP-behandlede mus (figur 1C-D) og påviste den høje kvalitet af isolerede celler.
Vi karakteriserede også de isolerede DRG-celler fra Wild-type-musene. Mekanisk isolerede DRG-celler (L4/L5) blev plettet med α-Mouse CX3CR1-APC-antistof. Vi konstaterede, at 6% af DRG-cellerne var CX3CR1+ makrofager (figur 2A-B). Cellernes levedygtighed blev også vurderet med Propidium iodide (endelig koncentration på 2,5 μg/ml), som binder sig til det intracellulære DNA i de ikke-levedygtige celler, hvilket afslørede, at mere end 80% af de frisk isolerede DRG-celler var levedygtige (figur 2C-D).
Figur 1: FACS analyse af makrofager i DRG af MAFIA mus efter AP behandling.
MAFIA-mus fik daglig intraperitoneal injektion af 1 mg/kg AP20187 (AP) eller køretøj (VEH) i 3 dage før analysen. (A, B) Repræsentative billeder af immun farvning, der viser den AP-inducerede nedbrydning af GFP + (grøn) makrofager i L4/L5- DRG efter 3Rd AP-behandlingen. NF200 (blå) blev brugt til at mærke myelinerede neuroner. Skala bjælke: 50 μm. (C, D) De procentvise CSF1R-GFPHi -celler efter mekanisk dissociation af L4/5 DRG blev bestemt ved FACS-analyse, og et repræsentativt datasæt fra tre uafhængige eksperimenter vises med den angivne procentdel af den gated cellepopulation. Resultatet viser, at 4% af de samlede isolerede celler fra det VEH-behandlede dyrs DRG var GFPHi -makrofager. I modsætning hertil var kun 0,4% af de totale DRG-celler GFPHi -makrofager i AP-behandlet mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FACS karakterisering af makrofager i DRG af vild-type mus.
(A, B) Ipsilateral L4 og L5 DRG af naive Wild-type mus blev samlet for mekanisk dissociation. Procentdelen CX3CR1+ makrofager blev MÅLT ved FACS-analyse (A). Gating for CX3CR1+ celler var baseret på baggrunden fluorescens i cellerne inkuberet med APC-konjugeret isotype Control antistof (B). (C, D) Celle levedygtigheden af frisk isolerede DRG celler blev vurderet med Propidium iodide (PI) farvning. PI+ celler (C) blev indhegnet baseret på baggrunden fluorescens i de ufarvede celler (D). Et repræsentativt datasæt fra tre uafhængige eksperimenter vises med den angivne procentdel af den gated cellepopulation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her introducerer vi en ny metode til effektivt at berige isolerede makrofager fra mus DRG. Den konventionelle tilgang til at isolere DRG immunceller kræver enzymatisk fordøjelse15,18, som nu er erstattet med mekanisk homogenisering i vores protokol for at begrænse uønskede celleskader og øge udbyttet. Derfor er den nye protokol langt mindre tidskrævende. Endnu vigtigere, enzym fordøjelsen kan stimulere makrofager og ændre den molekylære signatur. I modsætning, vores mekaniske tilgang i høj grad begrænser cellulære stress.
Ved hjælp af FACS analyse karakteriserede vi yderligere makrofager i de isolerede DRG-celler og demonstrerede en stor cellulær genopretning. Mere end 80% af isolerede DRG-celler under denne protokol fandtes at være levedygtige (figur 2D). Mindst 50.000 til 100.000 celler forventes fra L4/L5 DRG af en mus. Derfor kan vi trygt konk sige, at DRG celler kan sorteres yderligere i makrofag subpopulationer14 for enten kultur eller RNA isolation. Der er dog et par kritiske trin, som kan påvirke udbyttet. Hvis den utilfredsstillende celle ydelse er noteret, bør der være mistanke om utilstrækkelig eller overdreven homogenisering i trin 2,1. Omfanget af celledød vurderet med PI (figur 2) eller 7-Aad farvning kan udnyttes til at optimere protokollen. Desuden kan DRG dissektion i trin 1,4 kræve gentagen praksis for begyndere.
I øjeblikket bruger vores laboratorium primært denne protokol til at studere DRG-makrofager. Sandsynligvis, anvendelsen af denne protokol kan udvides til at studere andre ikke-neuronal celler i DRG, såsom satellit celler19, og T-celler20. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bekræfte effektiviteten af celle isolation. Desværre er vores nuværende mekaniske dissociations metode ikke ideel til isolering af DRG sensoriske neuroner, og enzymatisk fordøjelse er fortsat den mest effektive metode til sensorisk neuron isolation15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser i forbindelse med dette manuskript.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af: Foundation for anæstesi uddannelse og forskning (XY); UCSF-departementet for anæstesi og perioperative pleje (XY); og 1R01NS100801-01 (GZ). Denne undersøgelse blev delvist støttet af HDFCCC laboratorium for celle analyse faciliteten for delte ressourcer gennem et tilskud fra NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
