Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo mecânico da dissociação para isolar ràpida macrófagos do gânglio dorsal da raiz para o fenotipagem e a análise funcional.
Abstract
Há interesses crescentes para estudar as interações moleculares e celulares entre as células imunes e os neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal após lesão do nervo periférico. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos, são conhecidas por responder a uma lesão tecidual por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. A evidência emergente implicou a contribuição de macrófagos dorsais do gânglio da raiz ao desenvolvimento neuropática da dor e ao reparo axonal no contexto de ferimento do nervo. Rapidamente fenotipagem (ou "isolação rápida de") a resposta de macrófagos dorsais do gânglio da raiz no contexto da lesão de nervo é desejada identificar os fatores neuroimune desconhecidos. Aqui nós demonstramos como nosso laboratório isola ràpida e eficazmente macrófagos dos gânglios da raiz dorsal usando um protocolo mecânico enzima-livre da dissociação. As amostras são mantidas no gelo por toda parte para limitar o stress celular. Este protocolo é muito menos demorado comparado ao protocolo enzimático padrão e foi usado rotineiramente para nossa análise fluorescência-ativada da classificação de pilha.
Introduction
Há agora uma evidência considerável que as pilhas imunes contribuem à dor neuropática que segue a lesão periférica do nervo1,2. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos maduros, são conhecidas por responder a lesões teciduais e infecção sistêmica por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. Paralelamente à ativação de microglia induzida por lesão nervosa no Corno dorsal espinhal, os macrófagos nos gânglios da raiz dorsal (DRG) também se expandem significativamente após a lesão nervosa3,4. Notavelmente, háinteresses crescentes para determinar se os macrófagos contribuem para o desenvolvimento da dor neuropática após lesão nervosa periférica, interagindo com neurônios sensoriais no DRG5,6,7, 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11. Além disso, estudos recentes também implicam a contribuição dos macrófagos DRG no reparo axonal após lesão nervosa12,13. Outro estudo sugere ainda que as subpopulações de macrófago (i.e., CD11b+Ly6CHi e CD11b+Ly6CLow/- Cells) podem desempenhar um papel diferente na hipersensibilidade mecânica14. Conseqüentemente, ràpida fenotipagem a resposta de macrófagos de DRG no contexto da lesão do nervo pode ajudar-nos a identificar os fatores neuroimune que contribuem à dor neuropática.
Convencionalmente, o protocolo para isolar macrófagos no DRG envolve múltiplas etapas, incluindo a digestão enzimática15,16. A técnica é muitas vezes demorada e pode ser dispendiosa para experimentos em grande escala. Embora a digestão suave com colagenase tipo II (4 mg/ml) e Dispase tipo II (4,7 mg/ml) por 20 min foi recomendado anteriormente15, é concebível que as células após a exposição a esta enzima são propensos a danos celulares ou morte celular, o que pode levar a baixa Rendimento. Além disso, a diferença na qualidade das enzimas de lote para lote pode impactar ainda mais a eficiência deste processo. Mais importante, os macrófagos expostos à digestão enzimática podem ser estimulados involuntàvelmente e, portanto, podem ser muito diferentes do status in vivo. As alterações podem potencialmente complicar o desfecho do estudo funcional.
Aqui nós descrevemos um protocolo enzima-livre para isolar ràpida macrófagos de DRG em 4 ° c usando a dissociação mecânica. As amostras são mantidas no gelo para limitar o stress celular. Como resultado, nossa abordagem oferece uma vantagem para manter a consistência do isolamento, e as células isoladas são presumivelmente mais saudáveis e menos estimuladas. Nós apresentamos mais a evidência para validar a qualidade das pilhas isoladas com análise fluorescência-ativada do Cell Sorting (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da Califórnia em São Francisco e foram conduzidos de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. colete DRG lombar de camundongos experimentais
- Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio de gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) misturando 9 volumes do meio com 1 volume de CA+ +/mg+ +-Free 10x HBSS. Mantenha-o no gelo.
- Anestesie o rato com 2,5% Avertin. Confirme que o animal está totalmente anestesiado pela falta de resposta à pinça da pata traseira.
Nota: foram utilizados ratos machos e fêmeas com idades compreendidas entre 6-8 semanas. - Perfuse o rato transcardially com 10 mL de PBS pre-refrigerado 1x.
- Coloc o rato na posição supina com as quatro patas fixadas com a fita dentro de uma capa química das emanações. Levante a pele abaixo da caixa torácica pelo fórceps, e faça uma pequena incisão com tesouras cirúrgicas para expor o fígado e o diafragma.
- Continue a usar tesouras para cortar o diafragma e a caixa torácica, abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.
- Corte rapidamente o Apêndice Atrial direito com tesouras da íris. Uma vez que o sangramento é observado, insira uma agulha de 30 G na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mL de PBS pré-refrigerado 1x para perfuse o animal.
- Realize laminectomia dorsal15 no rato colocado na posição prona.
Nota: se a cultura da célula for planejada, pulverize o mouse com 70% de etanol antes da incisão e use instrumentos cirúrgicos pré-esterilizados para dissecção.- Use um bisturi de tamanho 11 para fazer uma incisões profundas laterais longitudinais a partir da região torácica até a região sacral. Retire a pele pela tesoura para expor a camada dorsal do músculo.
- Use Friedman-Pearson Rongeur para descascar fora os tecidos e os músculos conexivos até que os processos Lumbosacral da espinha e os processos transversais bilaterais estejam expostos.
- Use uma mola de Noyes Scissor para abrir com cuidado a coluna espinal dorsal, a seguir mude a um Friedman-Pearson Rongeur para remover os ossos vertebrais para expor a medula espinal com os nervos espinais intactos Unidos.
- Cuidadosamente dissecado DRG lombar ipsilateral e contralateral (L4/L5 DRG em nosso estudo) e colocá-lo em 1 mL de CA+ +/mg+ +-livre de gelo-1x HBSS em um homogeneizador de tecido dounce. Agora os tecidos estão prontos para o passo 2.
Nota: aparar o nervo espinhal anexado ao DRG, se possível.
2. isolar células individuais do mouse lombar DRG
- Homogeneizar o tecido DRG com um pilão solto no homogeneizador dounce 20-25 vezes.
- Coloque um filtro de célula de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL. Molhe o filtro da pilha com 800 μL do gelo-frio 1x HBSS, e o fluxo-através é coletado no tubo cônico.
- Colete a suspensão do tecido homogeneizado do homogeneizador usando uma pipeta e passe pelo filtro de células de nylon molhado de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL.
- Enxague o homogeneizador duas vezes com 800 μL de gelo-frio 1x HBSS e, em seguida, decantar no mesmo tubo cônico 50 mL com filtro de células para aumentar o rendimento.
- Adicionar 1,5 mL de meio de gradiente de densidade isotónica gelado equilibrado (preparado no passo 1,1) num tubo de poliestireno FACS estéril de 5 mL.
- Transfira o homogeneizar da pilha do tubo cônico de 50 mL (na etapa 2,4) no tubo de FACS, misture bem com o meio do inclinação da densidade pipetando acima e para baixo. Adicione um adicional de 500 μL de 1x HBSS para selar a parte superior.
- Pellet as células por centrifugação em 800 x g por 20 min a 4 ° c.
- Aspirar com cuidado o sobrenadante que contem o mielina no meio sem perturbar a pelota da pilha na parte inferior do tubo de FACS.
- Ressuscitem as células no tampão PBS ou FACS contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) para análise de FACS.
Nota: pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um rato.- Ressuscitem as células DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) em 100 μL de PBS contendo 5% de soro bovino fetal e, em seguida, incubar com anticorpo α-mouse CX3CR1-APC (1:2000) no escuro a 4 ° c por 1 h.
- Lave as células com 5 mL de PBS uma vez; Centrifugar as células 360 x g durante 8 min a 4 ° c.
- Aspirar o sobrenadante, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 300 μL de PBS para análise de FCAS. Se a classificação de célula é planejada, resuspender as células no buffer FACS em vez disso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para validar as células isoladas, primeiro escolhemos os camundongos transgênicos de apoptose induzida por macrófago (MAFIA)17. Esta linha expressa um fármaco-inducible FK506-Binding proteína (FKBP)-FAS suicídio gene de fusão e proteína verde fluorescente (eGFP) o controle do promotor do receptor CSF1 (CSF1R), que é especificamente expressa em ambos os macrófagos e microglia. A injeção sistemática do dimerizer da proteína de ligação de FK, AP20187 (AP), induz o apoptose das pilhas que expressam o transgene. A expressão do EGFP também nos permite monitorar os macrófagos no DRG. Para esgotar os macrófagos nos camundongos da máfia, iniciamos nossos estudos com 3 injeções intraperitoneal diárias de AP (1 mg/kg). Após a última injeção, a DRG foi seccionada para imunocoloração para GFP. Nós registramos uma perda significativa de GFP+ Cells no DRG dos ratos AP-tratados comparados aos ratos Veh-tratados (Figura 1a-B). Em uma experimentação separada, nós usamos este protocolo para dissociar mecanicamente os macrófagos de DRG após o tratamento. A análise subseqüente de FACS revelou uma depleção bem sucedida da população de GFPHi em ratos AP-tratados (Figura 1C-D) e demonstrou a alta qualidade de pilhas isoladas.
Nós igualmente caracterizamos as pilhas isoladas de DRG dos ratos do selvagem-tipo. As pilhas DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) foram manchadas com o anticorpo do α-rato CX3CR1-APC. Verificou-se que 6% das células DRG foram CX3CR1+ macrófagos (Figura 2a-B). A viabilidade celular também foi avaliada com o iodeto de propidium (concentração final de 2,5 μg/ml) que se liga ao DNA intracelular das células não viáveis, revelando que mais de 80% das células DRG recém-isoladas foram viáveis (Figura 2C-D).
Figura 1: análise de FACS de macrófagos no DRG de camundongos MAFIA após tratamento com AP.
Os ratos da máfia receberam a injeção intraperitoneal diária de 1 Magnésio/quilograma de AP20187 (AP) ou do veículo (VEH) por 3 dias antes da análise. (A, B) Imagens de imunocoloração representativas mostrando a depleção induzida por AP de macrófagos GFP+ (verde) no DRG L4/L5 após o tratamento de 3RD AP. NF200 (azul) foi usado para rotular neurônios mielinizadas. Barra de escala: 50 μm. (C, D) As célulasHi por cento CSF1R-GFP após a dissociação mecânica do DRG L4/5 foram determinadas pela análise de FACS, e um conjunto de dados representativos de três experimentos independentes é mostrado com a porcentagem da população de células fechadas indicada. O resultado mostra que 4% das células totais isoladas da DRG de animais tratados com VEH foram macrófagos do GFPHi . Por outro lado, apenas 0,4% das células DRG totais foram macrófagos do GFPHi em camundongo tratado com AP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização do FACS de macrófagos no DRG dos camundongos do tipo selvagem.
(A, B) Ipsilateral L4 e L5 DRG de rato selvagem-tipo ingênuo foram agrupados para a dissociação mecânica. Os percentuais CX3CR1+ macrófagos foram medidos pela análise de FACS (a). O gating para CX3CR1+ Cells foi baseado na fluorescência do fundo nas pilhas incubadas com o anticorpo do controle do ISOTIPO de APC-conjugated (B). (C, D) A viabilidade celular de células DRG recém-isoladas foi avaliada com coloração de iodeto de Propiídio (PI). As células PI+ (C) foram fechadas com base na fluorescência de fundo nas células não manchadas (D). Um conjunto de dados representativos de três experimentos independentes é mostrado com a porcentagem da população de células fechadas indicada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós introduzimos um método novo para enriquecer eficazmente macrófagos isolados do rato DRG. A abordagem convencional para isolar as células imunes do DRG requer digestão enzimática15,16, queagora é substituída por homogeneização mecânica em nosso protocolo para limitar os danos celulares indesejados e aumentar o rendimento. Portanto, o novo protocolo é muito menos demorado. Mais importante, a digestão da enzima pode estimular os macrófagos e alterar a assinatura molecular. Em contrapartida, a nossa abordagem mecânica limita muito o stress celular.
Usando a análise de FACS, nós caracterizamos mais mais os macrófagos nas pilhas isoladas de DRG e demonstraram uma grande recuperação celular. Mais de 80% das células DRG isoladas este protocolo foram encontradas como viáveis (Figura 2D). Pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um mouse. Conseqüentemente, nós podemos confidencialmente concluir que as pilhas de DRG podem mais ser classificadas em subpopulações14 do macrófago para a cultura ou o isolamento do RNA. No entanto, existem algumas etapas críticas que podem impactar o rendimento. Se o rendimento celular insatisfatório for observado, a homogenização insuficiente ou excessiva na etapa 2,1 deve ser suspeitada. A extensão da morte celular avaliada com o PI (Figura 2) ou a coloração 7-AAD pode ser utilizada para otimizar o protocolo. Além disso, a dissecção DRG na etapa 1,4 pode requerer prática repetida para iniciantes.
Atualmente, nosso laboratório usa principalmente este protocolo para estudar os macrófagos DRG. Provavelmente, a aplicação deste protocolo pode ser expandida para estudar outras células não-neuronais no DRG, como células de satélite19e células T20. Novos estudos são necessários para confirmar a eficácia do isolamento celular. Infelizmente, nosso método de dissociação mecânica atual não é ideal para o isolamento de neurônios sensoriais DRG, e a digestão enzimática continua sendo o método mais eficaz para o isolamento do neurônio sensorial15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes relacionados a este manuscrito.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado por: Fundação para a educação e pesquisa em anestesia (XY); o departamento de anestesia e assistência perioperatória (XY) da UCSF; e 1R01NS100801-01 (GZ). Este estudo foi apoiado em parte pelo laboratório HDFCCC para a análise de células recurso compartilhado recursos através de uma subvenção da NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
