Summary
Tilstedeværelsen af kræft stamceller har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. Dette manuskript beskriver metoderne til undersøgelse af Cancer stamcellernes radio følsomhed i cellelinjer i lungecancer.
Abstract
Tilstedeværelsen af kræft stamceller (CSCs) har været forbundet med tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling. At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i cellelinjer, der ikke er af småcellet lungecancer (NSCLC). Ved hjælp af calcium kanal α2δ1 underenhed som et eksempel på en CSC markør, metoder til at studere radiofølsomhed af CSCs i NSCLC cellelinjer præsenteres. CSCs er sorteret med formodede markører ved flow cytometri, og den selv fornyelseskapacitet af sorterede celler evalueres ved Sphere formation assay. Koloni dannelse assay, som bestemmer, hvor mange celler mister evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en vis dosis af stråling, er derefter udføres for at vurdere radiofølsomhed af sorteret celler. Dette manuskript giver de første skridt til at studere radio følsomheden af CSCs, som danner grundlag for yderligere forståelse af de underliggende mekanismer.
Introduction
Strålebehandling spiller en vigtig rolle i kræftbehandlingen. Eksistensen af radioaktive Cancer stamceller (CSCS) kan dog føre til tilbagefald eller dårlige resultater efter strålebehandling1,2. CSCs er karakteriseret ved deres selv fornyelsesevne og evne til at generere heterogene cancerceller3. Pansret med en mere effektiv DNA-skade reparations kapacitet eller højere niveauer af frie radikaler skylle systemer eller andre mekanismer, er CSCS relativt modstandsdygtige over for strålebehandling4,5,6,7 , 8. identificering af CSC-markører og udforskning af deres mekanismer vil lette udviklingen af lægemidler, der vil overvinde radioresistance uden at øge den normale vævsskade.
Spændings gated calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5 er blevet rapporteret som en markør for radioaktive CSCS i NSCLC cellelinjer9. α2δ1 blev oprindeligt identificeret som en CSC-markør for hepatocellulært karcinom (HCC)10. Ved hjælp af subtraktiv immunisering med et par HCC-cellelinjer afledt af de primære og tilbagevendende tumorer i den samme patient, blev et antistof ved navnet 1B50-1 identificeret til at målrette tilbagevendende HCC-celler specifikt. 1B50-1-positive celler viste høj sfære dannelse effektivitet in vitro og høj tumorigenicitet in vivo. Dets antigen blev identificeret ved massespektrometri, som calcium kanal α2δ1 underenhed isoform 5. α2δ1 udtrykker specifikt i CSCs og er ikke målbart i de fleste normale væv, hvilket gør det til en potentiel kandidat til målretning af CSCs10. α2δ1 kan også fungere som en CSC-markør for NSCLC-cellelinjer, og det har vist sig at give radioresistance til NSCLC-celler delvist ved at øge effektiviteten af reparation af DNA-skader som reaktion på stråling9.
At studere radioaktive CSCs kan give ledetråde til at overvinde radioresistance. Brug af α2δ1 i NSCLC som et eksempel, er vigtige metoder til at studere radio følsomheden af CSCs præsenteret. Normalt er CSCs isoleret med en formodet overflade markør, og stamcelle egenskaberne og radio følsomheden af de positive og negative cellepopulationer sammenlignes. Kugle dannelse i et serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer, der understøtter selvfornyelse er en nyttig analyse til at evaluere stemhed af celler in vitro. Celler med høj sfære dannelse kapacitet vil sandsynligvis vise høj tumorgenicitet når injiceres i immundefekt mus10,11,12. Koloni dannelse assay bruges derefter til at vurdere radiofølsomhed af celler, som afgør, hvor mange har mistet evnen til at generere efterkommere danner kolonien efter en dosis af stråling13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: der udføres trin under den angivne temperatur. For trin, hvor temperaturen ikke er nævnt, udføres under stuetemperatur (18 – 25 °C). Celle dyrkningsmediet skal opbevares ved 4 °C, og andre reagenser skal opbevares i overensstemmelse med producentens vejledninger. Medium skal præ-varmes til 37 °C, før de tilsættes til celler.
1. celle sortering
- Konjugation af antistoffer
Bemærk: i betragtning af den kortere inkubationstid foretrækkes direkte mærket antistof til celle sortering. Hvis der ikke findes et kommercielt direkte mærket antistof, skal du bruge fluorescein-konjuserende reagenser til at konjugere antistoffet til et fluorescerende farvestof i henhold til producentens vejledning (Se tabel over materialer). Da cellerne vil blive dyrket efter sortering, skal alle trin udføres i et biologisk sikkerhedskabinet eller laminar Clean bænk. For at undgå kontaminering anbefales det at tilføje antibiotika (penicillin og streptomycin) til dyrkningsmediet efter sortering.- Tilsæt 1 μL modifikatorreagens for hver 10 μL antistof, der skal mærkes. Bland forsigtigt.
- Tilsæt blandingen af antistof og modifikator direkte på den lyofiliserede fluorescein. Forsigtigt pipet. Lad hætteglasset stå i 3 timer eller natten over ved stuetemperatur (RT) i mørket.
- Tilsæt 1 μL QUENCHER-reagens for hver 10 μL antistof. Konjugaten kan anvendes efter 30 min. Fluorescein konjugat kan opbevares ved 4 °C i op til 18 måneder.
- Før sortering anbefales titrering af konjugeret antistof. Forbered celler, der udtrykker (f. eks. H1299 eller A549 for α2δ1) og ikke udtrykker (f. eks. H1975) markøren. Cellerne og inkubere dem med antistof ved forskellige koncentrationer (f. eks. 15 μg/ml, 7,5 μg/mL, 1,5 μg/mL og 0,75 μg/mL).
- Udfør flow cytometrisk analyse (med histogram eller prik plot) og vælg den koncentration, hvori positive celler i H1299 eller A549 kan adskilles fra isotype kontrol og H1975 celler har lidt uspecifikke signaler.
- Celle mærkning
- Kultur A549 celler i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) i 10 cm retter ved 37 °C og 5% CO2 i en cellekultur inkubator. Fordøje cellerne som følger for sortering, når de når 80% – 90% sammenløbet (ca. 5 – 10 x 106 celler pr. skål).
- Fjern dyrkningsmediet. Vask celler med 3 mL fosfat bufferet saltvand (PBS) kortvarigt. Tilsæt 3 mL 0,05% trypsin til hver skål. Tag trypsin ud, og lad den residuære trypsin være til at fordøje cellerne ved 37 °C i 1 – 3 min. Kontroller, at cellerne ofte er løsrivelse for at undgå over fordøjelse.
Bemærk: nogle cellelinjer kan være relativt svære at fordøje, såsom NSCLC-cellelinjer H520 og PC9. I en sådan situation, 3 ml trypsin kan efterlades i skålen, snarere end fordøjelse med resterende trypsin. Desuden kan Fordøjelsestiden forlænges. - Når cellerne bliver løse og begynder at løsne sig fra skålene, tilsættes 3 mL RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og pipetter cellesuspensionen i et 50 mL rør.
- Centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 5 min. kassér supernatanten. Tilsæt 10 mL PBS for at resuspendere cellerne. Overfør 0,5 mL (eller mindst 5 x 105 celler) af cellesuspensionen til et nyt rør som en isotype kontrol. De resterende celler er til sortering.
- Centrifuger både kontrol-og forsøgs rørene ved 300 x g ved 4 °C i 5 min. kassér supernatanten.
- Arbejdsopløsningen forberedes til farvning ved fortynding af det fluorescerende farvestof-konjugeret isotype kontrol eller antistof i PBS til den optimale koncentration titreret som nævnt ovenfor.
Bemærk: i dette eksperiment blev FITC-konjugeret 1B50-1 (antistof af α2δ1) fortyndet til 7,5 μg/mL. Mængden af arbejds løsning afhænger af celle beløbet. - Resuspendere kontrol og eksperimentelle celler med hver arbejds løsning på omkring 2-5 x 107 celler/ml og bland forsigtigt. Prøverne inkubates ved RT i 30 – 40 minutter i mørke.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 10 mL PBS til prøverne, blandes forsigtigt og centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 5 min. kassér supernatanten. Resuspension af celler med 10 mL PBS.
- Sæt 40 μm-celle-strainere på nye 50 mL-rør til henholdsvis kontrol-og forsøgs celler. Påfør cellesuspension på si og indsamle gennemstrømnings-through.
Bemærk: dette trin fjerner celle klumper, der kan blokere kapillær af celle sorteringen. - Centrifugen gennemstrømningen ved 300 x g ved 4 °C i 5 min. kassér supernatanten. Resuspension cellerne med 0,2 – 1,0 mL PBS derefter overføres til en 5 mL rør til flow cytometry.
- Celle sortering efter flow cytometri
- Forbered to 5 mL rør til at indsamle de positive og negative cellepopulationer. Tilsæt 1 mL RPMI 1640-medium i hvert rør. Placer rørene på indsamlings platformen af celle sorteringen.
- Analyser kontrol cellerne og eksperimentelle celler henholdsvis med dot plot. Gate de levende celler med parametrene Forward scatter (FSC) og side scatter (SSC). Gate den positive og negative population af levende celler i henhold til FL-1 intensitet.
- Saml de α2δ1-positive celler og α2δ1-negative celler. Registrer antallet af celler, du har opnået.
- For at bekræfte, at de høstede cellepopulationer har et forskelligt niveau af α2δ1-ekspression, kan der udføres en kvantitativ polymerasekæde reaktion (QPCR).
- Ekstrakt RNA af positive og negative celler med guanidinium thiocyanat reagens og omvendt transskription RNA i cDNA i henhold til producentens vejledning. Udfør QPCR med SYBR Green reagens. De sekvenser af primere er som følger: α2δ1-F, cagttgagatggaggatgatg; α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGTGTGTC; Gapdh-F, GTCGGAGTCAACGGATTTGG; og Gapdh-R, AAAAGCAGCCCTGGTGACC.
2. analyse af kugle dannelse
Bemærk: Sphere formation assay anvendes til at bestemme cellernes selv fornyelsesevne. Celler med selv fornyelseskapacitet kan danne kugler i dette serum frie halvfaste medium suppleret med vækstfaktorer. Alle trin skal udføres i et biologisk sikkerhedskabinet eller laminar Clean bænk. For at undgå kontaminering anbefales det at tilføje antibiotika (penicillin og streptomycin) til dyrkningsmediet efter sortering.
- Medium forberedelse
- Forbered 2x DMEM/F-12 medium ved at reintegrere en 1 L pakke med DMEM/F-12 pulver i 475 mL destilleret vand. Tilsæt 2,438 g NaHCO3. Juster pH til 7,0 – 7.2 ved langsomt at tilføje 1 N NaOH eller 1 N HCl med omrøring. Tilsæt destilleret vand til en endelig volumen på 500 mL. Steriliser mediet ved at filtrere gennem et 0,2 μm filter.
- Der tilbereder en 2% methylcellulose opløsning ved tilsætning af 2 g methylcellulose til 100 mL destilleret vand. Autoklave opløsningen. Methylcellulose kan vise en bomulds lignende tilstand efter autoklaveringen. Bland det ved at vende flasken op og ned forsigtigt i nogle få gange og lad den være til naturlig afkøling. Det vil blive en transparent halv solid natten.
- For at opnå 20 mL selv fornyelses medium tilsættes 10 mL 2x DMEM/F-12 medium til et 50 mL rør. Tilsæt 400 μL B27 til mediet. Tilsæt rekombinant humant epidermal vækstfaktor (EGF) til en endelig koncentration på 25 ng/mL. Tilsæt rekombinant humant grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) til en endelig koncentration på 25 ng/mL. Der tilsættes 2% methylcellulose for at nå en endelig volumen på 20 mL.
- Bland mediet med vortex, så selv fornyelses mediet opnås.
- Celle såning
- Overfør de høstede celler til selv fornyelses mediet for at nå 2000 celler/mL og bland dem med en kort hvirvel. Tilsæt 100 μL cellesuspension til hver brønd af en ultra-lav vedhæftet fil 96 brønd plade. Brug ikke brøndene ved kanten af pladen, da mediet er mere tilbøjelige til at fordampe i disse brønde. Tilsæt steriliseret vand til disse brønde.
- Kultur ved 37 °C med 5% CO2 i cellekultur inkubator i 10 – 14 dage. Tilsæt 50 μL selv fornyelses medium på dag 5 – 7.
- Sfære optælling og beregning
- 10 – 14 dage efter såning, tælle antallet af kugler med mere end 50 celler (ca.) eller med en diameter på mere end 100 μm under et mikroskop (4X objektiv linse, 10x okular).
Bemærk: med start fra øverste venstre side af brønden, tælle sfærerne, mens du flytter objektiv bordet vandret mod højre med joysticket af mikroskopet. Flyt derefter tabellen målsætning til den midterste række i det visuelle felt, og Tæl sfærerne fra højre mod venstre. Flyt derefter til den nederste række, og tæl fra venstre mod højre. En brønd af 96 brønd plade kan tælles inden for tre rækker. - Beregn sfære dannelse effektivitet som antallet af kugler divideret med antallet af celler seedet. Sammenlign sfære dannelse effektivitet mellem de positive og negative cellepopulationer.
- 10 – 14 dage efter såning, tælle antallet af kugler med mere end 50 celler (ca.) eller med en diameter på mere end 100 μm under et mikroskop (4X objektiv linse, 10x okular).
3. analyse af koloni dannelse
Bemærk: koloni dannelse assay anvendes til at bestemme radiofølsomhed af celler. Stråling kan leveres af en lineær accelerator, der anvendes til strålebehandling. Celle bestrålings system til laboratoriebrug kan også anvendes, hvis udstyret er til rådighed. Trin 3,1, 3.2.3 og 3.2.6 skal udføres i et biologisk sikkerhedskabinet eller laminar Clean bænk. For at undgå kontaminering anbefales det at tilføje antibiotika (penicillin og streptomycin) til dyrkningsmediet efter sortering.
- Celle såning
- Forbered en 6 brønd plade for hver strålingsdosis inklusive 0 Gy gruppen. Tilsæt 1,5 mL medium til hver brønd på 6 brønd plader. Kulturmedium for koloni dannelse assay er den konventionelle RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS (benævnt "afsluttet 1640").
- Fortyndet høstet celler med fuldført 1640 medium til 1000 celler/mL.
- Tilsæt cellesuspension til brøndene. Ryst pladerne vandret for at få cellerne til at fordeles jævnt i brøndene. Optag den tilføjede mængde i hver dosisgruppe.
Bemærk: generelt, frø 200 celler pr brønd for 0 Gy, 200 celler for 2 Gy, 400 celler for 4 Gy, 800 celler for 6 Gy, og 1600 celler for 8 Gy, hhv. Det er bedre at justere celle numrene i usarterede celler i præ-eksperimenter. - Kultur ved 37 °C med 5% CO2 i cellekultur inkubator.
- Stråling
- Efter celler har fastgjort til bunden af brøndene (normalt en dag efter såning, og længere tid anbefales ikke at overveje celle spredning), fortsætte med at udføre celle stråling.
- Beregn antallet af Monitor enheder (MU) for hver dosis i en dybde på 1 cm i en 20 cm x 20 cm stråling felt.
Bemærk: antal MU = dosis (cGy)/udgangs faktor for strålingsfelt/procentvis dybde dosis (PDD) for dybden. For eksempel er udgangs faktoren for et 20 cm x 20 cm felt 1,066, PDD for 1,0 cm er 0,987, og antallet af MU for 8 Gy (800 cGy) er 760 (800/1.066/0.987 = 760,35). Hvis flere plader skal udstråles for hver dosis, kan der også anvendes et større felt, og antallet af MU skal genberegnes i henhold til feltets størrelse. Output faktor og PDD varierer i forskellige acceleratorer. Se strålings fysikere for disse parametre. - Tilsæt fuldført 1640 til hver brønd for at nå 1 cm for højden af mediet.
Bemærk: cellevækst område på 6 brønd plade kan findes på producentens vejledning. For eksempel, hvis vækstområdet er 9,5 cm2 for hver brønd af 6 brønd plade, og 1,5 ml medium og 0,4 ml cellesuspension er blevet tilføjet på dagen før, derefter tilsættes 7,6 ml medium til brønden. Højden er nødvendig for dosis opbygning. En medium højde på mindre end 0,8 cm anbefales ikke.
Bemærk: hold pladerne dækket under strålingen. Når pladerne er overført mellem cellekultur værelse og strålebehandling rum, wrap pladerne med aluminiumsfolie eller sætte dem i en ren boks for at undgå kontaminering. Hold pladerne fladt for at undgå, at mediet breder sig. - Sæt en 20 cm x 20 cm stråling felt. Placer en vævs ækvivalent bolt på 1,0 cm tykkelse på behandlings sofaen, og Placer 6-brønden på bolt pladen for at holde dem i kontakt. Sørg for, at hele pladen er inden for strålings området. Indstil kildens hudafstand som 100 cm. Juster det mellemstore overflade niveau til laserniveauet ved at justere højden på behandlings sofaen.
Bemærk: plader med samme strålingsdosis kan udstråles på samme tid. I dette tilfælde er der behov for et større strålingsfelt, og antallet af MU skal genberegnes i henhold til den tilsvarende output faktor. Sørg for, at alle pladerne er inden for strålings området. - De enkelte tildelte doser leveres til hver plade i rækkefølge.
Forsigtig: den lineære accelerator kan kun betjenes af kvalificerede teknikere. Holdes væk fra stråling. - Tag pladerne tilbage til cellekultur rummet. Skift mediet med 2 mL gennemført medium for hver brønd. Kultur ved 37 °C med 5% CO2 i cellekultur inkubator. Skift mellem mediet hver 3 – 5 dage.
- Farvning
- 7 – 10 dage efter stråling, når mange kolonier form, og før de vokser for store og fusionere sammen, derefter udføre farvning og tælle som følger. Fjern mediet, og vask kortvarigt med PBS. Tilsæt 1 mL af 4% formaldehyd til hver brønd for at reparere cellerne.
Forsigtig: formaldehyd er flygtig. Brug formaldehyd i en stinkhætte. - Efter 10 minutters fiksering fjernes formaldehyd og vaskes med 2 mL destilleret vand hvert godt to gange.
- Tilsæt 1 mL 1% krystalviolet plet opløsning til hver brønd. Pletten i 10 min. Fjern den krystal violette plet opløsning, og vask med destilleret vand 3 gange. Fjern vandet og tør pladerne.
- 7 – 10 dage efter stråling, når mange kolonier form, og før de vokser for store og fusionere sammen, derefter udføre farvning og tælle som følger. Fjern mediet, og vask kortvarigt med PBS. Tilsæt 1 mL af 4% formaldehyd til hver brønd for at reparere cellerne.
- Kolonitælling og-beregning
- Tæl antallet af kolonier med mere end 50 celler. Medtag ikke små kolonier med mindre end 50 celler. Kontroller kolonierne under et mikroskop for at få et indtryk af en koloni, der udgøres af 50 celler, og Markér den på bunden af pladen med en markør pen.
Bemærk: fotografering af brøndene og brug af softwaren ImageJ vil lette Optællingsprocessen. - Beregn koloni dannelse effektivitet som antallet af kolonier divideret med antallet af celler seedet. Overlevelses fraktionen beregnes som koloni dannelses effektiviteten ved en bestemt bestrålingsdosis divideret med koloni dannelses effektiviteten ved 0 Gy.
- Ved hjælp af dosis som x-akse og overlevelses fraktion som y-aksen kan der opnås en overlevelses kurve. Sammenlign overlevelses kurverne mellem de positive og negative cellepopulationer.
- Tæl antallet af kolonier med mere end 50 celler. Medtag ikke små kolonier med mindre end 50 celler. Kontroller kolonierne under et mikroskop for at få et indtryk af en koloni, der udgøres af 50 celler, og Markér den på bunden af pladen med en markør pen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
α2δ1-høj-og α2δ1-Low A549-celler blev sorteret (figur 1a). Nogle markører kan vise forskellige populationer og er nemme at Gate. Men nogle markører viser kun høje og lave udtryks mønstre i stedet for tydelige positive og negative populationer. I denne situation er en isotype kontrol meget vigtig for gating. Udtrykket α2δ1 i de sorteres celler valideres af qPCR. Ekspression af CACNA2D1, genet, der koder α2δ1, er højere i sorteret α2δ1-høje celler sammenlignet med α2δ1-lave celler (figur 1b).
Typisk morfologi af kugler er vist i figur 2a. Kugle dannelses effektiviteten beregnes i α2δ1-høj-og α2δ1-lav-celler (figur 2b). α2δ1-høje celler viste højere sfære dannelse effektivitet, tyder på en højere selv-fornyelse kapacitet. Typiske billeder af celle kolonier er vist i figur 3a. En koloni med omkring 50 celler kan undersøges under et mikroskop og markeres som en reference. En overlevelses fraktion ved hver dosis kan beregnes, og overlevelses kurverne præsenteres i figur 3b. α2δ1-høje celler er relativt modstandsdygtige over for stråling sammenlignet med α2δ1-lave celler.
Uparret tosidet Student's t-test blev udført for at evaluere betydningen mellem grupperne. En værdi på p < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Data er repræsenteret med middelværdien og standardafvigelsen (SD). Der fremlægges repræsentative data fra mindst tre biologisk uafhængige eksperimenter med tilsvarende resultater.
Figur 1: sortering af α2δ1-høj og α2δ1-lave celler i A549. A) repræsentativ flowcytometri-analyse af udtryk i α2δ1. Celler er indhegnet baseret på isotype-kontrolelementet. B) bekræftelse af et udtryk for α2δ1 i høje og lave populationer ved qPCR. Fejllinjerne indikerer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bestemmelse af sfære dannelse af α2δ1-høj og α2δ1-lav A549 celler. A) repræsentativ morfologi for de sfærer, der dannes af de sorteret α2δ1-høje og α2δ1-lave celler (bar = 200 μm). (B) sfære dannelse effektivitet af α2δ1-høj og α2δ1-lav celler. Fejllinjerne indikerer SD (* * * p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af koloni dannelse af α2δ1-høj og α2δ1-lav A549 celler. A) repræsentative billeder af kolonierne dannet af de sorteret α2δ1-høje og α2δ1-lave celler. B) overlevelses kurver for α2δ1-høj og α2δ1-lave celler. Antallet af seedede celler var 200 celler pr brønd for 0 Gy, 400 celler pr brønd for 4 Gy, og 800 celler for 8 Gy. Fejllinjerne indikerer SD (* * p < 0,05, * * * p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver metoder til at studere radio følsomheden af CSCs i Cancer cellelinjer in vitro. I dette studie er ekspression af α2δ1 kontinuerlig i NSCLC-cellelinjer. Derfor er gating baseret på en isotype kontrol. Før sortering skal α2δ1-ekspression undersøges i flere cellelinjer ved flow cytometri og valideres af QPCR eller Western blot. Det anbefales at re-analysere α2δ1 ekspression af de sorterede α2δ1-høje og α2δ1-Low-celler ved flow cytometri, ved at observere fluorescens under et fluorescerende mikroskop eller ved QPCR (efter sortering).
Sphere formation assay er en enkel måde at evaluere selv fornyelseskapacitet, som kan bruges til foreløbigt at karakterisere formodede CSCs. Denne metode er blevet brugt til kultur Neuro kugler eller mammokugler til at karakterisere stamceller i gliom eller brystkræft celler, og formlen er modificeret til kultur andre typer af kræft4,6,10. EGF og bFGF kan støtte selvfornyelse af stamceller i serumfrit medium; Men, grundlæggende medium og vækstfaktorer kan variere for dyrkning af forskellige celletyper. Det halvfaste medium bruges til at immobilisere celler, så sfærer dannes ved celle spredning snarere end klyngedannelse sammen. Ultralow fastgørelsesplade bruges i forsøget til at vedligeholde Sphere morfologi. Desuden, som CSCS er beriget efter sfære kultur, når sfærerne er indsamlet, fordøjet, og seedet for sekundær sfære dannelse, sfære dannelse effektivitet er tilbøjelige til at stige i efterfølgende seriel udbredelse9,10. En strengere kriterier for karakterisering af CSCS er in vivo begrænsende fortynding assay, hvor en række af sorteret positive og negative celler injiceres subkutant i immundefekt mus, derefter hyppigheden af tumorigent celler i positiv og negative cellepopulationer beregnes10,14. Hvis en formodet kræft stamcelle markør identificeres ved Sphere formation assay, anbefales yderligere karakterisering ved in vivo-begrænsning af fortyndings analysen.
I denne undersøgelse evalueres radio følsomheden af CSCs. Koloni dannelse assay er en klassisk måde at vurdere radio følsomhed. Såning samme antal celler i parallelle brønde i vigtige. Juster celle nummeret pr. mL til et passende område for at sikre, at mængden af cellesuspension, der tilsættes til hver brønd, er mere end 100 μL. Hvis lydstyrken er for lille, vil fejlen sandsynligvis øges. For celle stråling tilsættes medium med en højde på 1 cm for dosis opbygning, og en vævs ækvivalent bolt anbringes under pladen for dosis-Backscatter. Forskere anbefales at henvise til stråling fysikere og teknikere til at oprette celle stråling model og beregne dosis.
Dette manuskript giver de første få trin til røntgen følsomheds studiet af CSCs. Yderligere mekanisme undersøgelser kan omfatte proteiner i forbindelse med DNA-skader reparation, clearance af reaktive ilt arter, celle cyklus anholdelse, etc.15. Disse eksperimenter har brug for en stor mængde celler; Derfor er mange retter af celler er nødvendige for at være forberedt. Overekspression eller knockout/Knockdown af CSC-gener giver også vigtig indsigt i, hvordan CSCs får radioresistance.
Disse metoder kan potentielt anvendes til at identificere CSCs i Cancer væv. Zhang et al. beskrev isolerende CD166-positive Lin-negative celler fra NSCLC kirurgiske prøver12. Væv blev hakket med en steril klinge og fordøjet med en enzym cocktail. Celler indsamlet ved at passere gennem celle-sier blev mærket til sortering, og derefter karakteriseret ved Sphere formation assay og in vivo begrænsende fortynding analyse. For α2δ1 som en CSC-markør, er det blevet rapporteret at isolere CSC i hepatocellulære karcinom kirurgisk væv og småcellet lungekræft patient-afledte xenograft væv10,16. I betragtning af et stort antal celler er nødvendige for analyse, det er relativt vanskeligt at isolere CSCs i biopsier eller cirkulerende tumorceller. Alternativt, farvning sektionerne af biopsier kan potentielt give fingerpeg for eksistensen af CSC i tumorer. Denne formodede anvendelse skal dog evalueres i patientvæv og kliniske data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81402535 og 81672969) og nationalt nøgle forsknings-og udviklingsprojekt (2016YFC0904703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red | Thermo Fisher | 15400054 | Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water |
| 1B50-1 | This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097) | ||
| 4% formaldehyde solution | Solarbio | G2160 | |
| A549 | ATCC | RRID: CVCL_0023 | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher | 1336 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 12500062 | |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16140071 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher | PHG0261 | |
| Flow cytometer/cell sorter | BD | FACSARIA III | |
| H1299 | ATCC | RRID: CVCL_0060 | |
| H1975 | ATCC | RRID: CVCL_1511 | |
| Lightning-Link Fluorescein Kit | Innova Biosciences | 310-0010 | |
| linear accelerator | VARIAN | CLINAC 600C/D | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M7027 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher | 11875093 | |
| SYBRGREEN | TOYOBO | QPK-201 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Violet crystal staining solution | Solarbio | G1062 |
References
- Brunner, T. B., Kunz-Schughart, L. A., Grosse-Gehling, P., Baumann, M. Cancer stem cells as a predictive factor in radiotherapy. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 151-174 (2012).
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nature Reviews Cancers. 8 (7), 545-554 (2008).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Research. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Wang, W. J., et al. MYC regulation of CHK1 and CHK2 promotes radioresistance in a stem cell-like population of nasopharyngeal carcinoma cells. Cancer Research. 73 (3), 1219-1231 (2012).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Gomez-Casal, R., et al. Non-small cell lung cancer cells survived ionizing radiation treatment display cancer stem cell and epithelial-mesenchymal transition phenotypes. Molecular Cancer. 12 (1), 94 (2013).
- Mihatsch, J., et al. Selection of radioresistant tumor cells and presence of ALDH1 activity in vitro. Radiotherapy and Oncology. 99 (3), 300-306 (2011).
- Sui, X., Geng, J. H., Li, Y. H., Zhu, G. Y., Wang, W. H. Calcium channel α2δ1 subunit (CACNA2D1) enhances radioresistance in cancer stem-like cells in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Management and Research. 10, 5009-5018 (2018).
- Zhao, W., et al. 1B50-1, a mAb raised against recurrent tumor cells, targets liver tumor-initiating cells by binding to the calcium channel α2δ1 subunit. Cancer Cell. 23 (4), 541-556 (2013).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Letters. 322 (2), 139-147 (2012).
- Zhang, W. C., et al. Glycine decarboxylase activity drives non-small cell lung cancer tumor-initiating cells and tumorigenesis. Cell. 148 (1-2), 259-272 (2012).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C.
- O'Brien, C. A., Kreso, A., Jamieson, C. H. Cancer stem cells and self-renewal. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3113-3120 (2010).
- Morgan, M. A., Lawrence, T. S. Molecular pathways: overcoming radiation resistance by targeting DNA damage response pathways. Clinical Cancer Research. 21 (13), 2898-2904 (2015).
- Yu, J., et al. Mechanistic exploration of cancer stem cell marker voltage-dependent calcium channel α2δ1 subunit-mediated chemotherapy resistance in small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 24 (9), 2148-2158 (2018).
