Summary
We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.
Abstract
De studie van kleine Rna's (Srna's) door Next-generation sequencing (NGS) wordt uitgedaagd door bias issues tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Verschillende types sRNA zoals plant microRNAs (miRNAs) dragen een 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modificatie op hun 3 ' terminale nucleotide. Deze wijziging voegt een andere moeilijkheid toe omdat het 3 ' adapterligatie remt. We hebben eerder aangetoond dat gewijzigde versies van het Protocol ' TruSeq (TS) ' minder bias en een verbeterde detectie van 2 '-OMe Rna's hebben. Hier beschrijven we in detail Protocol ' TS5 ', die de beste algehele prestaties toonde. TS5 kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia of reagentia uit de TS-Kit, met gelijke prestaties.
Introduction
Kleine Rna's (Srna's) zijn betrokken bij de beheersing van een diversiteit aan biologische processen1. De eukaryotische regelgevende Srna's zijn meestal tussen de 20 en 30 NT groot; de drie belangrijkste types zijn microRNAs (miRNA), piwi-interageren Rna's (piRNA) en kleine storende Rna's (siRNA). Afwijkende miRNA-uitdrukkings niveaus zijn betrokken bij een verscheidenheid aan ziekten2. Dit onderstreept het belang van miRNAs in gezondheid en ziekte en de eis voor nauwkeurige, kwantitatieve onderzoeksinstrumenten om Srna's in het algemeen te detecteren.
Next-generation sequencing (NGS) is een veelgebruikte methode om Srna's te bestuderen. De belangrijkste voordelen van NGS in vergelijking met andere benaderingen, zoals kwantitatieve PCR-of Microarray technieken (qPCR), zijn dat het geen a priori kennis van de sRNA-sequenties nodig heeft en daarom kan worden gebruikt om nieuwe Rna's te ontdekken, en bovendien lijdt het minder achtergrond signaal en verzadiging effecten. Verder kan het enkele nucleotide-verschillen detecteren en heeft het een hogere doorvoer dan micro arrays. Echter, NGS heeft ook een aantal nadelen; de kosten van een reeks sequentiëren blijven relatief hoog en het proces voor meerdere stappen dat nodig is om een steekproef in een bibliotheek voor sequentiëren te converteren, kan biases introduceren. In een typisch sRNA Library voorbereidingsproces, een 3 ' adapter wordt eerst geligeerd aan de sRNA (vaak gel-gezuiverd van totaal RNA) met behulp van een afgeknotte versie van RNA ligase 2 (RNL2) en een voorgeadenyleerd 3 ' adapter (Figuur 1) bij afwezigheid van ATP. Dit verhoogt de efficiëntie van sRNA-adapter ligatie en vermindert de vorming van nevenreacties zoals sRNA circularisatie of concatemerization. Vervolgens wordt een 5 '-adapter geligeerd door RNA ligase 1 (RNL1), gevolgd door omgekeerde transcriptie (RT) en PCR-versterking. Al deze stappen kunnen vooroordelen3,4introduceren. Daarom lezen getallen mogelijk niet werkelijke sRNA expressieniveaus leidt tot kunstmatige, methode afhankelijke expressie patronen. Specifieke Srna's kunnen ofwel over-of ondervertegenwoordigd zijn in een bibliotheek, en sterk ondervertegenwoordigd Srna's kunnen ontsnappen aan detectie. De situatie is bijzonder gecompliceerd met plantaardige Mirna's, Sirna's in insecten en planten, en Pirna's in insecten, nematoden en zoogdieren, waarbij de 3 ' terminale nucleotide een 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modificatie1heeft. Deze modificatie remt sterk 3 ' adapter ligatie5, waardoor bibliotheek voorbereiding voor dit soort RNA een moeilijke taak.
Vorige werk toonde aan dat de ligatie van de adapter ernstige bias introduceert, als gevolg van RNA-sequentie/structuur-effecten6,7,8,9,10,11. Stappen stroomafwaarts van de ligatie van de adapter, zoals omgekeerde transcriptie en PCR, dragen niet significant bij aan bias6,11,12. Ligatie bias is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat adapter moleculen met een bepaalde sequentie zullen interageren met sRNA moleculen in het reactiemengsel om co-plooien te vormen, die ofwel kunnen leiden tot gunstige of ongunstige configuraties voor ligatie (Figuur 2). Gegevens van Sorefan et al7 SUGGEREREN dat RNL1 de voorkeur geeft aan een enkele gestrande context, terwijl RNL2 een dubbele streng prefereert voor ligatie. Het feit dat de adapter/sRNA co-fold structuren worden bepaald door de specifieke adapter en sRNA sequenties verklaart waarom specifieke sRNA zijn over-of ondervertegenwoordigd met een bepaalde Adapterset. Het is ook belangrijk op te merken dat binnen een reeks sRNA-bibliotheken die moeten worden vergeleken, dezelfde adapter sequenties moeten worden gebruikt. Sterker nog, het is eerder waargenomen dat het veranderen van adapters door de invoering van verschillende barcode sequenties verandert Mirna profielen in sequencing bibliotheken9,13.
Randomisatie van adapter sequenties in de buurt van het ligatie knooppunt vermindert waarschijnlijk deze biases. Sorefan en collega's7 gebruikte adapters met 4 willekeurige nucleotiden aan hun extremiteiten, aangewezen "High Definition" (HD) adapters, en toonde aan dat het gebruik van deze adapters leiden tot bibliotheken die beter weerspiegelen echte Srna expressieniveaus. Meer recent werk bevestigde deze waarnemingen en bleek dat de gerandomiseerde regio niet hoeft te worden grenzend aan de ligatie junctie11. Dit nieuwe type adapters kreeg de naam "MidRand" adapters. Samen tonen deze resultaten aan dat een verbeterd adapter ontwerp de bias kan verminderen.
In plaats van de adapters te wijzigen, kan bias worden onderdrukt door het optimaliseren van reactieomstandigheden. Polyethyleenglycol (PEG), een macromoleculaire verdringings middel waarvan bekend is dat het de ligatie-efficiëntie14verhoogt, is aangetoond dat het de bias15,16significant vermindert. Op basis van deze resultaten verschenen er verschillende "low bias" kits op de markt. Deze omvatten kits die gebruik maken van PEG in de ligatie reacties, hetzij in combinatie met klassieke adapters of HD-adapters. Andere kits Vermijd ligatie helemaal, en gebruik 3 ' polyadenylering en sjabloon switching voor 3 ' en 5 ' adapter optellen, respectievelijk12. In nog een andere strategie, 3 ' adapter ligatie wordt gevolgd door een circularisatie stap, dus weglaten 5 ' adapter ligatie17.
In een eerdere studie zochten we naar een sRNA Library Preparation protocol met de laagst mogelijke niveaus van bias en de beste detectie van 2 '-OMe RNAs12. We testten enkele van de bovengenoemde ' low bias ' kits, die een betere detectie hadden van 2 '-OMe Rna's dan het standaardprotocol (TS). Verrassend echter, bij modificatie (het gebruik van gerandomiseerde adapters, PEG in de ligatie reacties en verwijdering van overtollige 3 ' adapter door zuivering) de laatste presteerde beter dan de andere protocollen voor de detectie van 2 '-OMe Rna's. Hier beschrijven we in detail een protocol op basis van het TS-protocol, ' TS5 ', dat de beste algemene detectie van 2 '-OMe Rna's had. Het protocol kan worden gevolgd met behulp van reagentia uit de TS-Kit en één reagens uit de ' NF ' Kit of, om geld te besparen, met behulp van zelfgemaakte reagentia, met gelijke prestaties. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor de zuivering van sRNA van totaal RNA en de bereiding van preadenylated 3 '-adapter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolatie van kleine Rna's
- Extract totaal RNA met behulp van fenol reagentia of een andere methode. Controleer of het RNA van goede kwaliteit is.
- Pre-run een 15% TBE-ureum gel (Zie tabel van de materialen) voor 15 min bij 200 V.
- Meng, terwijl de gel voorloopt, 5-20 μg totaal RNA in een 5-15 μL-volume met een gelijk volume formamide-belastingskleurstof (Zie tabel met materialen; 95% gedeïoniseerd formamide, 0,025% broomfenolblauw, 0,025% xyleen cyanol, 5 mm EDTA pH 8) in een PCR-buis van 200 μL. Meng ook 10 μL (200 ng) van de Small-RNA-ladder (Zie tabel met materialen) met een gelijk volume formamide-belastingskleurstof. Incuberen gedurende 5 minuten bij 65 °C in een Thermocycler met een verwarmd deksel en leg de buisjes onmiddellijk op het ijs.
- Laad de ladder en het monster op dezelfde gel met ten minste één rijstrook tussen hen en voer op 200 V totdat de broomfenolblauw (donkerblauw) ongeveer twee derde van de gellengte heeft gemigreerd (ongeveer 40 min).
- Bereid een systeem voor om het RNA van de gel als volgt te elzen: Prik de bodem van een Nuclease-vrije 0,5 mL micro centrifugebuis met een 21-gauge naald. Plaats de geperforeerde 0,5 mL tube in een Nuclease-vrije rond-bodem 2 mL micro centrifugebuis.
- Verwijder de gel en inbroed bij kamertemperatuur met 3 μL nucleïnezuur gelvlek (10.000 x concentraat; Zie tabel van de materialen) in 30 ml water voor 10-15 min.
- Bekijk de gel op een ' Dark Reader'-transilluminator (het wordt sterk aanbevolen om UV te vermijden omdat dit het RNA kan beschadigen) en snijd het RNA van het monster tussen de 17 NT-en de 29 NT-ladder banden. Breng het gelstuk over naar de 0,5 mL buis uit stap 1,5.
- Centrifugeer de buis van 0,5 mL in de 2 mL buis in een micro centrifuge bij maximale snelheid gedurende 2 min. Verwijder de buis van 0,5 mL, die nu leeg moet zijn.
- Voeg 300 μL Nuclease-vrije 0,3 M NaCl toe aan de 2 mL tube met de gemalen gel en draai gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts (16 uur).
- Breng de suspensie van geplette gelstukken over naar een spin kolom (Zie tabel met materialen) en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij maximale snelheid in een micro centrifuge.
- Voeg 1 μL (20 μg/μL) glycogeen (Zie tabel van de materialen) en 950 μL kamertemperatuur 100% ethanol toe. Inincuberen gedurende ten minste 30 min bij-80 °C.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij maximale snelheid in een micro centrifuge bij 4 °C. Verwijder het supernatant, was de pellet met 800 μL koude 80% ethanol. Centrifugeer nogmaals gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig alle supernatant. Respendeer RNA pellet in 15 μL Nuclease vrij water. Typisch, ~ 5-20 ng van kleine RNA moet worden teruggewonnen, afhankelijk van de hoeveelheid input totaal RNA (~ 1 ng van kleine RNA per 1 μg input totaal RNA).
- Aanbevolen extra stap: Controleer de hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde sRNA (bijv. door capillaire gel elektroforese met behulp van een kleine RNA-Kit; Zie tabel met materialen).
2. bereiding van preadenylated 3 ' HD-adapter
Opmerking: Preadenylering van 3 ' HD-adapter werd gedaan op een manier vergelijkbaar met het protocol beschreven door Chen et al18. Merk op dat preadenylated adapter direct kan worden besteld (/5rApp/modificatie), maar dit is vrij duur.
- Bestel 5 ' fosforyleerd, 3 ' geblokkeerd 3 ' HD-adapter oligonucleotide. Zie tabel 1 voor volgorde en wijzigingen. Merk op dat ' 3AmMO ' een 3 ' amino modifier groep is, de meeste leveranciers kunnen met deze modificatie oligonucleotide produceren. Verdun in Nuclease vrij water tot 100 μM.
- Stel een reactie van 100 μL in met de volgende reagentia: 10 μl oligo (100 μM), 10 μL T4 RNA ligase buffer (10x), 10 μL ATP (10 mM), 40 μL 50% PEG8000, 5 μL T4 RNA ligase 1 (50 eenheden), 25 μL Nuclease-vrij water. Inincuberen bij 20 °C.
- Voer een klassieke fenol-chloroform extractie uit van het voorgeadenyleerd oligonucleotide gevolgd door ethanol precipitatie. Voeg 100 μL zuur (pH 4,5) fenol toe: chloroform en Vortex. Draai gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, maximale snelheid. Breng 90 μL van de bovenste fase voorzichtig over naar een nieuwe buis; Voeg 10 μL Natriumacetaat van 3 M toe pH 5,2, 1 μL ultrazuiver glycogeen en 250 μL koude 100% ethanol.
- Houd bij-20 °C gedurende ten minste 30 min. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij een maximale snelheid van 4 °C. Verwijder het supernatant, was de pellet één keer met 500 μL koude 80% ethanol. Als alternatief voor fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie kan een nucleotide verwijderings pakket worden gebruikt (zie tabel met materialen). Respendeer in 25 μL water.
- Meet de concentratie van de adapter met behulp van een Kit voor specifieke detectie van enkel-streng DNA (Zie tabel met materialen). Verdun tot 80 ng/μL (10 μM).
- Aanbevolen extra stap: Controleer de werkzaamheid van preadenylatie door 1 μL 10 μM-adapter te migreren op een 15% TBE-ureum gel (tabel met materialen) samen met onbehandeld oligonucleotide. De preadenylated adapter moet iets langzamer migreren dan onbehandeld oligonucleotide. Indien gewenst, de preadenylated adapter kan gel-gezuiverd; Ga verder zoals hierboven beschreven (stappen 1.2-1.12).
3. voorbereiding van de bibliotheek-protocol TS5
Opmerking: we presenteren hier het gewijzigde TS-Protocol ' TS5 ' dat we eerder beschreven12 en dat kan worden uitgevoerd met reagentia uit de kit of met zelf geleverde reagentia. Opgemerkt moet worden dat we vergelijkbare of zelfs iets betere resultaten verkregen met een ander protocol, ' TS7 '. Met TS7 is het echter moeilijker om adapter dimers te elimineren. We hebben daarom de voorkeur gegeven aan TS5 in detail te beschrijven, maar TS7 kan worden gevolgd door simpelweg de adapters te vervangen. Gebruik voor TS7 de adapter sequenties ' MidRand-like (MRL) ' (tabel 1). Merk op dat hier de gerandomiseerde gebieden in het midden van de adapters. Primers voor omgekeerde transcriptie en PCR zal hybridiseren aan de sequenties stroomafwaarts van de gerandomiseerde regio in de 3 ' adapter en stroomopwaarts van de gerandomiseerde regio in de 5 ' adapter. Sequentiëren zal beginnen met de eerste gerandomiseerde nucleotide in de 5 ' adapter.
- 3 ' adapter ligatie.
- Combineer 1 μL preadenylated 3 ' HD-adapter (10 μM) met 1 μL gezuiverd klein RNA (~ 0,1-1 μM) in een micro centrifugebuis van 0,2 mL. Inbroed gedurende 2 minuten bij 72 °C in een thermo cycler, en vervolgens direct op het ijs zetten.
- Voeg 4 μL van 50% PEG 8000 (viskeuze oplossing; pipet langzaam), 1 μL RNA ligase buffer (10x), 1 μL H2O, 1 ΜL T4 RNA ligase2 afgekapt, en 1 μl RNase inhibitor. Inincuberen op 16 °C.
- Eliminatie van niet-ligated 3 ' adapter
- Voeg 10 μL Nuclease vrij water toe en meng goed. Voeg 6 μL 3 M NaOAc pH 5,2 of ' adapter depletie oplossing ' uit de NF-Kit (inhoudstafel) toe en meng goed. Voeg 40 μL magnetische zuiverings kralen (tabel met materialen) en 60 μL isopropanol toe en meng goed. Incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats het monster in een magnetisch rek totdat de oplossing duidelijk blijkt. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe. Inincuberen voor ~ 30 s, dan verwijderen. Wees voorzichtig met het gebruik van vers bereide 80% ethanol en inbroed niet met 80% ethanol gedurende langere periodes.
- Draai de buis kort en verwijder de restvloeistof die mogelijk op de bodem van de put is verzameld. Laat de kralen 2 minuten drogen en breng vervolgens in 22 μL van 10 mm tris pH 8 of resuspensie buffer van de NF-Kit aan. Inincuberen gedurende 2 minuten, dan magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt.
- Voeg 6 μL van 3 M NaOAc pH 5,2 of ' adapter depletie oplossing ' uit de NF-Kit (tafel van de materialen) toe aan een nieuwe buis. Breng 20 μL van het supernatant van de vorige stap naar deze nieuwe buis en meng door Pipetting. Voeg 40 μL magnetische kralen en 60 μL 100% isopropanol toe en meng goed door pipetten. Inincuberen gedurende 5 min.
- Magnetiseer het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt, verwijder dan het supernatant en gooi het weg.
- Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe. Inincuberen voor ~ 30 s, dan verwijderen. Take zorg voor het gebruik van vers bereide 80% ethanol en niet inbroed voor met 80% ethanol voor langere periodes.
- Draai de buis kort en verwijder de restvloeistof die mogelijk op de bodem van de put is verzameld. Laat de kralen 2 minuten drogen en breng in 10 μL Nuclease vrij water door. Inincuberen gedurende 2 minuten, dan magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt.
- Breng 9 μL supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 1 μL T4 RNA ligase buffer (10x) en 1 μL water toe. U ook 2 μL ligase-buffer uit de TS-Kit toevoegen.
- Ligatie van 5 ' adapter.
- Voeg 1 μL 5 ' HD-adapter (10 μM; Tabel 1) tot een PCR-buis van 200 μL in een thermo cycler met verwarmd deksel. Inbroed gedurende 2 minuten bij 70 °C en zet de buis vervolgens direct op ijs.
- Voeg 1 μL 10 mM ATP en 1 μL T4 RNA ligase 1 toe. Meng goed door het zachtjes pipetteren. Voeg 3 μL van deze mix toe aan het 3 ' geligeerd RNA van stap 3.2.9 en meng door pipetten. Incuberen gedurende 1 uur bij 28 °C.
- Omgekeerde transcriptie (RT)
- Breng 6 μL 3 "en 5"-adapter met geligeerd RNA over in een nieuwe PCR-buis van 200 μl (Houd de resterende ~ 8 μl bij-80 °c voor later gebruik indien nodig). Voeg 1 μL RT primer (10 μM; Tabel 1) en meng door pipetten. Inbroed gedurende 2 minuten bij 70 °C en zet de buis vervolgens direct op ijs.
- Voeg de volgende reagentia toe voor RT: 2 μL van 5x eerste streng buffer, 0,5 μL van 12,5 mM dNTP-mix, 1 μL van 100 mM DTT, 1 μL RNase-remmer en 1 μL reverse-transcriptase (tabel van materialen). Incuberen gedurende 1 uur bij 50 °C.
- PCR-versterking
- Voeg de volgende reagentia toe aan de 12,5 μL RT-reactiemengsel: 10 μL PCR-polymerase buffer, 2 μL universele P5 primer (10 μM; Tabel 1), 2 μL P7-Index Primer (10 μM; Tabel 1), 1 μl van 12,5 mm Dntp's, 0,5 ΜL van DNA-polymerase (tabel van materialen) en 22 μl water. Houd de reactie op ijs tot gebruik.
- Voer het volgende PCR-programma uit: 98 °C gedurende 30 sec., 11 cycli (98 °C voor 10 sec., 60 °C gedurende 30 sec. en 72 °C gedurende 15 sec.) en 72 °C gedurende 10 min. Houd de reactie bij 4 °C wanneer u klaar bent.
Opmerking: wat betreft het aantal PCR-cycli: meestal voeren we 11 cycli uit, maar dit moet worden geoptimaliseerd door de gebruiker. Probeer het kleinst mogelijke aantal PCR-cycli uit te voeren.
- Gel zuivering
- Voer 5, 10 en 20 μL PCR-product uit op een native gel van 6% TBE (Zie tabel met materialen) samen met een geschikte ladder (Zie tabel met materialen). Voer de gel ongeveer 1 uur uit bij 145 V (totdat de broomfenolblauw de bodem bereikt; deze kleurstof migreert op de positie 65 BP).
- Verwijder de gel en inincuberen met nucleïnezuur gel Stain (Zie tabel van de materialen) in water voor 10-15 min.
- Bekijk de gel op een "Dark Reader" transilluminator (het wordt sterk aanbevolen om UV te vermijden omdat dit het RNA kan beschadigen) en knip de bibliotheek band af op 150 BP. bereid een systeem voor om het RNA van gel te elzen zoals beschreven in stap 1,5 en breng het gelstuk over naar de 0,5 mL Tube.
- Centrifugeer in een micro centrifuge bij maximale snelheid gedurende 2 min. Verwijder de buis van 0,5 mL, die nu leeg moet zijn.
- Voeg 300 μL Nuclease vrij water toe aan de 2 mL tube met de gemalen gel en draai gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts.
- Breng de suspensie van geplette gelstukjes in water over naar een spin kolom en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij maximale snelheid.
- Voeg 1 μL (20 μg/μL) glycogeen, 30 μL 3 M NaOAc en 975 μL ijskoud 100% ethanol toe. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij maximale snelheid bij 4 °C.
- Respendeer de pellet in 20 μL van 10 mM tris pH8. Gebruik 1 μL voor concentratiemeting en 1 μL voor kwaliteitscontrole.
4. gegevensanalyse
Opmerking: de hieronder beschreven procedure voor gegevensanalyse is gebaseerd op het Linux-besturingssysteem Ubuntu 16,04 LTS.
- Behandeling van RAW sequence-bestanden
- Download de FASTQ sequentie bestand (en) gegenereerd tijdens de sequentiëren run. Voer indien nodig demultiplexing uit met bcl2fastq2 (versie V 2.2.18.12; een handleiding kan worden gedownload via de volgende link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
Gebruik de volgende opdracht:
nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --negeren-ontbrekende-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1--geaggregeerd-tegels automatisch-r 16-d 16-p 16-w 16 - Verwijder adapter sequenties met behulp van Cutadapt19 versie 1,15. Een handleiding kan hier worden gedownload: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
Gebruik de volgende opdracht:
Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-een TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz
Merk op dat de sequentie in de opdracht overeenkomt met de 3 ' HD-adapter zonder de 4 willekeurige nucleotiden; Deze zullen dus niet worden verwijderd tijdens deze stap. - Gebruik seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) voor het verwijderen van de terminale willekeurige nucleotiden in de sequentiëren leesbewerkingen. Gebruik de volgende opdracht (variabele namen in vet):
seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _bijgesneden . fastq - Gebruik de volgende awk-opdracht om de sequenties van minder dan 10 NT te verwijderen:
awk ' begin {FS = "\t"; OFS = "\n"} {header = $0; getline SEQ; getline qheader; getline qseq; if (length (SEQ) > = 10) {Print header, seq, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_bijgesneden. fastq > Length_Filtered. fastq
- Download de FASTQ sequentie bestand (en) gegenereerd tijdens de sequentiëren run. Voer indien nodig demultiplexing uit met bcl2fastq2 (versie V 2.2.18.12; een handleiding kan worden gedownload via de volgende link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
- Toewijzing van de bijgesneden sequenties
- Download de database die overeenkomt met het organisme van de studie van miRBase als volgt. Ga naar http://www.mirbase.org/ftp.shtml en Download het bestand ' Mature. fa '. Merk op dat de sequenties worden aangegeven in RNA notatie. Vervang de U-residuen door T met de volgende opdracht:
sed-i '/^ >/! s/U/T/g ' volwassen. FA
Opmerking: dit zal een volledige lijst opleveren van alle Mirna's in miRBase, afkomstig van verschillende organismen. - Selecteer de miRNA-sequenties van uw organisme met de volgende opdracht:
awk 'name_of_the_organism{print; NR [nr + 1]; volgende}; NR in nr ' volwassen. FA > mature_name_of_the_organism_MIRS. FA - De leesbewerkingen toewijzen aan de hierboven gemaakte bestand met behulp van Bowtie220 (versie 2.3.0) waardoor er geen mismatches. Maak eerst een index voor uw bestand met de volgende opdracht:
bowtie2-build mature_name_of_the_organism_Dapengbaai. FA mature_name_of_the_organism_Dapengbaai - De sequentiëren leesbewerkingen uitlijnen op de database, vereisen dat een lezen wordt volledig toegewezen aan een miRNA van de database, zonder enige mismatches. Gebruik hiervoor het volgende hulpprogramma:
bowtie2-N 0-L 10--Score-min C, 0, 0--end-to-end-x mature_name_of_the_organism_Dapengbaai-U Length_Filtered. fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam
Opmerking: de optie:--Score-min C, 0, 0 zorgt ervoor dat de uitlijning zonder enige mismatches is. Voor een uitleg van de verschillende parameters in de tool, u terecht op de volgende website: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml - Als u de leesbewerkingen wilt negeren die niet zijn uitgelijnd, gebruikt u de volgende opdracht:
samtools View-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam
Opmerking: als gevolg van deze stappen moet u nu de uitgelijnde leesbewerkingen hebben verkregen, overeenkomend met miRNAs.
- Download de database die overeenkomt met het organisme van de studie van miRBase als volgt. Ga naar http://www.mirbase.org/ftp.shtml en Download het bestand ' Mature. fa '. Merk op dat de sequenties worden aangegeven in RNA notatie. Vervang de U-residuen door T met de volgende opdracht:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kritische stappen zijn de isolatie van de kleine RNA-Fractie van het start totaal RNA-materiaal (Figuur 3) en het gewenste uiteindelijke bibliotheek product (Figuur 4). Beide stappen betreffen de zuivering van polyacrylamidegel; klein RNA is geïsoleerd van 15% TBE ureum gels, terwijl de uiteindelijke bibliotheken geïsoleerd zijn van 6% inheemse TBE gels. Klein RNA geïsoleerd van gel kan worden geanalyseerd op een kleine RNA capillaire elektroforese chip (tabel van materialen; Figuur 3 B). Dit zal gebruikers in staat stellen om de hoeveelheid klein RNA teruggewonnen en de verhouding van Mirna in het preparaat te schatten.
Gel zuivering van de uiteindelijke bibliotheek product is een delicate stap als een aantal extra producten worden gevormd die migreren dicht bij de gewenste bibliotheek. Het is belangrijk om de gel niet te overladen, omdat dit het risico zal verhogen om de bibliotheek te besmetten met andere soorten zoals adapter dimers. Als voorbeeld (Figuur 4) werden steeds grotere hoeveelheden PCR-versterkte bibliotheek (van B. napus RNA) op de gel geladen en het product dat overeenkomt met de verwachte grootte (150 BP) werd uitgesneden (Figuur 4A). Na elutie, de gezuiverde bibliotheek werd gecontroleerd op een capillaire gel elektroforese chip; Naast het verwachte 150 BP-product werd een toenemend deel van een 130 BP-soort, overeenkomend met adapter Dimeren, gezien als toenemende hoeveelheden PCR-producten werden geladen (Figuur 4B, C).
We hebben getest of protocol TS5 op dezelfde manier presteert als met zelfgemaakte reagentia als met reagens van de kits. Daartoe bereidden we bibliotheken voor van een mix van synthetische kleine Rna's 1-6, elk aanwezig zonder of met een 2 '-OMe modificatie, zoals gedaan in onze vorige studie12. Figuur 5 toont het aantal leesbewerkingen dat overeenkomt met elk van deze rna's die eerder zijn verkregen en met de nieuwe bibliotheken die zijn gemaakt met behulp van reagentia van de TS-en NF-Kits of van andere leveranciers. Zoals kan worden gezien, zeer vergelijkbare resultaten werden verkregen.
Figuur 6 toont een vergelijking van de prestaties van protocol TS5 met het standaard TS-protocol voor de detectie van installaties (a. thaliana en B. napus) miRNAs, die 2 '-OMe gemodificeerd zijn, en van niet-gemodificeerde humane mirna's. We testten ook de detectie van piRNAs, 2 '-OMe aangepast in menselijke monsters. Zoals kan worden gezien, presteert TS5 significant beter dan TS voor de detectie van 2 '-OMe Rna's, maar niet voor ongewijzigde Rna's. Echter, ook voor niet-gemodificeerde Srna's, hoewel niet een groter aantal Rna's worden gedetecteerd, de verkregen lees nummers waarschijnlijk beter reflecteren ware expressieniveaus met TS5 dan met TS als gevolg van lagere niveaus van bias.
Figuur 1 . Schematische representatie van de sRNA Library Preparation workflow voor Illumina sequencing. Ten eerste worden Srna's geïsoleerd door een gel-zuiveringsstap. Hier wordt het groottebereik van miRNAs aangegeven, maar elk ander maatbereik kan worden geselecteerd, afhankelijk van de RNAs van belang. Vervolgens wordt een kwaliteitscontrole (QC) stap uitgevoerd om de kwaliteit en kwantiteit van geïsoleerde sRNA te controleren. Tijdens de voorbereiding van de bibliotheek wordt een preadenylated (app) 3 '-adapter eerst aan de sRNA geligd. Vervolgens wordt een 5 ' adapter ligated. Vervolgens wordt omgekeerde transcriptie uitgevoerd met behulp van een primer die complementair is aan de 3 '-adapter, gevolgd door PCR-versterking, waarbij de Illumina P5, P7 en index (' in ') sequenties worden toegevoegd. De resulterende bibliotheek is gel gezuiverd, gevolgd door een kwaliteitscontrole stap. Vervolgens wordt de bibliotheek gesequentieerd en worden de gegevens geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Bias als gevolg van sequentie afhankelijke adapter-sRNA co-vouwen. In de adapter ligatie mengsel, adapters zal cofold met Srna's op een manier die afhankelijk is van de volgorde van de adapter en de sRNA. Zo, verschillende Srna's (geïllustreerd door voorbeelden a, b, en c; aangegeven door verschillende tinten groen) zal anders samen met een bepaalde adapter (de 3 ' adapter is aangegeven in het rood, de 5 ' adapter is aangegeven in blauw). De zwarte pijlen geven ligatie knooppunten aan. Dit kan leiden tot een gunstige of ongunstige context voor ligatie. Aangezien RNL2 lijkt te prefereren een dubbel gestrande omgeving, 3 ' ligatie naar verwachting efficiënter voor RNAs a en b dan voor RNA c. Met RNL1 met een voorkeur voor een enkele gestrande regio rond het ligatie knooppunt, kan 5 ' adapter ligatie het meest efficiënt zijn voor RNA a, gevolgd door b en ten minste efficiënt voor c. samen kan dit resulteren in een oververtegenwoordiging van sRNA a, een intermediair representatie van RNA b en een ondervertegenwoordiging van RNA c in de uiteindelijke bibliotheek, zelfs als de drie Rna's aanwezig zijn op gelijke hoeveelheden in het oorspronkelijke RNA-monster. Merk op dat op soortgelijke wijze een bepaalde sRNA anders zal worden weergegeven bij het wijzigen van de adapter volgorde (bijv. door het toevoegen van verschillende barcodes). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 . Isolatie van kleine RNA en kwaliteitscontrole. A). elektroforetisch scheiden van totaal RNA van Brassica napus (10 μg) op een 15% TBE-ureum-denaturerende polyacrylamidegel. Een kleine RNA ladder (Zie tabel van de materialen) werd samen gemigreerd als een moleculaire grootte marker. Na de migratie werd de gel gekleurd en werd het RNA gevisualiseerd op een trans-illuminator. De regio van 17 tot 29 nucleotiden werd afgesneden (aangegeven door een rode rechthoek) en RNA werd geelokt. (B). de kwaliteit van het gezuiverde RNA werd gecontroleerd door elektroforese met capillaire gel. Merk op dat deze analyse informatie verschaft over de verhouding van miRNA in het monster (93% in dit geval). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 . Gel zuivering van een B. napus kleine RNA-bibliotheek voorbereid na protocol TS5 en kwaliteitscontrole. (A). toenemende hoeveelheden van een PCR-versterkte bibliotheek van B. napus Small RNA werden geladen op een 6% inheemse TBE gel; 2,5 μL (a), 5 μL (b), 10 μL (c) of 20 μL (d) PCR-product. Daarnaast werd een 50 BP-ladder gemigreerd. PCR-producten die op de verwachte positie van 150 PB migreren, werden geïsoleerd (rode rechthoek), DNA werd geeluleerd en gezuiverd. (B). kwaliteitscontrole van de gezuiverde bibliotheek; gelrepresentatie. C). electropherogram representatie van dezelfde analyse. Zoals te zien is, wordt het product 150 PB steeds meer verontreinigd met adapter Dimeren (~ 130 BP) naarmate grotere hoeveelheden PCR-producten op gel worden gemigreerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 . Protocol TS5 presteert vergelijkbaar met reagentia van de TS-en NF-Kits of met reagentia van andere leveranciers. Histogrammen die het percentage vertegenwoordigen van het totale aantal onbewerkte leesbewerkingen (vóór het trimmen) overeenkomend met RNA (OMe) 1-6 met protocol TS5 gevolgd door reagentia van de TS-en NF-Kits (blauwe staven), of reagentia van andere leveranciers (oranje staven). Ter vergelijking, resultaten van onze vorige studie worden weergegeven door grijze balken. Het totale aantal leesbewerkingen overeenkomend met RNA1-6 (totaal RNA) of RNA-OMe1-6 (totaal RNA-OMe) worden ook weergegeven. Weergegeven zijn de gemiddelde waarden van ten minste twee onafhankelijke experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Een deel van dit cijfer is gewijzigd van DARD-Dascot et al, 201812Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 . Vergelijking van miRNA detectie van protocol TS5 met de klassieke TS-methode. (A). het percentage leesbewerkingen voor A. thaliana, B. napus of H. sapiens miRNAs in mirbase werd bepaald. We hebben ook de leesbewerkingen van de Human libraries aan piRBase in kaart gebracht voor piRNA detectie. Merk op dat A. thaliana en B. napus miRNAs, evenals menselijke pirna's 2 '-OMe gemodificeerd zijn, in tegenstelling tot menselijke miRNAs. Weergegeven zijn de gemiddelde waarden van ten minste twee onafhankelijke experimenten en de foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. (B). aantal geïdentificeerde miRNAs (of pirnas). We bepaalden het aantal bekende Mirna's van de verschillende soorten die geïdentificeerd werden met protocollen TS of TS5. Merk op dat voor A. thaliana, B. napus, of H. sapiens, 427, 92 en 2588 miRNAs zijn geregistreerd in mirbase, respectievelijk. 500.000 leesbewerkingen van de TS-of TS5-bibliotheken werden toegewezen aan B. napus miRNAs in mirbase, 1.000.000 leesbewerkingen werden toegewezen aan de A. thaliana of Human databases. Weergegeven zijn de gemiddelde waarden van ten minste twee onafhankelijke experimenten met standaarddeviaties die worden weergegeven door foutbalken. Dit cijfer is gewijzigd van DARD-Dascot et al, 201812. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam oligonucleotide | 5 ' wijziging | 3 ' wijziging | sequentie 5 ' tot 3 ' | Zuivering | |||||
| 5 ' HD (TS5)-adapter | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNrNrNrN (merk op dat deze oligo een DNA-RNA Chimeric is; de drie 3 ' terminale NTS zijn RNA) | Hplc | ||||||
| 3 ' HD (TS5)-adapter | Fosfaat | 3AmMO | [PHOS] rNrNrNrNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG [3AaMO] (merk op dat deze oligo is een DNA-RNA Chimeric; de vier 5 ' Terminal NTS zijn RNA) | Hplc | |||||
| 5 ' MRL (TS7) adapter | 5AmMC6 | [5AmMC6] GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCNNNNrArCrGrArUrArC (merk op dat deze oligo een DNA-RNA Chimeric is; de zeven 3 ' terminale NTS zijn RNA) | Hplc | ||||||
| 3 ' MRL (TS7) adapter | alleen | 3AmMO | PHOS GTATCGTNNNNNNTGGAATTCTCGG [3AmMO] | Hplc | |||||
| RT primer | Een van de meest GESMOKKELDE schoenen | Hplc | |||||||
| Universele P5 primer | TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTSCAGAGTTCTACAGTCCGA | Hplc | |||||||
| P7-Index Primer | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA (NNNNNN = index) | Hplc | |||||||
| index 1: CGTGAT | |||||||||
| index 2: ACATCG | |||||||||
| index 3: GCCTAA | |||||||||
| index 4: TGGTCA | |||||||||
| index 5: CACTGT | |||||||||
| index 6: ATTGGC | |||||||||
| Index 7: GATCTG | |||||||||
| index 8: TCAAGT | |||||||||
| index 9: CTGATC | |||||||||
| index 10: AAGCTA | |||||||||
| index 11: GTAGCC | |||||||||
| index 12: TACAAG | |||||||||
Tabel 1. Oligonucleotiden die met dit protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kleine RNA-bibliotheek voorbereiding blijft uitdagend vanwege bias, voornamelijk geïntroduceerd tijdens de ligatie stappen van de adapter. Rna's met een 2 '-OMe modificatie op hun 3 ' einde zoals plant miRNAs, piRNA in insecten, nematoden en zoogdieren, en kleine interfererende Rna's (siRNA) in insecten en planten zijn bijzonder moeilijk te bestuderen omdat de 2 '-OMe modificatie remt 3 ' adapter ligatie. In de literatuur zijn een aantal oplossingen voorgesteld om de protocollen voor het opstellen van sRNA Library te verbeteren, maar de meeste commercieel verkrijgbare kits zijn nog steeds gebaseerd op het klassieke TS-protocol, dat ernstige bias heeft. Een paar ' low bias ' kits bestaan, echter, met inbegrip van de NF Kit met gerandomiseerde adapters en PEG in de ligatie reacties, en een paar kits verscheen onlangs dat adapter ligatie voorkomen helemaal12. We rapporteerden eerder dat NF meer verschillende Mirna's detecteert dan het standaard TS-protocol, maar het Protocol ' (zonder adapter ligatie) werd relatief slecht uitgevoerd vanwege een aanzienlijke vorming van nevenproducten12. Verrassend genoeg hadden de TS-protocollen bij modificatie een meer gevoelige detectie van 2 '-OMe Srna's dan de andere protocollen, maar niet van normale Srna's. We kozen hier om in detail te beschrijven het TS5 protocol, waarin de adapters zijn gerandomiseerd op hun extremiteiten, PEG wordt gebruikt in de ligatie reacties en overtollige 3 ' adapter wordt geëlimineerd door zuivering op kralen. Hierbij moet worden opgemerkt dat een ander protocol (TS7), met behulp van MRL-adapters kan iets beter dan het TS5-protocol uitvoeren. Echter, omdat er slechts kleine verschillen zijn tussen de twee en omdat met TS7, het moeilijker is om het gewenste bibliotheek product van adapter dimers te scheiden, hebben we er de voorkeur aan gegeven om in detail het TS5-protocol te beschrijven. Gebruikers kunnen echter desgewenst de TS5 adapters vervangen door TS7 adapters. Houd er rekening mee dat deze iets langer leiden tot een definitieve bibliotheek product van ~ 170 BP in plaats van ~ 150 BP.
De mogelijkheid om protocol TS5 of TS7 uit te voeren met ' zelfgemaakte ' materialen maakt het mogelijk om de kosten aanzienlijk te verlagen. Er kan echter een grotere variabiliteit zijn in termen van kwaliteit met zelfgemaakte materialen; vooral zelfgemaakte pre-adenylated 3 ' adapter kan onderhevig zijn aan variabele kwaliteit als gevolg van variërende werkzaamheid van pre-adenylering. Het wordt daarom aanbevolen om een grote voorraad voor te bereiden en als een nieuwe voorraad wordt voorbereid, vergelijk de prestaties met de vorige. Voor dit doel kan een controle-RNA-monster worden gebruikt.
Een nadeel van de protocollen hierin beschrijven is de relatief sterke vorming van nevenproducten en de moeilijkheid om de gewenste bibliotheek van deze producten te scheiden. Er moet voor worden gezorgd dat de acrylamidegel niet overbelast wordt voor zuivering. Onlangs werden gemodificeerde adapters ontwikkeld die een sterk gereduceerde neiging hebben om Dimeren21te vormen. Een 2 '-OMe modificatie aan het 3 ' uiteinde van de 5 ' adapter gecombineerd met een methylfosfonaat modificatie bij de 5 ' extremiteit van de 3 ' adapter onderdrukt de adapter dimers efficiënt. Het is interessant om dergelijke gewijzigde adapters te testen in het hierin beschreven protocol.
De gel-zuiveringsstappen in Protocol TS5 zijn relatief arbeidsintensief. Als het gebruik van gemodificeerde adapters de vorming van adapter dimers efficiënt vermindert, is het mogelijk dat de gelzuivering van de uiteindelijke bibliotheek niet meer nodig is. Bovendien, als alternatief voor de gel zuivering stap te isoleren kleine RNA (stap 1), een strategie met behulp van magnetische kralen te verrijken voor kleine Rna's bestaat (https://ls.beckmancoulter.co.jp/files/appli_note/Supplemental_Protocol_for_miRNA_.pdf). We hebben deze methode niet zelf gebruikt, maar het is de moeite waard om te testen en als het goed werkt, kan het het protocol aanzienlijk vereenvoudigen.
Concluderend, terwijl protocol TS5 verder kan worden verbeterd, presteert het beter dan in de handel verkrijgbare kits, althans die getest in onze eerdere vergelijkende analyse, voor de detectie van 2 ' OMe sRNA. Het kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte materialen, waardoor aanzienlijke kostenreductie. Voor het gemak, en misschien meer constante prestaties, kunnen reagentia van de TS en NF kits worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het National Center for Scientific Research (CNRS), de Franse alternatieve energieën en de Atomic Energy Commission (CEA) en de Paris-Sud Universiteit. Alle bibliotheek voorbereiding, Illumina-sequencing en bio-informatica analyses voor deze studie werden uitgevoerd bij de I2BC Next-generation sequencing (NGS) faciliteit. De leden van de I2BC NGS-faciliteit worden erkend voor het kritisch lezen van het manuscript en nuttige suggesties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes | |||
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
