Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60060
Automatic Translation
1,3, 2,3,4
1Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Research Service, VA Nebraska Iowa Health Care System, 3Department of Internal Medicine, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Environmental, Agricultural & Occupational Health, University of Nebraska Medical Center

Summary

I denne protokol er lymfocytter placeret i det øverste kammer af et transmigrerings system, adskilt fra det nederste kammer af en porøs membran. Chemokin tilsættes til det nederste kammer, som inducerer aktiv migration langs en chemokine gradient. Efter 48 h tælles lymfocytter i begge kamre for at kvantificere overførsel.

Abstract

Heri præsenterer vi en effektiv metode, der kan udføres med grundlæggende laboratorie færdigheder og materialer til at vurdere lymfocyt chemokinetisk bevægelse i et ex vivo transmigrerings system. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) og CD4+ T hjælpe celler blev isoleret fra deres og lunger af hønseæg ægalbumin (OVA)-udfordrede Balb/c-mus. Vi bekræftede udtrykket af CCR4 på både CD4+ T- celler og ILC2, forholdsvis. CCL17 og CCL22 er de kendte ligander for CCR4; ved hjælp af denne ex vivo-transmigrerings metode undersøgte vi derfor CCL17- og CCL22-induceret bevægelse af CCR4+ lymfocytter. For at etablere kemo gradienter blev CCL17 og CCL22 anbragt i det nederste kammer af transmigrerings systemet. Isolerede lymfocytter blev derefter føjet til top kamre og over en 48 h periode lymfocytter aktivt migreret gennem 3 μm porer mod chemokine i nederste kammer. Dette er et effektivt system til bestemmelse af de chemokinetik af lymfocytter, men, forståeligt nok, ikke efterligner de kompleksiteter findes i in vivo orgel mikromiljøer. Dette er en begrænsning af den metode, der kan overvindes ved tilsætning af in situ billeddannelse af orgel og lymfocytter under undersøgelse. I modsætning hertil fordelen ved denne metode er, at der kan udføres af en entry-level tekniker på en langt mere omkostningseffektiv sats end Live imaging. Som terapeutiske forbindelser bliver tilgængelige for at øge migration, som i tilfælde af tumor infiltrerende cytotoksiske immunceller, eller at hæmme migration, måske i tilfælde af autoimmune sygdomme, hvor immunopatologi giver anledning til bekymring, denne metode kan bruges som en screening værktøj. Generelt, metoden er effektiv, hvis chemokine af interesse er konsekvent genererer chemokinetics på et statistisk højere niveau end medierne kontrol. I sådanne tilfælde kan graden af hæmning/forbedring af en given forbindelse bestemmes så godt.

Introduction

Denne oprindelige transmigrering metode blev præsenteret af Stephen BoyDen i 1962 i Journal of eksperimentel medicin1. Meget af det, vi ved om chemotaxis og chemokinetik, ville ikke være muligt uden udvikling af BoyDen-kammeret. Før opdagelsen af den første chemokine i 1977, ex vivo transmigrering systemer blev brugt til at lære om serum-faktorer, der kunne arrestere cellulære bevægelse i makrofager mens forstærke cellulære motilitet i neutrofiler1,2. En massiv rigdom af viden er blevet udviklet med hensyn til immuncelle migration, og til dato, 47 kemokiner er nu blevet opdaget med 19 tilsvarende receptorer3,4. Desuden er fler mængder af hæmmere/smagsforstærkere af disse kemo okinveje undergået udvikling til terapeutiske formål5,6,7,8. Mange af disse forbindelser er blevet testet i lignende vandring kamre til at forstå direkte interaktioner mellem forbindelser og immuncelle reaktionsevne til en given chemokine9.

Transmigration, eller diapedesis, i betændelses vævet væv er en vigtig proces til en sund inflammatorisk respons på klar infektion10,11. Et BoyDen-kammer, transmigrerings system eller transwell-apparatur består almindeligvis af to kamre adskilt af en porøs membran1,12. Den nederste kammer oftest holder medier, der indeholder chemokine af interesse, mens leukocytter er placeret i øverste kammer. Størrelsen af pore i membranen kan vælges baseret på størrelsen af cellen af interesse. Til dette projekt, vi har valgt en 3 μm porøs membran, som lymfoide celler er 7-20 μm i størrelse, afhængigt af den fase af cellulære udvikling. Denne porestørrelse sikrer, at disse celler ikke passivt falder gennem porerne, men at de aktivt migrerer som reaktion på chemokine gradient.

Den største fordel ved denne protokol er dens omkostningseffektivitet. In vivo transmigration er vanskelig, fordi det kræver omfattende uddannelse i dyre håndtering og kirurgi, og ofte involverer høj-drevne mikroskopi, der ikke altid er til rådighed for en forsker. Omkostningseffektiv screening af forbindelser menes at forbedre eller hæmme overførsel kan opnås forud for in vivo Imaging. Da transmigrerings systemet er stramt kontrolleret, kan cellerne i første omgang behandles derefter til transwell-apparatet, eller, omvendt, kan chemokin behandles først med en chemokine-hæmmer, derefter tilsættes cellerne til transwell-apparatet. Endelig kan endotel celler og/eller kælder membran proteiner tilsættes til bunden af transwell INSERT 1-2 dage før transmigration eksperiment for at forstå inddragelsen af disse barriere celler i chemokinetics. Igen, disse manipulationer af systemet giver et effektivt middel til at bestemme vigtige oplysninger om effektiviteten af en given forbindelse forud for mere komplicerede in vivo undersøgelser.

Anvendelse af et transmigrerings kammer system er en effektiv metode til at vurdere lymfocyt mobilitet under forskellige in vivo-og in vitro-forhold12,13,14. Heri beskrives en optimeret metode til vurdering af ex vivo-lymfocyt respons på kemo okiner i et transmigrationskammer. I dette eksempel eksperiment blev CD4+ T- celler og gruppe 2-medfødte lymfoide celler (ILC2) isoleret fra mænd og kvinder, Balb/c-mus efter eksponering af æg-allergen. En hypotese blev genereret, at CCR4+ CD45+ LINEAGE-(Lin-) ILC2 fra allergen-udfordrede mus ville migrere mere effektivt mod CCL17 og CCL22 end CCR4+ CD4+ T hjælpe celler. CCL17 og CCL22 er kemo okiner, der almindeligvis produceres af dendritiske celler og makrofager af m2 (allergisk) fænotype, blandt andre celler, i allergi15,16. CCL17 og CCL22 kan opfattes som biomarkører af allergisk inflammation, da de let påvises i lungerne under luftvejs eksacerbationer16,17,18. Det er vigtigt, CCR4 ekspression er forhøjet i forhold til ubehandlede Kontroller, som afsløret i bioinformatiske data genereret fra ILC2 isoleret fra House Dust mide behandlede dyr, og tilsvarende ILC2 fra naive dyr behandlet ex vivo med Il-33 ( allergen-fremme af medfødte cytokin) opregulerer CCR419,20. Desuden, ifølge data for ILC2 i den immunologiske genom Project database (www.immgen.org), CCR4 mRNA er stærkt udtrykt i disse medfødte immunceller. Til dato, er lidt kendt om handel med ILC2 i væv, men det er sandsynligt, at ILC2 og CD4+ T celler bruger lignende kemo okiner og receptorer for chemotaxis og chemokinetics som de udtrykker lignende transkriptionsfaktorer og receptorer. Således sammenlignede vi CCL17 versus CCL22 reaktionsevne, af ILC2 og CD4+ T-lymfocytter, fra både mandlige og kvinder, æg-udfordrede dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, blev gennemgået og godkendt af de institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) og University of Utah.

1. opsætning og klargøring af reagenser

  1. Forbered komplet RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medier.
    1. 10 mL varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS) tilsættes til 90 mL RPMI.
    2. Tilsæt 1 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin til 100 mL 10% FBS RPMI.
  2. Forbered ILC2 udvidelses medier.
    1. Tilsæt IL-2 og IL-33 (20 ng/mL hver cytokin) til 10 mL komplet RPMI.
    2. Hvis lager cytokiner er 10 μg/mL, afpipetteres 20 μL IL-2 og IL-33 i et 15 mL rør, der indeholder 10 mL komplet RPMI-medie.
  3. Forbered lunge Dissociations medium.
    1. Tilsæt 50 mg type 1 kollagenase til 250 mL usuppleret RPMI.
    2. Tilsæt 2,5 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin til 250 mL af mediet i trin 1.3.1.
    3. Bland forsigtigt mediet for at sikre, at type 1-Kollagenase er helt opløst før brug.
  4. Forbered serumfri RPMI.
    1. 1 g lyofiliseret bovint serumalbumin (BSA) fortyndes i 200 mL RPMI.
    2. Tilsæt 2 mL 100x penicillin-streptomycin-glutamin.
    3. Bland forsigtigt mediet for at sikre, at BSA er helt opløst i mediet før brug.
  5. Forbered overførsels mediet med CCL17.
    1. Få 10 mL serumfrit RPMI, og tilsæt CCL17 [50 ng/mL].
      1. Hvis lager CCL17 er 10 μg/mL, tilsættes 50 μL CCL17 bestand til 10 mL serumfrit RPMI-medie.
  6. Forbered overførsels mediet med CCL22.
    1. Få 10 mL serumfrit RPMI, og tilsæt CCL22 [50 ng/mL].
    2. Hvis lager CCL22 er 10 μg/mL, tilsættes 50 μL CCL22 bestand til 10 mL serumfrit RPMI-medie.
  7. Forbered CCR4 antistof farvning cocktail.
    1. For 10 tests i alt tilsættes 5 μL af hvert af følgende antistoffer til et 5 mL rør: anti-Mouse CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 og ICOS.
      Bemærk: Eksempel på hvordan man laver antistof cocktail for 10 prøver: 0,5 μL af hvert antistof x 10 prøver = 5 μL af hvert af de antistoffer, der er anført i 1.7.1.
    2. Ved 10 tests i alt tilsættes 2,5 μL af følgende antistoffer mod antistof cocktailen fra trin 1.7.1: anti-Mouse CD3, CD11c og NK 1.1.
      Bemærk: Eksempel for at fuldføre antistof cocktail for 10 prøver: 0,25 μL x 10 prøver = 2,5 μL af CD3, CD11c og NK 1.1 antistoffer.
    3. Opbevar CCR4 antistof-farvnings cocktail ved 4 °C, indtil den er klar til at blive tilføjet til prøverne. Kassér antistof-cocktail efter 1 uge, hvis den ikke anvendes.
  8. Forbered 1x stabiliserende fixativ.
    1. 10 mL afioniseret destilleret vand tilsættes til 5 mL 3x stabiliserende fixativ koncentrat

2. klargøring af allergen-udfordrede BALB/c-mus

Bemærk: Han og hun BALB/c mus blev købt fra Charles River (UNMC) eller Jackson Laboratories (University of Utah) på 6 til 8 uger af alder.

  1. Efter akklikalering (1 uge), sensibiliserer alle dyr til æg.
    1. Kombiner 100 μg/mL OVA adsorbet til aluminiumhydroxid (20 mg/mL) i et 5 mL polystyren tube.
    2. Bland røret og træk straks 500 μL af æg-Alum-suspensionen til en 1 mL, 28 G sprøjte (insulin sprøjte).
    3. Placer en mus i en klokke krukke, der indeholder isofluran (1 – 2 mL under et falsk gulv, således at dyret ikke står direkte i isofluran). Lad musen gå under anæstesi i ca. 1 – 2 min, eller indtil hastigheden af respiration dråber.
    4. Hurtigt afhente musen ved pels på ryggen og skuldre og injicere 100 μl æg-Alum intraperitonealt per mus21,22.
    5. Placer musen tilbage i sit bur og se for at sikre, at de genvinde mobiliteten; Dette bør ske inden for 2-5 min.
  2. Syv dage efter sensibilisering, udsættes alle dyr til intranasal (i.n.) 1,5% æg fortyndet i sterilt saltvand i et nebuliserings kammer (data Sciences International) i 20 min.
    1. Fjern mus fra deres bure og placere dem i dyret nebulization kammer. Luk låget på kammeret.
    2. Fastgør nebuliserings slangen til indgangs tud på nebuliserings kammeret.
    3. Tilsæt 30 mL 1,5% æg fortyndet i sterilt saltvand til nebuliserings koppen på nebulisatoren.
    4. Tænd for forstøver og lad kammeret til at fylde med tåge i 20 min.
    5. Sluk for forstøver og lad tågen bosætte sig.
    6. Returner dyrene til deres bure.
  3. Gentag trin 2,2 for i alt 5 gange, på 5 på hinanden følgende dage, for at fremkalde allergisk inflammation.

3. isolering af CD4+ T-celler fra Spleens og LUNGER af æg-udfordrede mus

  1. Humant aflive alle æg-behandlede handyr og hundyr ved co2 kvælning i henhold til godkendte iacuc protokoller, ved hjælp af 2 til 3 dyr pr. gruppe, pr eksperiment.
  2. Punktafgiftspligtige lunger og deres fra dyr og anbringe væv i separate dissociations slanger baseret på dyrets vævstype og køn23.
  3. Dissocierer lungevævet i 500 μL lunge Dissociations medie (25 e/mL, collagenase, type 1) i den automatiserede vævs dissociator ved hjælp af» lunge «-protokollen.
    1. Gentag 3,2 og 3,3 i alt to gange.
  4. Dissocierer milt vævet i 500 μL komplet RPMI-medie ved hjælp af "milleen"-protokollen på den automatiserede vævs dissociator.
    Bemærk: De resterende trin skal udføres i et biologisk sikkerhedskabinet ved hjælp af steril teknik.
  5. De dissociations slanger, der indeholder lungerne og milten, skylles med 5 mL ekstra lunge Dissociations medie eller komplet RPMI.
  6. Filter celle suspensioner gennem en 40 μm celle sien og opsamles i 50 mL koniske rør.
  7. Inkubér lunge-homogenater i 15 – 30 minutter i en 37 °c inkubator med 5% Co2 for yderligere at adskille lungevævet.
  8. 5 mL komplet RPMI til lungerne og milten homogeniseres og pellet cellerne i bunden af 50 mL rør ved hjælp af centrifugering; 378 x g ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
  9. Kombiner splenocytter og Lungeceller i et enkelt 50 mL konisk rør og bestem total celletal ved hjælp af den automatiserede celle tæller.
  10. Juster mandlige og kvindelig celle suspensioner til 1 x 108 celler/ml i separations buffer og tilsæt til en 5 ml polystyren tube.
    Bemærk: Berignings protokollen kan justeres op til 14 mL polystyren rør, når flere celler er erhvervet fra milt og lunger. Denne protokol er designet til væv fra 2 – 3 mus pr. gruppe; Derfor bør et 5 mL rør være tilstrækkeligt.
  11. Brug ca. to tredjedele af de samlede celler til ILC2 isolation i henhold til ILC2 berigelses protokollen.
    1. Tilsæt antistof-cocktail (50 μL/mL) til cellesuspensionen, og Inkuber i 5 minutter ved RT.
    2. Vortex Rapid kugler for 30 s og tilsæt til prøven med en hastighed på 75 μL/mL cellesuspension. Bland forsigtigt og Inkuber i 5 minutter ved RT.
    3. Top røret op til 3 mL total volumen med separations buffer og Placer i 8-kammer Easy separation magnet. Inkuber i 3 minutter ved RT.
    4. Tip magneten fremad (væk fra kuglen-antistof-celle komplekser, der er fastholdt på bagsiden af røret), og afpipettér cellesuspensionen i et rent 5 mL rør.
    5. Tilsæt 1,5 mL komplet RPMI til rørene og centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
    6. Hæld mediet fra celle pellet og resuspender ILC2 ved 1 x 107 celler pr. ml.
    7. Placer 100 uL af mandlige og kvindelige ILC2 per brønd i en U-bund, 96-brønd plade og tilsæt 100 μL ILC2 udvidelses medier til hver brønd.
    8. Inkubatér cellerne i 4 – 5 dage for at udvide ILC2.
    9. Saml ILC2 i et 5 mL rør og tilsæt op til 4,5 mL serumfrit RPMI. Cellerne centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
    10. Tæl celler ved hjælp af en hemacytometer og resuspension ved 1 x 107 ILC2 per ml i serum-fri rpmi.
  12. Brug de resterende celler til CD4+ t celle isolation procedure, som udføres i henhold til musen CD4+ t celle isolation protokol med få modifikationer.
    1. Tilsæt rat serum (50 μL/mL) til den CD4 T-celle berigende suspension.
    2. Tilsæt isolations cocktail (50 μL/mL) til prøven og Inkuber i 10 minutter ved RT.
    3. Vortex Rapid kugler for 30 s og tilsættes til prøven med en hastighed på 75 μL/mL.
    4. Bland forsigtigt cellesuspensionen og Inkuber i 2,5 min og RT
    5. Top prøverne op til 3 mL og Placer 5 mL rørene i 8-kammer Easy separation magnet og inkuberes i 5 min ved RT.
    6. Tip magneten fremad, og afpipettér cellesuspensionen i et rent 5 mL rør.
    7. Tilsæt 1,5 mL serumfrit RPMI til rørene og centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
    8. Hæld mediet fra celle pellet og resuspendér CD4 + T- cellerne ved 1 x 107 celler pr. ml i serumfrit rpmi.

4. Bestem CCR4 udtryk på CD4+ T-celler og gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2) fra æg-udfordrede dyr ved strømnings cytometri

Bemærk: Følgende trin kan udføres på en åben bænk top, da de er ikke-sterile teknikker.

  1. Erhverve ca 1-2.5 x 105 ILC2 celler fra trin 3.11.10 og 1-2.5 x 106 CD4+ T celler fra trin 3.12.8 i separate 5 ml rør.
    1. Hold et ekstra rør på mindst 5,0 x 104 CD4 + T-celler som en uplettet kontrol.
  2. Cellerne suspenderes i 100 – 200 μL FACS-buffer, og der tilsættes 1 μL FC-blok til hvert rør, og derefter inkubates på is (eller i et 4 °C-køleskab) i 10 minutter.
  3. Tilsæt 1 – 2 mL FACS buffer til hvert rør og centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
  4. Hæld supernatanten af, og gensuspender cellerne i 100 – 200 μL FACS-buffer.
  5. Tilsæt 37,5 μL af den CCR4 antistof farvning cocktail til cellesuspensionen i hvert rør undtagen røret, der indeholder de ' ufarvede ' celler.
  6. Inkubér rørene på is eller i et 4 °C-køleskab i 20 – 30 minutter.
  7. Tilsæt 1 – 2 mL FACS buffer til hvert rør og centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
  8. Hæld supernatanten af.
  9. Gentag trin 4,7 og 4,8.
  10. Tilsæt 250 – 300 μL 1x stabiliserende fixativ (Se tabel over materialer) til hvert rør.
  11. Forbered enkelt-farvet perle kontrol for hvert antistof i CCR4 antistof cocktail i henhold til protokollen, der leveres med kompensation perler.
    1. Vortex kompensation perler.
    2. Tilsæt en dråbe af perlerne til hver enkelt farvet kontrol slange.
    3. Tilsæt 1 μL af hvert antistof i CCR4 antistof cocktail til sit eget mærkede rør.
    4. Bland forsigtigt og Inkuber i 10 minutter i et 4 °C-køleskab eller på is.
    5. Tilsæt 1 – 2 mL FACS buffer til alle rørene og centrifugeres ved 378 x g i 5 minutter ved rt.
    6. Hæld supernatanten af, og resuspender perlerne i 200 μL FACS buffer.
    7. De enkeltfarvede knapper opbevares i køleskab, indtil alle prøverne er plettet og klar til at blive analyseret på flowcytometer.
  12. Analysér de uforfarvede celler, enkeltfarvede kontroller og eksperimentelle prøver på flowcytometer inden for 24 timer af fiksering.

5. procedure for transmigration ex vivo

Bemærk: Følgende trin skal udføres i et biologisk Sikkerhedskabinet, da de kræver steril teknik.

  1. Erhverve ILC2 fra trin 3.11.10 og CD4 T celler fra trin 3.12.8 og bestemme antallet af transwell skær er nødvendige for eksperimentet.
    Bemærk: Eksempel: for 1,2 mL beriget CD4 T-celler fra trin 3.12.8 multipliceres 1,2 x 1.000 μL = 1.200 μL; divider derefter 1.200 uL med 100 μL = 12, det antal skær, som er nødvendige for CD4 T-overførsel.
  2. Bevæg forsigtigt de 3 μm transwell skær fra midterrækkerne på en 24-brønd plade.
  3. Tilsæt 500 μL af migrations medier med CCL17 til ca. en tredjedel af brøndene.
  4. Tilsæt 500 μL af migrations medier med CCL22 til en tredjedel af brøndene.
  5. Tilsæt 500 μL serumfrit RPMI, der ikke indeholder chemokin, til den sidste tredjedel af brøndene.
  6. Mærk tydeligt låget på pladen med de relevante transmigrerings medier placeret i de nederste brønde.
  7. Placer transwell skær tilbage i brøndene, der indeholder de forskellige behandlinger.
  8. Tilsæt forsigtigt 100 μL CD4 T-celler eller ILC2 til den øverste brønd i hver indsats. Du må ikke blande eller pipettere cellesuspensionen op og ned i transboringen, da dette kan bekræfte resultaterne af forsøget.
  9. Mærk tydeligt låget på pladen med celle typen placeret i hver brønd og skriv den dato og det tidspunkt på dagen, hvor cellerne blev tilføjet.
  10. Gentag trin 5,2 til 5,9, indtil alle cellerne er placeret i transwell-skær med mediet.
  11. Anbring forsigtigt pladen i en 37 °C-inkubator med 5% CO2 for 48 h. Minimer kontakten med pladen over inkubeations perioden.

6. kvantificering af ex vivo-overførsel

  1. Fjern forsigtigt pladen fra inkubatoren og fjern alle transwell skær fra midterrækkerne i de tomme brønde lige over eller under.
  2. Saml cellerne fra bunden og øverste brønde af transwell indsætter i rør mærket med TOP eller bund, med CCL17, CCL22, eller medier, med celletype, og med replikat nummer (mindst 3 replikater pr eksperiment).
  3. Skyl de nederste brønde med 500 μL 1x PBS, og saml denne skylning i det tilsvarende rør.
  4. Skyl de øverste brønde med 250 μL 1x PBS, og saml denne skylning i det tilsvarende rør.
  5. Pellet cellerne ved centrifugering ved 378 x g i 5 min ved rt.
  6. Afpipettér forsigtigt alle supernatanten fra celle pellet.
  7. Resuspension af T-celler og ILC2 til 50 μL 1x PBS.
  8. Tag 10 μL af celle suspensionerne, og tilsæt 90 μL 0,4% trypan og et Blue.
  9. Tæl cellerne på den automatiserede celle tæller.
    1. Rekord% rentabilitet.
    2. Registrer celletal pr. mL for hver prøve.
    3. Bestemme det samlede antal celler pr. behandling i toppen og det nederste kammer; Optag celle optællinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CCR4 udtryk på CD4 + T-celler og ILC2.

For succesen med ex vivo-transmigrerings eksperimentet er det bydende nødvendigt at afgøre, om lymfocytterne reagerer på CCL17 og CCL22 gennem CCR4; Derfor fastsatte vi CCR4 udtryk på både CD4+ T- celler og ILC2 ved flow cytometri. Selv om det er velkendt, at OVA-specifikke CD4+ Helper T CELLS Express CCR4, mindre er kendt af udtrykket CCR4 på ILC2. Figur 1 viser repræsentative resultater af CCR4 udtryk, forholdsvis, på CD4+ T celler (figur 1A, C) og ILC2 (figur 1B, D) fra mandlige og kvinde, OVA-udfordret Balb/C mus. Flowcytometri blev anvendt til at detektere CCR4 ved hjælp af et monoklonalt antistof konjugeret til allophycocyanin (APC). Ved hjælp af envejs analyse af variansen (ANOVA) fastsatte vi, at der ikke var forskelle i CCR4 udtryk mellemmand lige og hunlige værter (figur 1A – D), men udtrykket af CCR4 på en per celle basis (MFI) på ILC2 var højere i forhold til CD4 + T-cellerne (figur 1c sammenlignet med figur 1d). Disse resultater er vigtige for at vise, at ILC2-og CD4+ T- cellerne skal reagere på CCL17 og CCL22 i det følgende eksperiment.

Respons på CD4+ T- celler til CCR4 ligander i øverste og nederste kamre i et transmigrerings system.

CD4+ T-celler fra mandlige, OVA-udfordrede Balb/c-mus blev isoleret fra lungerne og deres og anbragt i det øverste kammer af et transmigrerings apparat adskilt af en 3 μM porøs membran (figur 2). Der vises en oversigt over den in vivo-tilberedning af æg-behandlede mus (figur 2a) og transmigrerings proceduren (figur 2b). En kombination af CCL17 (25 ng/mL) og CCL22 (25 ng/mL) blev anbragt i det øverste kammer, det nederste kammer eller både top-og bund kamrene for at bekræfte (figur 2c), (1) at CD4+ T-cellerne fra æg-udfordrede dyr var LYDHØRE over for CCR4 ligands, og (2) at chemokine-induceret migration var en aktiv proces, hvormed T-celler bevægede sig gennem porerne som reaktion på chemokine gradient, og at lymfocytter ikke bevægede sig gennem porerne uafhængigt af chemokine. Et medie (ingen chemokine) kontrol var inkluderet for at vise, at CD4+ T- celler ikke kunne migrere gennem 3 μM porer uden stimulation. I denne tilstand forblev den højeste procentdel af cellerne i det øverste kammer. Når chemokinerne blev placeret i øverste og nederste kammer samtidig, vi opdaget 52% af de samlede T-celler i det nederste kammer og 48% af cellerne i det øverste kammer (TOP/bund behandling). Som forventet, fordelingen af celler flyttes som reaktion på chemokine placeret kun i toppen eller kun i det nederste kammer, som vi opdaget den højeste procentdel af celler i rummet, hvor chemokine var til stede.

CD4 + T- cellernes reaktionsevne og ILC2 til CCL17 og CCL22 i et ex vivo-transmigrerings apparat.

CD4 T-celler og ILC2 fra mænd og kvinder, æg-udfordrede mus blev isoleret fra lunger og deres derefter placeret i det øverste kammer af et transwell transmigrerings apparat (figur 3). Apparatets nederste kammer var fyldt med ubehandlede cellekultur medier, medier indeholdende CCL17 eller medier indeholdende CCL22. De repræsentative resultater viser, at mindre end 14% (13,37 + 6,5%) af de celler, der er migreret i mediekontrol forhold (figur 3A – D). Som svar på CCL22 reagerede begge celletyper, uanset om de var fra mænd eller kvindelige værter, på CCL22 (figur 3A – D), men resultaterne for CCL17 var mindre konsekvente. CCL17 kun induceret signifikant migration for de kvindelige CD4 T-celler og ILC2 i forhold til medierne alene (figur 3C, D). CCL17 behandling var ikke anderledes end medierne for mandlige CD4+ T- celler eller mandlige ILC2 (figur 3A, B), og CCL22 induceret større migration end CCL17 i mandlige ILC2 (figur 2b).

Suboptimale transmigrerings resultater for CD4+ T- celler med lav levedygtighed.

Der blev genereret suboptimale resultater for at give forskeren et eksempel på, hvad de kunne forvente, når transmigrerings eksperimentet ikke fungerer korrekt (figur 4). Vi isolerede mandlige CD4+ T- celler fra dyr i henhold til denne protokol og placerede dem i den øverste brønd af transmigrering system. Efter at CD4+ T- cellerne blev tilføjet, forblev pladen dog ved stuetemperatur i de første 24 timer, derefter blev pladen flyttet ind i inkubator for de resterende 24 timer i inkubeations perioden. Ikke overraskende, vi opdagede ingen migration mod CCL17 og CCL22 (figur 4a) og levedygtigheden af cellerne var især lav (< 15%) for cellerne i toppen (figur 4b). Disse fejlbehæftede resultater fremhæver vigtigheden af at anvende de korrekte temperaturer og betingelser, som er beskrevet i denne protokol, for at opnå optimale resultater.

Figure 1
Figur 1: CCR4 udtryk på CD4+ T- celler og ILC2. 7 til 9 uger gammel, mand og kvinde, BALB/c-mus blev injiceret én gang med 100 μl af æg-adsorbet til aluminiumhydroxid (500 μg/ml; ÆG og 20 mg/mL aluminiumhydroxid) 7 dage før den første af 5, gentagne, daglige luftvejs udfordringer med 1,5% OVA i saltvand. Allergen-udfordrede dyr blev humant euthanized, og lunge-og milt væv blev indsamlet til ILC2 og CD4+ T-celler isolation. En lille alikvot af celler blev derefter plettet og analyseret af flow flowcytometri at bestemme niveauet af CCR4 på hver celletype. (A) hyppigheden af CD4+ T-celler, der er CCR4+ fra OVA + mus, hvor fejl bjælkerne repræsenterer standardfejlen for middelværdien (+ SEM). (B) hyppigheden af ILC2, der var CCR4+ (+ SEM). (C, D) Gennemsnitlig fluorescens intensitet (+ SEM) af CCR4 på (C) CD4 + T-celler og (D) ILC2. I alt 13 mus blev brugt til at generere disse data, og flow eksperimentet blev gentaget to gange, med 3 replikater af hver behandling pr. eksperiment. Betydning blev bestemt af en-vejs ANOVA; n.d. indikerer, at der ikke var nogen forskelle mellem grupperne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: reaktionsevne af CD4+ T- celler til CCR4 ligander i øverste og nederste kamre i et transmigrerings system. Mandlige Balb/c mus sensibiliserede og udfordret med hønseæg ægalbumin (OVA) og CD4 + T celler blev isoleret fra deres og lunger (A, B). For dette transmigrerings eksperiment blev CD4+ T-celler suspenderet i serum frie medier ved 1 x 107 celler/ml. CCL17 og CCL22 blev føjet til serum frie medier i en koncentration på 50 ng/mL (25 ng/mL af hver chemokin for at opnå i alt 50 ng/mL). Chemokine-holdige medier blev tilføjet til det øverste kammer kun, til det nederste kammer kun, eller til både top og bund kamre. Et samlet volumen på 500 μL transmigrerings medie blev føjet til de nederste brønde, og 100 μL cellulær suspension (1 x 106 celler/brønd) blev tilføjet til den øverste brønd. Transmigration blev målt efter 48 h i kultur (C). Disse data blev genereret fra et enkelt eksperiment, 3 æg-behandlede, hanmus blev brugt til vævs opsamling, og 3 replikater blev foretaget pr. behandling. Statistisk signifikans blev bestemt af en-vejs ANOVA; *p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: respons på CD4 + T-celler og ILC2 til CCL17 og CCL22 i et ex vivo -transmigrerings apparat. Mus blev forberedt som i figur 1 for CD4+ T- celle og ILC2 isolation fra deres og lunger. CD4+ T-celler og ILC2 blev suspenderet i serum frie medier ved 1 x 107 celler/ml. CCL17 eller CCL22 blev føjet til serum frie medier i en koncentration på 50 ng/mL. 500 μL transmigrerings medier blev føjet til de nederste brønde, og 100 μL cellulær suspension (1 x 106 celler/brønd) blev tilføjet til den øverste brønd. Transmigration blev målt efter 48 h i kulturen. (A) CD4+ T- celler og (B) ILC2 fra mandlige værter blev behandlet med medier som kontrol, CCL17 eller CCL22. Tilsvarende, (C) kvindelige CD4+ T- celler og (D) kvindelige ILC2 blev behandlet med medier, CCL17 eller CCL22. I alt 14 mus blev brugt til at generere disse data. Det transmigrerings eksperiment blev gentaget 4 gange med 3 – 6 replikater af hver behandling pr. eksperiment. Betydning blev bestemt af en-vejs ANOVA; *p < 0,05, * * *p < 0,001, * * * *p < 0,0001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: suboptimale transmigrerings resultater for CD4 T-celler med lav levedygtighed. Naive mandlige BALB/c mus blev erhvervet for lunge- og milt vævs indsamling og CD4 + T celle isolation som i figur 1, figur 2, og figur 3. CD4 T-celler blev tilføjet til det øverste kammer af transmigrerings apparatet og serum frie medier indeholdende CCL17, CCL22 eller ingen chemokin (mediekontrol) blev tilføjet til bunden godt. I de første 24 timer af eksperimentet blev pladen efterladt ved stuetemperatur, derefter blev den flyttet til en 37 °C inkubator med 5% CO2 for yderligere 24 h. (a) procentdel af celler, der er tilbage i top-og bund boringen, når 24 timer.B) levedygtigheden af C D4 + T-celler i øverste og nederste kammer efter dårlige inkubations forhold. Disse data blev genereret fra et enkelt eksperiment, 3 naive mandlige mus blev brugt til vævs opsamling, og 3 replikater blev foretaget pr. behandling. Statistisk signifikans blev ikke fastlagt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri præsenterer vi en veletableret metode til vurdering af kemo-induceret migration af lymfocytter i et ex vivo transmigrerings system. Der er flere kritiske trin i protokollen, hvoraf den første er at kontrollere ekspression af den korrekte chemokine receptor på immuncellerne i forsøget. I vores hænder, valgte vi CCR4 på grund af litteraturen, der fremhæver vigtigheden af CCR4 på Th2 hjælper T celler i allergisk inflammation. Ovalbumin-induceret inflammation blev tidligere påvist at være begrænset af mindst to CCR4 antagonister24,25; Dette var dog forud for opdagelsen af gruppen 2 medfødte lymfoide celler (ILC2)26,27. Vi genererede nye data, der viser, at ILC2 celler udtrykker højere CCR4 end CD4+ T- celler og viste, at disse celler konsekvent var lydhør over for CCL22.

Et andet afgørende skridt at følge i protokollen er at sikre, at cellerne holdes i det optimale medium for kultur, før du begynder den transmigrering del af protokollen. I tilfælde af ILC2, vi var nødt til at kultur disse celler i ILC2 udvidelses medier, der indeholder både IL-2 og IL-33. Il-2 og IL-7 er begge rapporteret i litteraturen til at støtte ILC2 i kultur for op til 14 dage28,29. Hvis levedygtigheden bliver et problem for CD4+ T-celler og ILC2 i fremtidige eksperimenter, vil TILFØJELSEN af Il-2 eller Il-7 sandsynligvis forbedre overlevelsen af lymfocytter indtil endepunktet af forsøget. Hvert af de medier, der præsenteres heri, blev defineret i løbet af flere eksperimenter og blev optimeret til brug i denne protokol14,30,31. I figur 4præsenterede vi defekte resultater for at demonstrere vigtigheden af at bruge en inkubator med korrekt temperatur og 5% Co2. At holde transmigrerings pladerne i inkubatoren, hvor de ikke forstyrres, er endnu et afgørende skridt for protokollens succes.

Som tidligere nævnt er der fordele ved at bruge in vivo mikroskopi tilgængelig på de fleste institutioner, men in vivo billeddannelse kan være tidskrævende og dyrt. En alternativ eksperimentel procedure, der er mindre bekostelig, bruger mikrofluidics i kombination med chemokine gradienter til at forstå leukocyt ekstravasation og vævs vandring32,33,34. Disse systemer har videnskabelig værdi, fordi de vurderer kompleksiteten af celle kinetik, der involverer endotelceller, som kan dyrkes på kapillærer af mikrofluidisk systemer. Desuden vurderer disse mikrofluidisk-systemer betydningen af klæbe proteiner (f. eks. e-cadherin) på endotelcellerne og integriner på immuncellerne i processen med celle tilslutning under blodgennemstrømning. Ikke desto mindre kræver disse systemer specialiseret udstyr og kompleks beregningsmæssige programmering og statistik for at bestemme vigtigheden af de enkelte behandlingsbetingelser. Selv om begrænsningen af den transmigrerings metode, der præsenteres her, er af kunstig karakter, kan den derfor anvendes som et vigtigt screeningsværktøj til at begrænse spild af unødvendige reagenser i efterfølgende in vivo-metoder. Betydningen af metoden er, at da nye celler opdages, som det er tilfældet for ILC2, kan vi screene disse celler for deres reaktionsevne til kendte chemokiner. Dette er en af de fremtidige applikationer, der involverer ILC2 og potentielle terapier, som kan hæmme deres migrering til lungerne under astma forværring. Denne transmigrerings protokol vil blive brugt til at screene forskellige hæmmere, der kan anvendes til at begrænse CCR4 eller andre kemiske mediatorer involveret i rekruttering af ILC2. I alt vil denne ex vivo-transmigrerings protokol føre til generering af kritiske data, som kan verificeres med fremtidige in vivo-eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen finansielle oplysninger eller interessekonflikter til at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af American Lung Association (K.J.W.), mindesmærket Eugene Kenney fond tildelt T.A.W. og K.J.W., generøs start-up støtte fra University of Utah for K.J.W., og en afdeling af veteraner anliggender Award til T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. er modtager af en forskerkarriere videnskabsmand Award (IK6 BX003781) fra Department of Veterans Affairs. Forfatterne ønsker at anerkende redaktionel bistand fra MS. Lisa Chudomelka. Forfatterne takker unmc flow flowcytometri Core for deres støtte til at indsamle de flow cytometri-data, der genereres for dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich 15250061
1 mL syringe BD Bioscience 329424 U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-Glutamine Gibco 10378-016 Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101 polypropylene tubes
3 μm transwell inserts Genesee Scientific 25-288 24-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixative BD Pharmigen 338036 Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubes STEM Cell Technologies 38007
50 mL conical tubes Olympus Plastics 28-106 polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnet STEM Cell Technologies 18103
ACK Lysing Buffer Life Technologies Corporation A1049201
Advanced cell strainer, 40 μm Genesee Scientific 25-375 nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent Grade Sigma-Aldrich 239186-25G 20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugated Biolegend 131211 0.5 μg/test
anti-mouse CD11b BD Pharmigen 557396 0.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610 Thermo-Fischer Scientific 61-0114-82 0.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc block BD Pharmigen 553141 0.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugated Thermo-Fischer Scientific 47-0193-82 0.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugated BD Pharmigen 552774 0.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugated BD Pharmigen 56087 0.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278) BD Pharmigen 564070 0.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugated BD Pharmigen 553164 0.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugated Biolegend 145311 0.5 μg/test
Automated Cell Counter BIORAD 1450102
Automated Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich A2153-10G 0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter Clides BIORAD 1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade V Sigma-Aldrich A5503-10G 500 μg/mL
Collagenase, Type 1, Filtered Worthington Biochemical Corporation CLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216) 25 U/mL in RPMI
Compensation beads Affymetrix 01-1111-41 1 drop per contol tube
Dissociation Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-335
FACS Buffer BD Pharmigen 554657 1x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBS Genesee Scientific 25-525H 10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17 GenScript Z02954-20 50 ng/mL
Mouse CCL22 GenScript Z02856-20 50 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kit STEM Cell Technologies 19852
Mouse IL-2 GenScript Z02764-20 20 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kit STEM Cell Technologies 19842
Mouse recombinant IL-33 STEM Cell Technologies 78044 20 ng/mL
RPMI Life Technologies Corporation 22400071
Separation Buffer STEM Cell Technologies 20144 1x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamber Data Sciences International
Sterile saline Baxter 2F7124; NDC 0338-0048-04 0.9% Sodium Chloride

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548 (2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477 (2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508 (2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038 (2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684 (2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51 (2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Tags

Immunologi og infektion CCL17 (C-C Motif chemokine 17)/TARC (thymus og aktiverings relateret chemokin) CCL22 (C-C Motif chemokine 22)/MDC (Macrophage-afledt chemokine) CCR4 (CC chemokine receptor 4) CD4 T-celle (CD4 + T Helper Cell)/Th2 celle ILC2: (gruppe 2 medfødte lymfoide celler) æg (hønseæg ovalbumin)
Vurdering af lymfocyt migration i et ex vivo-Transmigrerings system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, K. J., Wyatt, T. A.… More

Warren, K. J., Wyatt, T. A. Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System. J. Vis. Exp. (151), e60060, doi:10.3791/60060 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter