Summary
Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.
Abstract
As células empregam vários métodos para reciclagem de proteínas indesejadas e outros materiais, incluindo vias lisossomais e não-lisossossômicas. A via lisossoma-dependente principal é chamada de autofagia, enquanto o método primário não-lisossomal para o catabolismo protéico é o sistema de oniquitina-proteasome. Estudos recentes em organismos modelo sugerem que a atividade da autofagia e do sistema de ubiquitina-proteasome não é constante ao longo do dia, mas em vez disso, varia de acordo com um ritmo diário (circadiano). A capacidade de medir ritmos biológicos no turnover da proteína é importante para compreender como o controle de qualidade celular é alcançado e para compreender a dinâmica de proteínas específicas de interesse. Aqui nós apresentamos um protocolo estandardizado para quantificar in vivo o fluxo autofágico e degradação que captura o componente circadiano do retorno da proteína. Nosso protocolo inclui detalhes para manipulação do mouse, processamento de tecidos, fraccionamento e quantificação de fluxo autofágico usando o fígado do mouse como o material de partida.
Introduction
Os ritmos circadianos referem-se a variações diárias e previsíveis na função biológica que são aparentes em toda a natureza. Existem em cada escala biológica, a partir de comportamentos macroscópicos como ciclos de vigília-sono, a fenômenos moleculares como a abundância rítmica de biomoléculas. Nos últimos anos, a pesquisa sobre ritmos circadianos tem sido transformada pela descoberta de "genes do relógio" que são críticos para a geração do ritmo circadiano. Os estudos em camundongos knockout do gene do pulso de disparo revelaram um papel central para ritmos circadiano em organizar temporally processos celulares do núcleo tais como o metabolismo1. Entre as maneiras ritmos circadianos fazer isso acontecer é por transmitir uma estrutura temporal para o catabolismo de proteínas.
Vários grupos, incluindo o nosso, mostraram que as duas principais avenidas para o catabolismo de proteínas celulares, a autofagia e o sistema ubiquitina-proteasome, estão sujeitas a ritmos diurnos2,3,4,5. Autophagy representa o braço lysosome-dependente do catabolismo da proteína em que as proteínas do interesse são entregadas a este organela degradative através da construção de um vesícula novo (macroautophagy) ou através do translocação direto embora um canal (Autophagy negociado Chaperone)6. O sistema de ubiquitina-proteasome é a principal via não-lisossomal, onde as proteínas são poli-ubiquitadas e, em seguida, alimentadas no proteasome, uma máquina degradativa macromolecular encontrada em todo o citoplasma e núcleo7,8. Os ritmos na atividade do autofágico e do degradação são importantes porque jogam provavelmente um papel no Housekeeping celular. Em conseqüência, é valioso ter um procedimento padronizado que possa detectar oscilações diárias no catabolismo da proteína que é compatível com modelos pré-clínicos da doença.
Aqui, nós fornecemos nosso protocolo para quantificar variações diurnas no fluxo autofágico no fígado do rato, que serviu como a base para o trabalho em nosso laboratório3,9. Nosso método é classificado como um "ensaio de turnover"10, uma abordagem utilizada por inúmeros grupos para medir a atividade proteolítica (ou fluxo). Nesta abordagem, os inibidores de protease específicos para lisossomos ou proteasomas são administrados em camundongos e, em seguida, amostras de tecido são obtidas após um intervalo de tempo fixo. Em paralelo, amostras de tecido são obtidas de camundongos submetidos a injeções simuladas. As amostras de tecido são homogeneizadas e, em seguida, separadas bioquimicamente para obter as frações lisossome-enriquecidas e citoplasmáticas. Essas frações são então analisadas em paralelo via Western blotting usando anticorpos específicos para marcadores de macroautofagia (LC3b e p62) ou substratos degradação (proteína poli-ubiquitinada). Ao longo do tempo, os animais injetados com inibidores da protease acumulam proteínas que normalmente teriam sido recicladas. Como resultado, a taxa de rotatividade é inferida comparando-se a abundância de proteínas de marcador nas amostras tratadas com inibidor de protease às amostras tratadas com Sham. Ao repetir este método em intervalos de tempo fixos ao longo do dia é possível reconstruir as variações circadianas na proteólise (Figura 1a).
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Protocol
O protocolo aqui descrito foi aprovado pela Universidade de Washington em St. Louis animal Care e use Committee (IACUC).
1. mouse habitação e design experimental
- Para detectar ritmos diários no retorno da proteína, os ratos da casa (macho ou fêmea C57BL/6J, 4 − 8 semanas velho, 20 − 25 g) a luz padrão de 12 h/ciclos escuros com alimento forneceram ad libitum. Para evitar enfatizar os animais, aclimatar camundongos por pelo menos uma semana na instalação antes de usar e evitar habitação única. Para provar que os ritmos no catabolismo da proteína são verdadeiramente circadiano (isto é, conduzido pelo pulso de disparo biológico interno do animal), ratos da casa circunstâncias escuras constantes, tomando o cuidado para evitar expor os ratos à luz exógena.
Nota: Para detalhes sobre a carcaça do rato para experiências circadiano do ritmo Veja a seguinte referência11. - Para cada ponto de tempo, alocar três camundongos como controles Sham e pelo menos três camundongos para cada tipo de inibidor de protease usado (leupeptina para fluxo autofágico e bortezomib para medições de fluxo degradação). Planeje seis pontos de tempo uniformemente espaçados em intervalos de 4 h ao longo do ciclo diurno/noturno para obter amostras de tecido.
Nota: Um experimento de ponto de tempo de 24 h, 6 com solução salina tamponada por fosfato (PBS), leupeptina e bortezomib exigirá um total de 54 camundongos (3 por tratamento x 3 tratamentos x 6 pontos de tempo).
2. preparação de solução de homogeneização, soluções de estoque de inibidor e frascos para coleta de fígado de rato
- Prepare o tampão fresco da homogeneização (HB) e mantenha no gelo: 10 milímetros de pH Tris-HCl 7,5, 250 de sacarose do milímetro, pH 8,0 do EDTA de 5 milímetros, e 1 comprimido do inibidor de protease por 100 mL.
Nota: Aproximadamente 10 mL de HB são necessários por mouse. - Para o processamento a jusante de amostras biológicas, cada amostra requer um tubo cônico de 15 ml para segurar o homogeneizado bruto, um tubo de 15 ml para segurar o sobrenadante pós-nuclear, dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para segurar o 3.000 x g e 20.000 x g peletizada material, respectivamente, e um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para segurar a fração citoplasmática. Adicione 7 mL de HB fria a cada tubo pretendido para o homogeneate cru e mantenha no gelo.
- Prepare uma solução de 2 mg/mL de Hemi-sulfato de leupeptina em PBS estéril. Prepare também uma solução de 50 mg/mL de bortezomib em dimetil sulfóxido (DMSO). Aliquot e armazene as soluções em-80 ° c.
3. administração do inibidor da protease
- Descongelar leupeptina (2 mg/mL) e bortezomib (50 mg/mL) soluções de stock para a temperatura ambiente 15 min antes de cada ponto de tempo. O estoque de leupeptina está pronto para injeção. Diluir o bortezomib em PBS estéril para produzir uma solução de trabalho de 50 μg/mL.
Nota: Bortezomib é sensível à luz, então proteja o estoque de trabalho da luz até o uso. - Pesar camundongos e realizar injeções intraperitoneal de "Sham" PBS (0,5 mL), leupeptina (40 mg/kg), ou bortezomib (1,6 μg/kg). Retorne os ratos para gaiolas apropriadamente marcadas agrupadas pelo tipo de injeção que receberam. Registre a hora em que os camundongos são tratados ou manipulados em uma tabela padronizada (consulte arquivo suplementar "dados de exemplo").
Nota: Uma calculadora de dose é incluída como um auxílio no arquivo suplementar "dados de amostra". É importante realizar injeções expeditamente e na mesma ordem do temporal ao temporal para minimizar a variabilidade.
4. aquisição e armazenamento de tecidos
- Duas horas após a injeção, eutanize ratos um de cada vez de acordo com o protocolo institucionalmente aprovado de IACUC. Por exemplo, anestesiar camundongos, em seguida, eutanizar por luxação cervical. Prossiga para a etapa de dissecção imediatamente após a eutanásia.
Nota: Assegure a anestesia completa antes da deslocação cervical comprime patas dianteiras sem um reflexo observável. - Retire o lobo esquerdo do fígado fazendo uma incisão de 1,5 a 2,0 cm com tesouras de Metzenbaum no abdômen ventral do rato. Externalize o lóbulo esquerdo do fígado e extirpar-o com tesouras cirúrgicas. Submergir a amostra de fígado em 7 mL de HB gelada em um tubo cônico de 15 mL apropriadamente rotulado. Mantenha a amostra no gelo durante todo o processamento.
Nota: As amostras podem ser mantidas no gelo ou a 4 ° c durante a noite antes de prosseguir. Se os marcadores padrão da macroautofagia e da atividade degradação forem os únicos readouts pretendidos, as amostras do fígado podem ser flash congeladas no nitrogênio líquido e armazenadas em-80 ° c para um processamento mais atrasado. Para examinar outros alvos de degradação (por exemplo, via proteômica), processe as amostras sem congelamento. - Prossiga para eutanizar e dissecar o próximo mouse até que todas as amostras sejam adquiridas. Processe os mouses na mesma ordem de grupo que foram injetados e registre a duração desta etapa (consulte arquivo suplementar "dados de exemplo"). Cada rato deve ser processado em menos de 5 min para limitar a diferença nos tempos de exposição para os inibidores injetados.
5. fraccionamento bioquímico de amostras de fígado
Nota: A Figura 1b mostra o esquema de fraccionamento.
- Transfira cada amostra de fígado e 7 mL de HB para um homogeneizador de dounce de 15 mL de capacidade. Homogeneize a amostra com 10 traços do pistão frouxo e 15 cursos do pistão apertado. Retorne o homogeneizado cru resultante ao tubo cónico de 15 ml que originou de. Repita até que todas as amostras de fígado tenham sido homogeneizadas.
- Gire amostras de homogeneatos brutos em 700 x g por 10 min a 4 ° c para núcleos e detritos da pelota. Transfira os 4 mL superiores do sobrenadante pós-nuclear (S1) para um tubo cônico de 15 ml fresco.
- Determine a concentração proteica da fração S1 usando ensaios de ácido de Bradford ou ácido (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, equalizar as concentrações de todas as amostras para 2,1 mg/ml ou para a concentração desejada, adicionando HB fresco para S1 onde necessário. As amostras normalizadas são a fração "proteína total" (tot). Para fins analíticos a jusante e melhoria da qualidade, alíquota 500 μL da fração tot e armazenar a-80 ° c.
- Transfira 1,5 mL da fração tot remanescente para um tubo de microcentrífuga e gire a 3.000 x g durante 15 min a 4 ° c. Transfira 1 mL do sobrenadante resultante (S2) para um tubo de microcentrífuga fresco e ajuste no gelo.
- Aspirar o sobrenadante remanescente e lavar o 3.000 x g pellet (3kp) duas vezes com 1,5 ml de HB fria. A pelota 3Kp pode ser armazenada seca em-80 ° c se os proteônicos downstream são esperados. Se apenas western blotting é antecipado, ressuscitar o 3kp pellet em 200 μL de sódio Dodecil sulfato de poliacrilamida gel electroforese (SDS-PAGE) amostra tampão (tabela de materiais) e ferver a 95 ° c por 5 min.
- Gire a fração S2 em 20.000 x g por 20 min a 4 ° c. Transfira o sobrenadante resultante (S3) para um tubo de microcentrífuga fresco. S3 é a fração citoplasmática (cyto). Para SDS-PAGE, combine 150 μL da fração de cyto com 50 μl do amortecedor da amostra de 4x SDS-PAGE e ferva em 95 ° c por 5 minutos.
- Aspirar o sobrenadante remanescente do 20.000 x g pellet (20kp) e lave duas vezes com 1,5 ml de HB fria. A pelota 20Kp pode ser armazenada seca em-80 ° c se os proteônicos a jusante são antecipados. Se apenas a mancha ocidental for antecipada, ressuscitar o pellet 20Kp em 100 μl de tampão de amostra SDS-PAGE e ferver a 95 ° c por 5 min.
6. western blotting readout
- A fim quantificar o fluxo macroautophagic e degradação através da mancha ocidental, compor uma solução do estoque de GST-LC3b purified (2 μg/ml), de p62-his6 (2 μg/ml), e de Lys48 poliubiquitina lig (K48-UB, 50 μg/ml) no amortecedor da amostra do SDS-PAGE 1x. Depois de ferver a 95 ° c por 5 min, alíquota e armazenar a-80 ° c para uso futuro.
- Na altura de SDS-PAGE, gere uma curva padrão de 6 pontos da mistura padrão da proteína por serialmente diluindo 1:3 no amortecedor da amostra do SDS-PAGE 1x. Carregar 10 μL de cada amostra de curva padrão em um 26 bem 4 − 12% SDS-PAGE MIDI-gel, seguido por padrões proteicos pré-preparados (tabela de materiais), um padrão de peso molecular comercial.
- Para medir o fluxo autofágico, carregue 12 μl da amostra 3kp em cada poço.
Nota: Supondo-se que os tratamentos Sham, bortezomib e leupeptina foram feitos e assumindo 3 camundongos por tratamento, cada momento deve consistir em 9 amostras. Portanto, cada MIDI-gel pode acomodar 2 pontos de tempo mais a curva padrão e um experimento típico da série temporal exigirá 3 MIDI-gels para leitura. - Para medir o fluxo degradação, carregue 12 μL de fração de cyto em cada poço.
- Amostras de proteínas separadas por SDS-PAGE e transferência para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando protocolos padrão. Se o western blotting para LC3b for antecipado, transfira géis usando 20% de tampão de transferência contendo metanol. Caso contrário, use 10% de tampão de transferência contendo metanol, pois isso permitirá a transferência mais eficiente de espécies de proteínas de alto peso molecular.
- Execute western blotting usando protocolos padrão. Para analisar o fluxo macroautophagic, as membranas do borrão que contêm 3Kp amostras com anticorpos p62 ou anti-LC3b (1:1000) durante a noite em 4 ° c. Para analisar o fluxo degradação, as membranas do borrão que contêm amostras de cyto com anti-Lys48 poliubiquitina específico (1:1000) durante a noite em 4 ° c.
- Imagem Western borrões usando anticorpos secundários padrão e dispositivos de imagem. Imagem todas as membranas que constituem uma determinada série temporal experimento juntos.
7. análise de dados
Nota: Consulte arquivo suplementar "dados de exemplo".
- Para executar a densitometria em amostras ocidentais do borrão, use o software padrão dos gráficos, o estúdio da imagem, ou alternativamente ImageJ.
- Realize medições densitométricas em bandas de interesse tanto para a curva padrão quanto para as amostras experimentais. No Image Studio, usando p62 como exemplo, desenhe um retângulo longo que abrange o monómero de proteínas na parte inferior e estendendo-se até o topo da membrana. Copie, Cole e mova o retângulo para as amostras restantes. É importante manter o retângulo usado para a quantificação consistente entre as amostras.
- Guarde a quantificação numa folha de cálculo premindo Report e inicie a folha de cálculo no canto inferior direito da janela de análise.
- Gere uma curva padrão densitométrica com planilha usando a amostra padrão serialmente diluída e use regressão linear ou polinomial para obter uma equação de curva padrão de melhor ajuste. Usando esta equação, extrapolar a quantidade de p62, LC3b-II ou Lys48-Poly UB nas amostras experimentais.
- Para obter medições de fluxo, subtrair a quantidade de proteína extrapolada de cada amostra tratada pelo inibidor do valor médio das amostras de PBS do mesmo ponto de tempo (ver arquivo suplementar "dados de amostra").
- Avalie a significância estatística da Variação temporal no turnover de proteínas usando ANOVA de 1 via. Isso pode ser feito usando o software de planilha padrão.
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Representative Results
Os dados representativos são apresentados na Figura 2a, B, e a quantificação desses dados é fornecida na Figura 2C, D (vide também arquivo suplementar "dados de amostra"). Para simplificar, não representamos controles de carregamento na Figura 2 , mas estes devem ser obtidos em paralelo. Tipicamente, os borrões ocidentais de encontro ao β-Actin são usados para esta finalidade, mas uma mancha total da proteína (tal como PONCEAU S) será suficiente. O leitura preliminar para o fluxo autofágico em algum ponto de tempo dado é a diferença na quantidade de marcadores específicos do macroautofagia (p62 ou LC3b-II) entre as amostras de leupeptina-tratadas versus Sham na fração enriquecida lisossomo de 3kp dividida por 2 (o número de horas entre a injeção do inibidor da protease e a colheita do tecido). Dados semelhantes podem ser obtidos a partir de amostras 20KP, que também são lisossome enriquecido, mas a nossa experiência no fígado do rato é que a maioria do sinal segreda na fração 3KP. Normalmente, os resultados são normalizados para a média que simplifica a comparação entre experimentos independentes (Figura 2C, D). O leitura preliminar para o retorno degradação é a diferença na quantidade de Lys48-proteína polyubiquitinated entre as amostras bortezomib-tratadas versus Sham na fração citosólico ("cyto") dividida por 2. Porque p62 pode ser um alvo de ambos macroautofagia e o Proteassoma3, um marcador alternativo para o fluxo degradação é a mudança no índice de p62 +/-bortezomib na fração 3kp (veja dados da amostra). Entretanto, nós encontramos que este marcador é menos robusto comparado a Lys48-proteína polyubiquitinated e é usado melhor como dados de suporte.
Figura 1: etapas de experimento e processamento de amostra. (A) esquema de uma experiência típica da série temporal para medir os ritmos diários na atividade autofágico e degradação (fluxo) no fígado do rato. (B) esquema de fraccionamento para a obtenção de frações protéicas de fígado enriquecidos com lisosome e citosólica para análise de Western Blot. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados experimentais da amostra do fluxo. Manchas ocidentais de uma experiência representativa da série de tempo para medir ritmos diários no fluxo autofágico (a), e no fluxo degradação (B) no fígado do rato. Observe que, condições tratadas com leupeptina, o p62 é executado como uma escada que varia da forma monomérica em cerca de 50 kDa a complexos SDS-stable em cerca de 250 kDa. As épocas do dia são representadas nas unidades do tempo do zeitgeber (ZT), onde ZT0 representa luzes sobre e ZT12 representa luzes fora. Os tempos de observação que caem durante as luzes são pretos sombreados. (C,D) Quantificação desses dados. Cada ponto de dados representa a média ± SE (n = 3). A significância estatística por meio de ANOVA de um fator é descrita. Consulte o arquivo suplementar "dados de exemplo" para uma representação tabular desses dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar: dados de exemplo. Análise laboratorial de dados densitométricos e posterior análise estatística. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Nosso protocolo descreve um meio tecnicamente direto de medir ritmos biológicos na rotatividade de proteínas em camundongos usando equipamentos de biologia molecular comumente disponíveis. Por causa da duração dos experimentos em séries temporais e do número de amostras biológicas envolvidas, é importante ser consistente em todo o experimento sobre como os camundongos são injetados, o tempo de aquisição de tecidos e o processamento bioquímico de Amostras. As etapas de injeção, eutanásia e luxação cervical podem requerer a prática do operador antes de iniciar um experimento em larga escala. É melhor para um único operador executar todas as dissecções do tecido desde que os indivíduos diferentes dissecam em velocidades diferentes, mas se este é inviável pode valer a pena aumentar o tempo entre a injeção do inibidor de protease e a colheita do tecido de 2 h a 3 ou 4 h ( desde que isso seja feito consistentemente nos pontos temporais).
As razões comuns para o Troubleshooting incluem a variabilidade no fluxo entre amostras biológicas da repetição, e a qualidade ocidental pobre do borrão. Em relação à variabilidade amostral, isso pode ser devido ao uso de múltiplos operadores com diferentes velocidades de dissecação ou níveis de experiência. Isso pode ser atenuado pela execução de experimentos de prática até que os tempos médios de dissecação sejam inferiores a 5 min por mouse. Alternativamente, um único operador pode ser usado para realizar dissecções. O fundo elevado em borrões ocidentais pode levantar-se da transferência desigual, do bloqueio inadequado, do anticorpo preliminar da baixa qualidade, ou das etapas de lavagem inadequadas. Os melhores resultados são conseguidos pela transferência molhada overnight de amostras separadas da proteína de SDS-PAGE a PVDF no metanol de 10 − 20% que contem o amortecedor de transferência, usando o leite seco non-FAT de 10% para obstruir, e a lavagem extensiva entre etapas (3x 10 mínimos mínimo em um balancim mecânico).
Esta técnica tem várias limitações. Em primeiro lugar, o protocolo descrito requer um número significativo de animais e é, portanto, intensivo de recursos. Enquanto uma experiência de série temporal mínima abrange 24 h, experimentos de pelo menos 2 ciclos são ideais para confirmar que as variações diárias observadas no turnover de proteínas são reprodutíveis, e para estimar características de ritmo como periodicidade e fase12 . Porque o tempo deve decorrer entre quando os inibidores de protease são administrados aos ratos e as amostras do tempo são colhidas (para permitir que os alvos da proteólise acumulem), as medidas do volume de negócios obtidas representam uma atividade média sobre um intervalo de 2 h em vez de uma estimativa de ponto. Em conseqüência, há um limite à definição que este ensaio pode prever para detectar mudanças dinâmicas no catabolism da proteína. Finalmente, este protocolo é otimizado para o fígado do rato e o procedimento de fraccionamento bioquímico apresentado aqui provavelmente precisaria ser modificado para obter eficientemente lisossomas de outros tipos de tecido.
Este é o primeiro método para medir diretamente os ritmos diários no fluxo autofágico que igualmente permite observações Proteome-largas deste fenômeno. As aplicações futuras desta técnica incluem a análise de ritmos proteolíticas em vários modelos da doença, incluindo a doença auto-imune, o cancro, e a infecção aguda. No principal este método pode ser adaptado a outros órgãos do rato e às amostras humanas explantados, que representa uma aplicação futura emocionante com potencial translacional elevado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por RO1HL135846 e um Instituto de desenvolvimento infantil Grant (PD-II-2016-529).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4x SDS PAGE Sample Buffer | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b antibody | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| LC3b antibody | Cell Signaling Technology | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Leupeptin | Sigma | Cat# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Rabbit Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
References
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