Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

Published: August 6, 2019 doi: 10.3791/60145
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

Summary

Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.

Abstract

В процессе старения многие клетки накапливают высокий уровень повреждений, приводящих к клеточной дисфункции, которая лежит в основе многих гериатрических и патологических состояний. Постмиотические нейроны представляют собой основной тип клеток, пострадавших от старения. Хотя существует несколько моделей старения нейронов млекопитающих, их установить сложно и дорого. Круглый червь Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения старения нейронов, так как эти животные имеют короткую продолжительность жизни, доступнынадежный генетический инструментарий, и хорошо каталогизированной нервной системы. Представленный в данном случае метод позволяет беспрепятственно осваить конкретные клетки на основе экспрессии трансгенного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Трансгенные линии животных, выражающие GFP под различными, клеточными типами,специфическими промоутерами, усваиваются для удаления внешней кутикулы и мягко нарушаются для производства шлама, содержащего различные типы клеток. Клетки интереса после этого отделены от non-target клеток через флуоресцентно-активированную сортировку клетки, или anti-GFP-соединенными магнитными шариками. Изолированные клетки могут быть культивированы в течение ограниченного времени или немедленно использованы для клеточного анализа ex vivo, таких как транскрипционный анализ количественного ПЦР в реальном времени. Таким образом, этот протокол позволяет быстро и надежный анализ клеточных реакций в различных нейронных популяций в C. elegans.

Introduction

За последние несколько десятилетий, метазоановый модель организма Caenorhabditis elegans был огромный актив в изучении нейронов, нейронных схем и его роль в физиологических и поведенческих реакций, и старение связанных нейродегенеративных Заболеваний. Уникальной особенностью C. elegans является то, что животные прозрачны, что позволяет для линии всех взрослых соматических клеток, которые будут отображены1. C. elegans также гавани управляемое количество нейронов, что приводит к морфологии и подключения нервной системы хорошо понимается2. Инвариантная клеточная линия, короткая продолжительность жизни и обилие высокопроизводительных генетических инструментов, доступных для C. elegans, делают его идеальным модельным организмом для изучения старения в различных нейронных популяциях.

Старение нейронов и нейродегенеративных расстройств являются сложными, и каждое расстройство имеет уникальные патологические подписи, связанные с ним. Однако, для многих из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезни Альцгеймера, общей чертой является прогрессирующая нагрузка неправильно сложенных белков3,4,5. В обоих этих заболеваний, белки неправильно и совокупности в клетке, чтобы вызвать токсичность, в конечном счете, приводит к гибели клеток4,5. Для правильного старения нейронов важен гомеостаз митохондрий, в частности белковый гомеостаз, так каквозмущения и дисхомеостаз могут привести к нейродегенерации 6,7,8. Клетки оснащены различными механизмами для поддержания белка гомеостаза, один из которых разворачивается ответ белка (UPR) - классический путь, где сигналы от эндоплазмического ретикулума (ER) активировать внутриклеточного сигнала каскадов, что приводит к транскрипции ответ9. Сродни этому UPRER, метазоаны отображают аналогичный ответ на потерю митохондриального белка гомеостаза, так называемого митохондриального УПО (UPRmt)7,8. C. elegans, как представляется, наиболее базальный организм, чтобы иметь подтвержденный и четко определенный путь UPRMT 7.

Функция /дисфункция конкретных нейронных популяций в рамках более широкой сети может быть трудно оценить из-за их внутренней связи и сложности3. Тем не менее, часто необходимо изучить различные нейронные популяции из-за клеточных типконкретных заболеваний со сложными патологиями, таких как те, которые связаны с нарушениями клеточного белка гомеостаза. В C. elegans, конкретные нейронные популяции могут быть генетически манипулировать позволяет легкого наблюдения in vivo. Нервная система C. elegans в основном состоит из нейронов, с небольшим процентом глиальных клеток. У взрослых червей гермафродита, Есть около 302 нейронов, подразделяются на более чем 100 различных классов2,10. Нейроны, такие как холинергические нейроны преобладают в нервно-мышечных узлов, в то время как дофаминергические нейроны в первую очередь участвуют в сенсации10,11. Как двигательная активность и сенсорные способности снижаются с возрастом, важно подробно механистические идеи о дефектах в этих отдельных нейронов11,12. Таким образом, существует необходимость в простой и надежный метод для изоляции нетронутых клеток, представляющих интерес для последующих исследований ex vivo.

Здесь мы описываем оптимизированный эффективный метод быстрой изоляции специфических нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок (ГФП) от C. elegans. Этот метод изоляции может быть выполнен на личинки, несовершеннолетних или взрослых червей. Изоляция клеток от личинок червей была ранее опубликована Чжан и др.13 и не будет обсуждаться здесь. Важно отметить, что все черви должны быть на одной стадии жизни, чтобы предотвратить переваривание животных или загрязнения от животных в различных стадиях жизни. Через ферментативные и механические нарушения кутикулы нематод, экзоскелет с высоким содержанием коллагена и других структурных белков, широкий спектр клеток могут быть изолированы13,14. Клетки могут быть изолированы через цитометрию потока или антитела помечены магнитные бусы. Как правило, РНК изолирована с помощью фенола и гуанидина изотиоцианата метод для обеспечения обогащения желаемой популяции клеток15. С большой осторожностью эти изолированные клетки могут быть сохранены в культуре колбу или несколько хорошо блюдо. Этот метод представляет собой уникальный и мощный инструмент в изучении конкретных нейронов и имеет возможность изолировать живые и функциональные клетки для дальнейшего культивирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка и сбор выдержанного червей для клеточной изоляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Объясняется ниже изоляция холинергических нейронов от трансгенных unc-17::GFP штамм (OH13083) полученные из Caenorhabditis Genetics Center (CGC) деформации репозиторий в Университете Миннесоты. Крайне важно поддерживать стерильные условия для предотвращения загрязнения от грибков или бактерий.

  1. Подготовка и синхронизация червей с помощью метода отбеливания, как описано Т. Stiernagle16. Для экспериментов по старению, пластины червей на нематод среднего роста (NGM) пластины, содержащие 25 мкм водного раствора фтородеоксюридин (FuDR), чтобы уменьшить производство яиц и остановить яйцеклетки штриховки. Регулярно проверяйте агарные пластины, чтобы предотвратить загрязнение или вылупление яиц, так как это приведет к ненадежным результатам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для unc-17::GFP клетки, как правило, три 100 мм х 15 мм NGM пластины используются для изоляции достаточное количество клеток интерес16.
  2. Собирайте червей и подготовьте буферы для изоляции клеток.
    1. Соберите червей в конической трубке 15 мл. Вымойте червей из тарелки с 1,5 мл буфера M9 (1 мМ MgSO4, 85 мМ NaCl, 42 mM Na2HPO47H2O, 22 мМ KH2PO, pH 7.0) и центрифуга для 5 мин на 1600 х г. Откажитесь от супернатанта и вымойте червей с 1 мл буфера M9. Повторите центрифугацию и мыть в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше e. coli загрязнения, как это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение.
    2. Для двух образцов, подготовить 2 мл натрия dodecyl сульфат-дитиотрейтол (SDS-DTT) лиза буфера: 200 мм DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 мМ HEPES (pH 8.0), и 3% (w/v) сахарозы.
    3. Приготовьте 15 мл изоляционного буфера (118 мМ NaCl, 48 мм KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 25 мМ HEPES (pH 7.3) и храните его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как sDS-DTT lysis буфер и изоляция буфер должен быть свежим перед каждым экспериментом.
  3. Нарушение кутикулы и одноклеточная изоляция
    1. Центрифуга животных, собранных в шаге 1.2.1 за 5 мин при 1600 х г. Удалите все супернатанты и приостановить червей в 1 мл M9 средств массовой информации и передачи на 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
    2. Гралет черви с центрифугированием на 1600 х г в течение 5 мин.
    3. Добавьте 200 зЛ буфера лисиса SDS-DTT к червям и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться "подмигнул" вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие буфера лиза SDS-DTT может привести к гибели червей, которые могут контролироваться путем наблюдения за червями. Черви, которые мертвы удлинит и не будет скручиваться.
    4. Добавьте 800 л ледяного изоляционного буфера и смешайте, аккуратно щелкнув трубкой.
    5. Гранулы черви в течение 1 мин при 13000 х г при 4 градусах Цельсия, удалить супернатант и промыть 1 мл изоляционного буфера.
    6. Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, тщательно удаляя буфер изоляции каждый раз.
    7. Добавьте 100 л смеси протеазы из Streptomyces griseus (15 мг/мл)(Таблицаматериалов), растворенного в изоляционном буфере, в пеллету и инкубировать в течение 10-15 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с буфером лизиса SDS-DTT, расширенное пищеварение протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазменной мембраны, предотвращая изоляцию поверхностного воздействия GFP с помощью магнитных бусинок.
    8. Во время инкубации с помощью смеси протеазы нанесите механические нарушения, прокладав образцы вверх и вниз по дну микроцентрифуговой трубки 1,5 мл с наконечником микропипетка 200 мл в течение 60-70 раз. Держите кончик пипетки против стенки микроцентрифуги трубки с постоянным давлением, чтобы правильно отмежеваться клетки.
    9. Чтобы определить стадию пищеварения, удалите небольшой объем (1-5 л) смеси пищеварения, опустите ее на стеклянную горку и осмотрите его с помощью микроскопа культуры тканей. После инкубации от 5–7 минут фрагменты червя должны иметь заметно ежемое кутикулу, и суспензия клеток будет легко видна.
    10. Остановить реакцию с 900 зл и с помощью доступных холодных Лейбовиц L-15 среды дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и пенициллина-стрептомицина (окончательная концентрация на 50 U/mL пенициллин и 50 мкг/мл streptomycin).
    11. Пеллеты изолировали фрагменты и клетки центрифугированием в течение 5 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия. Вымойте гранулированные клетки с 1 мл холодных L-15-дополненных носителей в два раза больше, чтобы обеспечить избыток мусора и кутикулы удаляется.
    12. Отдохните пеллетные клетки в 1 мл L-15-дополненных носителей и оставить на льду в течение 30 минут. Возьмите верхний слой, примерно 700-800 л, в трубку микроцентрифуга. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться в последующей изоляции клеток, представляющих интерес.
    13. Следуя инструкциям производителя, используйте автоматический счетчик клеток или гемоситометр для измерения плотности клеток в 10–25 л изолированных клеток.

2. Изоляция GFP-положительных клеток через цитометрию потока или анти-GFP магнитные бусы

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два метода, которые могут быть развернуты для изоляции определенных типов клеток. Первый метод заключается в использовании флуоресценции активированных клеток сортировки (FACS), в то время как второй метод использует антитела конъюгированные магнитные бусы для пула клеток, выражающих различные плазменные мембраны локализованных белков. Последний метод требует локализации GFP в плазменной мембране, таким образом, доступны для взаимодействия с антителами связанных магнитного биса.

  1. Изоляция GFP-положительных клеток цитометрией потока
    1. Из изолированной суспензии клеток, собранной в шаге 1.3.12, центрифуги клетки в течение 5 минут при 10000 х г при 4 c. Откажитесь от супернатанта и приостановить гранулированных клеток в L-15-дополненной среде к плотности клеток не более 6 х 106 клеток / мл, чтобы избежать перегрузки цитометра потока.
    2. Сортировать клетки по GFP-положительному выражению с помощью цитометра потока, способного сортировать образцы. GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве контроля для неклеточного типа конкретного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, альтернативный подход к изоляции GFP-положительных клеток может быть использован, если GFP-тегами белка интерес локализована в плазменной мембране клеток. В этом случае протокол, описанный в разделе 2.2, может быть использован.
  2. Изоляция GFP-положительных клеток с помощью анти-GFP магнитных бусин
    1. Из изолированной суспензии клеток, собранной в шаге 1.3.12, центрифуги клетки в течение 5 минут при 10000 х г при 4 c. Откажитесь от супернатанта и приостанавливают клетки в 485 Л L L-дополненной среды L-15. Добавьте к раствору 15 qL ddH2O предварительно промытых в растворе антитела, связанные с антителами.
    2. Инкубировать клетки с магнитной суспензией на 4 кв. м на 1 ч с очень нежным поворотом. Чрезмерное поворотное повреждение клеток.
    3. После инкубации, центрифуга образца в течение 5 мин при 10000 х г при 4 кв С, затем мыть гранулы 2x с 1 мл L-15-дополненный среды для удаления GFP-отрицательных клеток.
  3. Культирование изолированных клеток
    1. Плита изолированных клеток в стерильной 6-хорошо многоколодцной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластины могут быть покрыты арахисовым лектином для увеличения вложения клеток; однако, если клетки должны быть использованы немедленно, этот шаг может быть проигнорирован.
    2. Поместите пластину в пластиковый контейнер и инкубировать клетки при 20 градусах Цельсия с влажной салфеткой или мягкой бумагой (добавить 50 мкг/мл ампициллин ddH2O, чтобы обеспечить отсутствие роста бактерий на салфетке), чтобы добавить влаги в клетки. Не инкубировать в инкубаторcoCO 2, так как повышенные уровни CO2 могут повредить клетки.

3. Флуоресцентная визуализация изолированных GFP-положительных клеток

  1. Включите флуоресцентную лампу перевернутого микроскопа с флуоресценцией и дайте ему прогреться около 10 мин.
  2. Удалить клеточную культуру из инкубатора и установить на стадии перевернутый микроскоп с флоресценции вложения. Сдвиньте фильтр GFP в канавки под стадией микроскопа.
  3. Просмотр ячеек с увеличением 50x. Успешно изолированные GFP-положительные ячейки будут легко видны. Сфотографируйте с помощью вложения камеры на микроскопе.

4. Извлечение РНК из изолированных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение РНК должно быть выполнено сразу же после клеточной изоляции для обеспечения высокого качества материала. Изолированная РНК может быть использована для производства кДНК и последующего измерения уровней транскрипта количественными ПЦР (qPCR). Все трубки, наконечники и реагенты должны быть без РНЗа, а рабочее пространство должно быть вымыто этанолом до извлечения РНК.

  1. Из изолированных клеток, собранных на шаг 2.1.2, центрифуги клеток в 1,5 мл стерильных, RNase свободной микроцентрифуги трубки5 мин при 10000 х г при 4 кс. Если клетки изолированы через магнитные бусины, следуйте сбору клеток, как указано выше.
  2. Используя микропипетт, удалите супернатант из центрифугированной микроцентрифуговой трубки и добавьте 100 Зл Л средней M9, чтобы смыть L-15-дополненную среду. Клетки центрифуги 5 мин при 10 000 х г при 4 градусах Цельсия и удаляют супернатант. Чтобы убедиться, что все носители удалены, повторите в общей сложности три стирания тщательно удаления супернатант каждый раз.
  3. Добавить 1 мл фенола и гуанидина изотиоцианат раствор(Таблица материалов) в клетки и пипетка подвески вверх и вниз тщательно. Инкубировать смесь на RT в течение 5 мин.
  4. После инкубации добавьте 250 фенола и гуанидина изотиоцианата
  5. Centrifuge раствор в течение 5 мин при 10000 х г при 25 градусах Цельсия.
  6. Тщательно удалите как можно больше верхнего ваквого слоя с помощью микропипетта, не нарушая нижних органических слоев, и перенесите нижний слой на новую микроцентрифугную трубку без 1,5 мл. К новой трубке добавьте 500 л изопропанола и перемешайте, инвертируя трубку. Инкубировать это решение на RT в течение 5 мин.
  7. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 20 мин при 25 градусах Цельсия.
  8. Сохраняя образцы на льду, удалите как можно больше изопропанола с помощью микропипетта и аккуратно добавьте 1 мл 70% (v/v) этанола в RNase-free ddH2O в трубку. Убедитесь, что не выбрасывать раствор непосредственно на дно трубки; нанесите этанол/водяную смесь на сторону трубки.
  9. Центрифуга при 10 000 х г в течение 5 мин при 25 градусах Цельсия.
  10. Удалите большую часть этанола и высушите воздух на льду в течение 3-5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол должен быть удален после этого шага; однако, тщательный осмотр дна пробки важн для того чтобы обеспечить никакой этанол выйдн.
  11. После того, как трубка высохнет, добавьте 15-20 л dNase ddH2O и измерьте концентрацию РНК и чистоту с помощью спектрофотометра на 260 нм длины волны. Чистота образца должна измеряться как соотношение 260 нм/280 нм. Это соотношение должно быть примерно в 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированная РНК может быть заморожена и храниться при -20 градусов по Цельсию. Это, однако, весьма предпочтительнее использовать комплект синтеза кДНК как можно скорее для обеспечения высокого качества производства кДНК. Количественные ПЦР могут следовать с помощью инструкций, предоставляемых производителем термоциклора, используемого в лаборатории.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, описанный здесь, допускает конкретную изоляцию unc-17::GFP-положительных холинергических нейронов от круглого червя C. elegans для последующих исследований ex vivo, таких как профилирование экспрессии генов типа клеток и в конечном итоге кратковременное культивирование для измерения электрофизиологии патч-зажима.

Рисунок 1 показывает unc-17::GFP-положительные холинергические нейроны в их нормальной обстановке. Ген unc-17 выражается во всем теле C. elegans и кодирует везикулярный ацетилхолин трансмембранный транспортер17. Выражение этого гена можно наблюдать в голове, середине тела, и хвост нейронов и нейронов проекций.

На рисунке 2A показан живописный обзор процедуры изоляции нейронов, изложенный в разделе методов. Первый шаг заключается в синхронизации и культуры червей. Дополнительно, Рисунок 2B показывает репрезентативные микрографы флуоресценции unc-17::GFP-положительные нейроны после изоляции, а также соответствующий отрицательный контроль от неизмененных животных дикого типа N2. Изолированные клетки могут оставаться в живых до 3 дней, когда дополняются L-15 Лейбовица среднего и 10% FBS.

На рисунке 3 показаны репрезентативные данные qPCR от GFP, выражающие холинергические нейроны, а также GFP-выражающие мышечные клетки. После успешной сортировки клеток любым методом, РНК была выделена с помощью фенола и гуанидина изотиоцианата метод, после которого кДНК была произведена с помощью набора синтеза. Выражение холинергических нейрон-специфических генов, tph-1 и snb-1, триптофан гидроксилазы и синаптической везикл транспортер, соответственно, повышен в UNC-17::GFP изолированных клеток, но не присутствует в мио-3::GFP изолированных ячеек. Обратное верно с выражением мышцы конкретных миозина тяжелой цепи стенограммы мио-2. Выражение последнего гена ограничивается изолированными мышечными клетками, но не изолированными холинергическими клетками.

Figure 1
Рисунок 1: Реконструированное изображение холинергических нейронов в однодневных диких трансгенных животных типа, выражающих unc-17::GFP репортер. Изображение было собрано из четырех отдельных конфоковых флуоресценции изображения одного и того же червя, охватывающих длину всего животного. Шкала бар каждого отдельного изображения составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс изоляции клеток и репрезентативных GFP-выражающих ячеек, изолированных от unc-17::штамм GFP. (A) Схематическое изображение рабочего процесса для изоляции конкретных популяций клеток, обогащенных unc-17::GFP-выражающие холинергические нейроны из соответствующих трансгенных штаммов C. elegans. (B) Представитель флуоресценции изображения, показывающие наличие сигнала GFP в изолированных unc-17::GFP-положительных ячеек. Обратите внимание, что на изображении отображается один фокусный план. Шкала бар 10 мкм. Рисунок 2B воспроизводится с разрешения журнала клеточной науки и был опубликован Германией и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель qPCR анализ unc-17-нейрон конкретных маркеров(tph-1, unc-47 и snb-1) в целом животных против unc-17::GFP репортер клетки изолирует подтверждающие конкретное обогащение холинергических нейронов, представляющих интерес. Дополнительные отрицательные элементы управления, используемые здесь были мио-3::GFP репортер-выражение мышечных клеток, которые были изолированы после того же протокола. Данные показывают средние значения SD (n - 3 биологические репликации). Злт; 0,05; Злт; 0,01; р Злт; 0,001 в паре т тест. Эта цифра была изменена из Германии и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Круглый червь C. elegans является устоявшейся и мощной моделью для изучения нейронального здоровья и болезни2. С достаточным и генетическим инструментом для манипулирования этими животными и управляемым количеством точно отображенных различных типов нейронов, большое количество данных может быть собрано с относительно небольшим количеством материала. Здесь мы намечаем оптимизированный метод изоляции различных нейронов от целых животных. Путем нарушать протеины кутикулы червя наружные, суспензия различныхтипов клетки можно изолировать, включая нейроны и мышечные клетки 5. Эти изолированные клетки могут быть использованы во множестве уникальных экспериментов. Возможность использования либо клеточной сортировки через цитометрию потока или антитела помечены магнитные бусы позволяет адаптивной техники зависит от параметров конкретного эксперимента. Извлечение РНК из определенного типа клеток C. elegans также позволяет более тщательно изучить и механистическое понимание различных клеточных процессов.

Здесь обсуждаются важные шаги, за которыми необходимо внимательно следить: 1) старение и сбор сытых червей из 25 пластин ФуДР; 2) время инкубации SDS-DTT или лечения смесью протеазы; 3) выбор GFP-позитивных ячеек. Во-первых, во время старения червей, крайне важно быть прилежным, чтобы убедиться, что любые яйца отложенные не люк, так как это вызовет возрастную неоднородность в собранных червей, вызывая значительную изменчивость данных. Шаги мытья при сборе червей для изоляции также необходимы для обеспечения того, чтобы все мертвые или незрелые животные не собраны. Во-вторых, чрезмерная инкубация червей в буфере SDS-DTT может привести к нежелательному распаду важных клеточных компонентов и токсичности для червей, предотвращая изоляцию типов целевых клеток. Поддержание жизнеспособности клеток имеет важное значение для успешного извлечения РНК из или дальнейшего краткосрочного культивирования изолированных клеток. Потому что большинство нейрональных клеток являются деликатными, чрезмерно жесткое лечение во время либо SDS-DTT буфера или лечения протеазы смеси может привести к массовым повреждениям этих клеток. Если путь реакции на стресс является целью эксперимента, условия инкубации могут быть немного изменены, так как высокоредуктовная сила DTT может привести к усилению экспрессии определенных генов реакции на стресс. В этом случае важно успешно мыть клеточные гранулы с l-15-дополненной средой, чтобы остановить реакцию и быстро пополнить запасы клеток питательными веществами. Наконец, тщательный выбор того, какой шаг отбора наиболее подходит для типа клеток, позволит обеспечить максимальное восстановление этих клеток. Аналогичным образом, рассмотрение клеточной локализации клеточных маркеров типа может помочь исследователям выбрать наиболее оптимальный подход к обогащению клеток. Использование цитометрии потока даст более однородной и жизнеспособной клеточной культуры, в то время как использование анти-GFP магнитных бусин меньше времени и трудоемким.

Важно отметить, что описанный здесь метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, надежное выражение GFP в желаемых типах клеток должно быть проверено, чтобы обеспечить подходящую изоляцию FACS или антитела-связанные магнитные бусы. Во-вторых, даже нежный кутикулы нарушения могут привести к плохой урожайности или даже потеря некоторых клеток стенки тела, или других низкообилистя клеток населения, таких как dat-1 дофаминергических нейронов. При выборе типов клеток, более обильный тип клеток обычно может обеспечить более успешный выход. Тем не менее, этот метод может быть использован для изоляции менее обильных популяций клеточного типа, а также.

Таким образом, процедура, обсуждаемая в данной статье, представляет собой эффективный метод извлечения и изоляции отдельных типов клеток от круглого червя C. elegans. Метод является достаточно надежным, чтобы обеспечить экстракцию РНК, и последующего профилирования генов, и достаточно чувствительным, чтобы обеспечить культивирование изолированных клеток. Хотя точная методология, используемая для изоляции определенных групп клеток, может варьироваться в зависимости от различных типов клеток, рабочий процесс, описанный в настоящем докладе, в целом эффективен и может быть применен практически ко всем видам клеток червей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Дженнифер Фокс и членов лаборатории Халимончука за глубокие комментарии. Мы признаем поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (R01 GM108975 в ОК и T32 GM107001-01A1 до E.M.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well plate Fisher Scientific 12-556-004
Agar, Molecular Biology Grade VWR A0930
CaCl2 Sigma C5670
Chloroform Sigma 496189
Contess Automated Cell Counter Invitrogen Z359629
DTT USBiological D8070
Ethanol Decon Labs 2701
FBS Omega Scientific FB-02
Fluorodeoxyuridine Sigma F0503
HEPES Sigma H3375
Isopropanol VWR BDH1133
KCl Amresco O395
KH2PO4 USBiological P5110
Kimwipes Kimberly-Clark Professionals 7552
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
MgCl2 Sigma M8266
MgSO4 USBiological M2090
Na2HPO4·7H2O USBiological S5199
NaCl VWR X190
NaOCl (Bleach) Clorox
NaOH Amresco O583
Penicillin-Streptomicen Fisher Scientific 15140122
Peptone Y USBiological P3306
Pronase E Sigma 7433 protease mixture from Streptomyces griseus
SDS Amresco O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope Tritech Research
Sucrose USBiological S8010
SuperScript IV One-Step synthesis kit ThermoFisher 12594025
TRIzol Invitrogen 15596026 phenol and guanidine isothiocyanate solution
Trypan Blue Stain Invitrogen T10Z82
α-GFP magnetic beads MBL D153-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
  3. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
  5. Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
  6. Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
  7. Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
  8. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
  9. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  10. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
  11. Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
  12. Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
  13. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
  14. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
  15. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
  16. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
  17. Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).

Tags

Биология развития Выпуск 150 C. elegans клеточная изоляция нейроны старение нейрональные маркеры зеленый флуоресцентный белок
Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Germany, E. M., Zahayko, N.,… More

Germany, E. M., Zahayko, N., Khalimonchuk, O. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (150), e60145, doi:10.3791/60145 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter