Summary
Мы описываем методы индукции двух эпителиальных линий молочной железы, HC11 и EpH4. В то время как оба требуют сыворотки плода теленка, инсулина и пролактина для производства молочных белков, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в маммосферы в трехмерной культуре. Эти дополнительные модели полезны для исследований трансдукции сигналов дифференциации и неоплазии.
Abstract
Кадхерины играют важную роль в регулировании дифференциации клеток, а также неоплазии. Здесь мы описываем происхождение и методы индукции дифференциации двух линий эпителиальной клеточной клетки молочной железы, HC11 и EpH4, а также их использование для изучения дополнительных этапов развития молочной железы и неопластической трансформации.
Линия эпителиальной клеточной клетки мышки HC11 возникла из молочной железы беременной мыши Balb/c. Он дифференцируется, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности чашки Петри в среде, содержащей сыворотки икроножной железы плода и Hydrocortisone, Insulin и Prolactin (HIP среды). В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки и сывороточный кислотный белок (WAP), похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы, и образуют рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами».
Линия клеток EpH4 была получена из спонтанно увековеченных мышей молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от беременной бальзам / c мыши. В отличие от HC11, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в сфероиды (также называемые маммосферы), когда культивируется в трехмерных (3D) условиях роста в среде HIP. Клетки трипсинизированы, подвешены в 20% матрице, состоящей из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), покрынные поверх слоя концентрированной матрицы, покрывающей пластиковую тарелку Петри или многоцветную пластину, и покрытые слоем 10% матрицы, содержащей HIP среду. В этих условиях клетки EpH4 образуют полые сфероиды, которые демонстрируют апикально-базальную полярность, полый просвет, и производят к-казеин и WAP.
Используя эти методы, наши результаты показали, что интенсивность сигнала cadherin/Rac имеет решающее значение для дифференциации клеток HC11. В то время как Rac1 необходим для дифференциации и низких уровней активированного RacV12 увеличить дифференциацию, высокие уровни RacV12 блокируют дифференциацию, вызывая неоплазию. В отличие от этого, клетки EpH4 представляют собой более раннюю стадию в дифференциации эпителии молочной железы, которая тормозится даже низким уровнем RacV12.
Introduction
В нормальных тканях или опухолях клетки имеют широкие возможности для примыкания к своим соседям в трехмерной организации, и это передразняется в культуре высоким ростом клеток плотности. Клеточная стежка опосредована главным образом через рецепторы кадерин, которые определяют архитектуру клеток и тканей. Интересно, что недавно было продемонстрировано, что кадерины также играют важную роль в трансдукции сигналов, особенно в выживании сигнализации1. Парадоксально, но некоторые из этих клеточных стыковочных сигналов, исследующих из кадерин, были недавно найдены общими как дифференциации и неоплазии2. Здесь мы описываем методы индукции и оценки дифференциации в двух представительных типах эпителиальных клеточных линий молочной железы мыши, HC11 и EpH4.
Линия эпителиальной клеточной линии мыши HC11 может стать полезной моделью для изучения дифференциации эпителиальных клеток. Клетки HC11 являются comMA-1D-производные клеточной линии, происходящих из молочной железы в середине беременной Balb / c мыши3. В отличие от других производных клонов COMMA-1D, клон HC11 не требует экзогенно добавленной внеклеточной матрицы или кокультивации с другими типами клеток для индукции в пробирке эндогенного гена эндогенного гена лактогенными гормонами3. Эта клеточная линия была широко использована в исследованиях дифференциации, потому что она сохранила важные характеристики нормального эпителия молочной железы: клетки HC11 могут частично воссоздать протоковый эпителий в очищенной молочной жирной площадке4. Кроме того, они могут дифференцировать в двумерной (2D) культуры, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности блюда Петри в присутствии стероидов,таких как Hydrocortisone или Дексаметазон, в дополнение к Insulin и Prolactin (HIP средний) не хватает эпидермального фактора роста (EGF), ингибитор дифференциации5,6. В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки, такие как к-казеин и WAP, которые обнаруживаются западными промотированием в течение 4 дней после индукции. В то же время, часть клеток HC11 образует рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами» в стохастической манере. Куполы видны через 4-5 дней после индукции и постепенно увеличиваются в размерах до 10-го дня, что сопутствует увеличению производства к-казеина8. Интересно, что клетки HC11 обладают мутантом p539,и поэтому представляют собой преднеопластическое состояние. По этой причине модель HC11 идеально подходит для изучения сигнальных сетей дифференциации в сочетании с неоплатой в одной и той же клеточной системе.
Клетки EpH4, производные im-2 клеток, являются неопухолевой клеточной линии первоначально полученных от спонтанно увековеченных мыши молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от середины беременности Balb / C мыши10. Клетки EpH4 образуют непрерывные эпителиальные монослои в 2D-культуре, но не дифференцируются в железоподобные структуры10,11. Однако, после 3D роста в материале, состоящем из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши EHS12 (EHS matrix, matrix, или Matrigel, см. Таблица Материалов),в дополнение к стимуляции с HIP, epH4 клетки могут резюмировать начальные стадии дифференциации молочной железы. В этих условиях клетки EpH4 образуют сфероиды (также называемые маммосферами), которые демонстрируют апикально-базальную полярность и полый просвет, и способны производить молочные белки и WAP, похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы. В отличие от клеток HC11, которые являются недифференцированными, а некоторые выражают мезенхимальные маркеры13,клетки EpH4 демонстрируют чисто светлую морфологию14. EpH4 клетки также сообщалось производить молочные белки в 2D культуры путем стимуляции с дексаметазоном, инсулином и пролактином15. Однако такой подход исключает изучение регулятивных эффектов, имитирующих микросреду молочной железы в 3D-культуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Покрытие hC11 Клетки
- В ламинарном капоте с использованием стерильных методов подготовить бутылку с 50 мл Среды клетки HC11: RPMI-1640 с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 5 мкг/мл инсулина, и 10 нг/мл EGF (см. Таблица материалов).
- Плита приблизительно 400,000 клеток в 3 см Чашка Петри: Передайте 2 10 см, 50% свяжените блюда Петри в двадцать 3 см блюд в среде HC11. Клетки должны быть хорошо распространены, но высыхания следует избегать.
- Аспирируйте среду в колбу с помощью вакуумного насоса.
- Добавьте 250 зл трипсина (см. Таблицу Материалов)на тарелку 10 см. Вихрь и ударил пластину со стороны, сохраняя его горизонтальным для распространения трипсина и выбить прикрепленные клетки
- Обратите внимание под фазовой контрастной микроскопией с целью 4x, чтобы убедиться, что клетки начали отсажиться от краев перед пипеткой.
- Аспирируйте примерно 1,5 мл среды HC11 в стерильной, 9-дюймовой пипетке Pasteur и впрыскивают его вертикально против клеток. Поверните чашку Петри, брызгая, чтобы выбить все клетки. Вы должны работать быстро, чтобы избежать сушки клеток.
- Перенесите все клетки в бутылку со средним HC11 и вихрем.
- Пипетка 2 мл клеточной подвески в каждом 3 см Чашка Петри. Рок Петри блюда поперечно распространяться равномерно. Поместите клетки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- На следующий день, или когда клетки 90-100% смещаются, аспирируют среду и заменяют его на среду с FBS и инсулином, но не хватает EGF.
2. Индукция дифференциации, мониторинг и количественная оценка клеток HC11
- После выращивания клеток в среде не хватает EGF для 24 ч, добавить дифференциации среды (HIP средний) до десяти 3 см пластин: RPMI-1640 дополнены 10% FBS, 1 мкг /мЛ Hydrocortisone (см. Таблица материалов), 5 мкг /мЛ Insulin и 5 мкг /мл Prolactin (см. Таблица материалов)в течение 10 дней.
- Держите другие десять 3 см пластин в качестве элементов управления: Изменение на среду с 10% FBS и 5 мкг /мл инсулина не хватает EGF и HIP.
- Изменение среды каждые 2-3 дней как HIP-обработанных клеток и элементов управления. Pipette среды тщательно, чтобы убедиться, что клетки не отсоединяться.
- Для мониторинга дифференциации (т.е. формирования "куполов"), наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопией(рисунок 1А,левая панель). Если клетки выражают зеленый белок флуоресценции (GFP), наблюдайте под микроскопией флуоресценции (возбуждение No 485/20; излучение 530/25; увеличение 240x; 20x цель) (Рисунок 1A, правая панель).
- Для количественной оценки степени дифференциации, извлечь белки из одного блюда Петри каждый из HIP обработанных клеток и элементов управления, один раз в день в общей сложности 10 дней и зонд западных помарки для к-казеина (см. Таблица материалов) (Рисунок 1B).
- Очистите клетки на льду с 1,5 мл холодного фосфатного сосудистого сосудистого раствора (PBS) в 1,8 мл пластиковой центрифуги трубки.
- Пелле клетки на 350 х г, 1 мин, 4 C.
- Быстро промыть гранулы 2x с ледяной PBS. Слейте воду любые остатки.
- Сделать буфер лисиса: 50 мМ HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10 мМ EDTA, 10 мМ Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 мМ Na 3 VO4, 0,5 мм фенилметилсулфонил фторид (PMSF), 10 мкг/мл протетинин, 10 мкг/м люпептин16. Добавьте 100 л на 3 см блюда Петри.
- Уточните лизат центрифугирование при 10 000 х г в течение 10 мин на холоде.
- Определите концентрацию белка (см. Таблица Материалов)и загрузите 10–20 мкг белка из каждого образца на 10% полиакриламид-SDS гель.
- Электрофорез ы 15 ч при 45 В, или при 100 В за 2-2,5 ч.
- Перенесите на нитроцеллюлозу или мембрану PVDF с помощью электроблоттного переносного аппарата (см. Таблицу Материалов).
- Блок с 5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в Tris-буферированный солен с 0,1% Tween-20 (TBST).
- Добавить первичное антитело, коза анти-к-казеин разбавленной 1:2,000 или мыши анти-актин разбавленной 1:1,000 (см. Таблица материалов).
- Вымойте 3x с TBST, 5 минут каждый раз.
- Добавить вторичное антитела, хрен peroxidase (HRP) связаны осла анти-коза разбавленной 1:2,500, или HRP связаны лошади анти-мышь антитела разбавленной 1:10000.
- Вымойте 3x с TBST, 5 минут каждый раз.
- Добавьте реагенты ECL в мембрану в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу Материалов).
3. Покрытие и 3D Рост клеток EpH4 в ehS Матрица
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица жидкая при температурах и твердая при температурах выше. Хранить при -80 градусах по Цельсию. Оттепель при 4 градусах Цельсия в ночь перед использованием. Предварительно охладить ткани культуры пластин и пипетки советы на -20 градусов до обработки и сохранить матрицу, пластины, и пипетки советы на льду, чтобы предотвратить его от затвердевания.
- Выращивайте клетки EpH4 в 2D в среде RPMI-1640 с 10% FBS и 5 мкг/мл инсулина (EGF не требуется).
- Подготовьте матрицу роста EpH4, дополненную 10% (v/v, 3500 qL) или 20% (v/v 2,v 2,000 qL) матрицы в двух 50 мл конических труб. Держите на льду до готовности к использованию.
- Пальто 10 скважин (1 смпо 2 каждый) из 24 хорошо пластины с 150 зл и с неразбавленной матрицы. Распространение матрицы с помощью наконечника пипетки. Избегайте создания пузырьков. Аккуратно коснитесь сторон пластины, удерживая ее горизонтально, чтобы гарантировать равномерное распределение матрицы по нижней части скважины.
- Инкубировать 24 хорошо пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы матрица затвердеть.
- Трипсинизуйте клетки EpH4, описанные выше для клеток HC11, и посчитайте их гемоситометром. Перенесите 5 х 104 ячеек на скважину в стерильную конитрическую центрифугу мощностью 1,5 мл и вращайтесь при 250 х г в течение 5 мин.
- Тщательно аспирируйте среду и поместите трубку на лед.
- Resuspend клетки в 350 qL среды роста EpH4 дополнены 20% матрицы с помощью 1 мл пипетки отзыв при сохранении конической трубки на льду. Избегайте пузырьков. Важно обеспечить одноклеточную подвеску.
- После того, как матрица нижнего слоя затвердела (матрица должна казаться полупрозрачной и светлее по цвету по сравнению с первоначальным покрытием скважин), добавьте 350 злиц клеточной подвески к каждому хорошо покрытому и поместите в инкубатор CO2 при 37-C за 1 ч, чтобы 20% матричного слоя затвердеть.
- Наблюдайте клетки микроскопически под контрастом фазы с целью 4x. Одиночные ячейки должны быть видны.
- Добавьте 200 qL среды EpH4, содержащей 10% матрицы в верхней части 350 злители клеток, подвешенных в 20% матрице. Инкубировать при 37 градусах Цельсия.
4. Индукция дифференциации клеток EpH4, выращенных в 3D (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо дифференциации, клетки EpH4 также могут пройти тубурогенез при стимуляции с HGF (фактор роста гепатоцитов) в 3D-культуре. Трубчатые наросты можно увидеть после 10 дней стимуляции HIP и HGF.
- Начало индукции дифференциации клеток EpH4 через день после покрытия в матрице. Тщательно удалите 150 л верхней среды, содержащей 10% матрицы из колодцев с помощью пластикового наконечника пипетки. Добавьте 200 qL среды EpH4, содержащей HIP и 10% матрицы.
- Замените 10% матрицу-HIP среды каждые 2 дня на срок до 10 дней. Выращивайте контрольные клетки в той же 10%-ной матричной среде без HIP.
- Мониторинг формирования маммографии под фазовой контрастносткой(рисунок 3А,нижняя панель).
5. Тубурогенез индукции клеток EpH4, выращенных в 3D(Рисунок 3A и 3C)
- Подготовьте 24 скважины и клетки EpH4 для роста в матрице, как подробно описано в шагах 3.1-3.9. На следующий день после покрытия клеток в матрице, удалить 150 Зл EpH4 среды, содержащей 10% матрицы из колодцев с помощью пластиковой наконечник пипетки. Добавьте 200 кЛ среды EpH4, содержащей 10% матрицы, HIP и 20 нг/мл HGF (см. Таблица материалов).
- Замените 10% матрицу/HIP/HGF среду каждые 2 дня на срок до 12-14 дней.
- Монитор тулучки формирования микроскопически с помощью 20x или 40x цель(рисунок 3A, правая панель).
6. Количественная дифференциация: Западный Блоттинг для к-казеина
- Тщательно pipette от 10% матрицы-HIP среды из скважин. Промыть 20% матричного слоя 2x с 350 л ледяной PBS. Сфероиды должны по-прежнему присутствовать в матричном слое.
- Добавьте 700-1000 л ледяной PBS с 1 мм этилэндениаминетететраацетической кислоты (ЭДТА) непосредственно в скважины. Аккуратно отсоедините нижний слой 100% матрицы от колодца с наконечником пипетки для восстановления сфероидов, присутствующих в этом слое. Встряхните осторожно в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Аккуратно перенесите сфероидную подвеску в коническую трубку. Промыть скважины с помощью 500 евро PBS-EDTA, чтобы восстановить оставшиеся сфероиды в скважинах и добавить в коническую трубку.
- Рок на льду еще 30 мин. Убедитесь, что матрица полностью растворилась. Если видны видимые матричные комки, добавьте больше PBS-EDTA или встряхните дольше.
- Centrifuge раствор для гранул ы сфероидов на 350 х г в течение 5 мин.
- Аспирировать супернатант, лисс сфероидов в ледяной буфер лиза, и зонд для к-казеина, циклина D1, и p120RasGAP по западной blotting как в шаге 2.5 выше16. В качестве первичных антител, используйте козьего анти-к-казеина разбавленного 1:2,000, кролика анти-циклин D1 разбавленный 1:2,000, и мышь анти-p120 разбавленной 1:2,000. Для вторичных антител, используйте HRP связаны осла анти-козла разбавленной 1:2,500, HRP связаны осла анти-кролик разбавленной 1:2,500, и HRP связаны лошадь анти-мышь разбавленной 1:10000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Давно известно, что дифференциация эпителиальных клеток и адипоцитов требует слияния и вовлечения кадерин2. Мы и другие продемонстрировали, что сливка от клетки к ячейке и вовлечение E- или N-кадерин и кадхерин-11, как происходит с слиянием культивированных клеток, вызывает резкое увеличение активности небольшой GTPases Rac и клеточного деления протеина 42 (Cdc42), и этот процесс приводит к активации интерлейкина-6 (IL6) семейства цитокинов и Stat3 (сигнал транскрипции и активатор транскрипции-316,17)1,18. Поскольку многие компоненты пути cadherin/Rac/IL6/Stat3 могут участвовать как в дифференциации, так и в неопластической трансформации, они обеспечивают молекулярные ручки для изучения взаимосвязанности этих двух диаметрально противоположных процессов.
Используя методы, описанные выше, мы продемонстрировали поразительную зависимость дифференциации от силы сигнала Rac в клетках HC11: В то время как эндогенные cRac1 необходимы для дифференциации, и при низких уровнях мутационно активированного RacV12 вызывает явное увеличение дифференциации потенциала, высокие уровни RacV12 вызывают драматический блок дифференциации, вызывая при этом неоплазию (Рисунок 1B). В отличие от этого, даже низкие уровни экспрессии RacV12 блокировали дифференциацию в ячейках EpH42. Кроме того, несмотря на то, что RacV12 активирует Stat3 во многих клеточных системах, включая HC1116, мутационно активированный Stat3C блокирует дифференциацию, вызывая неопластическую трансформацию20.
Мы также исследовали дифференциации свойств клеток EpH4 в 3D матричной культуре. В то время как производство казеина достигло максимума в 8-10 дней, выражение циклина D-1 было максимальным на 4-6 дней после стимуляции HIP(рисунок 3B). Эти выводы подтверждают обратную связь между распространением и дифференциацией в модели EpH4. Используя DAPI (ядерную) окрашивание и конфокальную микроскопию для определения позиционирования отдельных эпителиальных клеток, мы наблюдали внутреннюю гибель клеток и образование полых люменов в маммосферах (Рисунок 3A,C). Мы также показали, что добавление HGF (20 нг/мл) на 48 ч к среде HIP привело к образованию трубчатых структур(Рисунок 3A,C), в соответствии с более ранними исследованиями электронной микроскопии21. Эти подходы с использованием модели EpH4 позволяют охарактеризовать специфические особенности эпителиальной дифференциации молочной железы и их связь с различными путями трансдукции сигнала.
Рисунок 1: Оценка и количественная оценка дифференциации клеток HC11. (A) Купол, образованный в клетках HC11, выражающий низкий уровень GFP-RacV12 в 10 дней после индукции дифференциации. Слева: Фазовый контраст; Справа: Флуоресценция одного поля (фото не опубликовано ранее). Шкала бар 100 мкм; Увеличение 240x; 20x цель. (B) Влияние RacV12 на дифференциацию HC11: Низкий (полосы 19-24), промежуточный (полосы 13-18), или высокие (полосы 7-12) уровни RacV12-GFP синтеза конструкции были выражены в клетках HC11. После роста в отсутствие EGF в течение 24 ч, клетки были индуцированы дифференцировать с ДОБАВЛЕНИЕм HIP, или нет, как указано. Экстракты детергента были подготовлены в указанное количество дней спустя и исследованы на ка-тесиноилине или актине в качестве контроля нагрузки. Обратите внимание на резкое увеличение в к-казеина в низких RacV12-GFP выражая клетки (полосы 21-24 против 3-6), и резкое сокращение при выражении высокой RacV12-GFP (полосы 9-12). NE - Контрольные культуры, выращенные в отсутствие EGF, но не индуцированные для дифференцирования (Niit et al.2, воспроизведены с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема накладного метода для выращивания клеток EpH4 в 3D матричной культуре. ()Скважины из 6 хорошо пластины были первоначально покрыты 100% EHS матрицы, которая была разрешена для затвердевания на 37 градусов по Цельсию формирования гелеобразного ложа подвальной мембраны измерения примерно 2-5 мм в толщину. Клетки EpH4 были посеяны на этой кровати в качестве одноклеточной подвески в среде HIP с 20% матрицы. Это было наложено с 10% матрицы в среде HIP. 10% матрицы среды был заменен через день. Клетки размножались и начали образовывать маммосферы после 4-5 дней в культуре (см. раздел Протоколы). (B) Фазовые контрастные изображения клеток EpH4 в 2D (монослой) и 3D (маммосфера) культуры были захвачены с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой (300x увеличение). Представлены репрезентативные изображения на каждом этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: События в 3D ацинарморфном морфогенезе EpH4 в 3D-культуре. (A) Клетки EpH4 были выращены в матричных покрытием 6 скважин и поддерживается в полной 3D-среде, как на рисунке 2. На ранних стадиях морфогенеза клетки размножались, образовывались кластеры и организовывались в две группы: (1) внешний слой поляризованных клеток и (2) внутренний кластер дезорганизованных клеток, перенесший клеточную смерть, соответствующий апоптозу, как показано ранее12. Последнее привело к образованию полого проема, характеризующегося потемнением центра маммосферы, как видно по фазовой контрастной микроскопии. Добавление HGF (20 нг/мл) к среде привело к образованию трубчатых структур. Более 60% hGF-индуцированных агрегатов показали тубулогенез, по сравнению с необработанными контрольных агрегатов, которые этого не сделали. Репрезентативная фазовая контрастная фотография клеток на каждом этапе была сделана с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой (300-x увеличение; Шкала бар 100 мкм). Результаты являются репрезентативными, по крайней мере, трех экспериментов. Схема была адаптирована из Starova et al.22. (B) Клетки EpH4, выращенные в 3D, были собраны в указанные дни. Концентрации белка были нормализованы и равное количество белка (20 мкг) были подвергнуты SDS-PAGE, а затем западные blotting и зондирования с указанными антителами. В качестве сравнения in vivo использовалась гомогенизированная молочная железа из кормящей мыши (MGT). p120RasGAP использовался в качестве независимого контроля погрузки. Выражение циклина D1 увеличило переходно едко совпадающее с размножающимися клетками в течение первых 3-4 дней. В отличие от этого, экспрессия к-казеина достигла пика в 8-10 дней, что соответствует образованию зрелых маммосфер. Результаты являются репрезентативными для двух экспериментов. (C) Образование люмен и тубулогенез маммосфер овбылоцев был подтвержден с помощью DAPI окрашивания ядерной ДНК (флуоресцентный синий) в агрегатах, выращенных на матричных стеклянных крышках. Клетки были зафиксированы в 3% параформальдегида, пермяки с 25 мкг /мл дигетонина, и неспецифические связывания был заблокирован с 3% BSA. Клетки были затем окрашены для ядерной ДНК с DAPI (синий). Крышки были установлены на стеклянные горки с помощью монтажной среды. Фотомикрографы были сделаны из центральной плоскости XY-оси с помощью мультифотон конфокального микроскопа (шкала бар 100 м). Изображения в группах B и C адаптированы из Starova et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клетки HC11 идеально подходят для изучения дифференциации в сочетании с неопластической трансформацией. Дополнительным преимуществом является то, что клетки HC11 легко заражаются ретровирусными вектором на основе Mo-MLV для выражения различных генов. В наших руках клетки EpH4 было труднее заразить теми же ретровирусными вектором, чем HC112.
Контакт между клетками и арест роста являются ключевыми предпосылками для дифференциации клеток HC11. Таким образом, для достижения равномерной дифференциации по всему клеточному слою, важно добиться равномерного распределения клеток в чашке Петри во время посева. Это особенно важно, если желать количественной оценки дифференциации. Трипсинизация должна быть оптимизирована таким образом, чтобы одна клеточная подвеска была достигнута и клетки не теряли жизнеспособность из-за манипуляций.
Клетки, пробифицированные должны быть субконсивными (50–70%), потому что клетки, выращенные до высокой плотности, как правило, сильно придерживаются друг друга, и их разделение трудно. Чтобы избежать сушки клеток, аспирировать с чашкой Петри плоский на полу ламинарного потока капот, а затем наклонбыстро стечь. Обложка чашку Петри с крышкой. При необходимости можно ускорить действие трипсина, поместив чашку Петри в инкубатор 37 градусов по Цельсию.
Потому что клетки очень confluent во время 10 дней следуя за индукцией, важно заменить питательные вещества которые истощены. Когда среда изменена, внимательность должна также быть принята для того чтобы во избежание отслоение клеток, которые не могут приспообетовкочень наилучшим образом к пластмассе из-за высокой плотности клетки. Тем не менее, по нашему опыту, не нужно использовать блюда Петри, покрытые фибронектином, коллагеном или CellTak, чтобы получить хорошие результаты дифференциации, в отличие от дифференциации провидцев, таких как 3T3L123 или Balb/c3T3 производные.
Точное определение белка для экспериментов по блоттингу имеет решающее значение. Потому что белки сыворотки, как правило, прикрепляются к ткани культуры класса пластика, важно, чтобы очистить и мыть клетки в 1,5 мл пластиковой трубки, которая не привлекает белки и добавить буфер лиза на клеточной гранулы, а не лисицы клетки непосредственно на чашке Петри24.
Что касается извлечения белка, это очень важно, чтобы все мытья и лиза решений ледяной и Петри блюда или EpH4 mammospheres на льду во всем. Это связано с тем, что при отсутствии кальция в PBS мытье кадерины не занимаются и в результате Stat3-ptyr705 быстро dephosphorylated25.
Размер блюд Петри, описанных для клеток HC11, достаточен для 3-4 западных пятен (т.е. количество восстановленного белка на блюдо Петри составляет примерно 50 мкг на 3 см блюда). Мы предпочитаем использовать 3 см блюд Петри для экспериментов по дифференциации для облегчения извлечения белка. Если 6 хорошо лоток используется вместо этого, трудно извлечь белки из одного колодца в холоде, сохраняя при этом остальные скважины стерильны. Кроме того, концентрация CO2 важна для дифференциации, и трудно поддерживать ее для остальной части скважин, так как белки извлекаются из одной скважины на скамейке.
По нашему опыту, в отличие от дифференциации проредипоцитов23,несколько партий сыворотки плода теленка способны поддерживать рост, а также дифференциацию клеток HC11 или EpH4. Одна партия новорожденных сыворотки теленка испытания не поддерживает дифференциацию, хотя она может поддерживать нормальный рост: клетки, как представляется, дифференцировать на первый, но потеряли способность дифференцировать после трех проходов в сыворотке крови новорожденных теленка.
В отличие от клеток HC11, дифференциация клеток EpH4 тесно связана с окружающей архитектурой 3D-матрицы. Мы описываем шаги, необходимые для дифференциации EpH4 в 3D-культуре, измененной по сравнению с предыдущими исследованиями26,27,28 и последующей экстракцией белка для анализа производства к-казеина. Матрица EHS является жидкой при низких температурах (lt;10 c) и затвердевает при более высоких температурах. Обычно он хранится при -80 градусах Цельсия, но рабочие аликвоты могут храниться при -20 градусах Цельсия. Оттепель матрицы при 4 градусах По Цельсию в ночь перед использованием и предварительно холод ткани культуры пластин и пипетки советы на -20 градусов до обработки. Для точной оценки концентрации белка важно полностью устранить матрицу перед экстракции с холодной промывкой PBS, потому что матрица богата белком, который может свести с ума результаты определения белка.
Зависимость EpH4 от матрицы для дифференциации была продемонстрирована в нескольких экспериментальных моделях: Reichman et al.10 показали, что клетки EpH4, индуцированные лактогенными гормонами, вырабатываются в области осаждения ламинина и усилены экспрессией цитокератина. Somasiri et al.11 продемонстрировали, что PI3-киназа необходима для адеколов-зависимых сфероидных образований и дифференциативного экспрессии гена молочного белка. Кроме того, Brinkmann et al.21 продемонстрировали, что выражение трансинфицированного HGF cDNA в клетках EpH4 индуцированного ветвления тубурогенеза сфероидов в 3D-модели культуры, аналогично наблюдаемому образованию черепашки, индуцированной HGF, наблюдаемой здесь(Рисунок 3A,C). Эти выводы иллюстрируют преимущества модели клеточной линии EpH4 для изучения сигнальных событий, которые регулируют дифференциацию молочных желез.
Клетки EpH4 также могут образовывать маммосферы, когда покрывали при концентрациях сыворотки плода ниже, чем 10% описанных. Интересно, что они могут образовывать маммосферы при более низких концентрациях, или даже при отсутствии 20% или 10% матрицы, когда покрываются поверх слоя 100% матрицы22,27. При отсутствии матрицы в клеточной суспензии избегается охлаждение клеток. Дополнительным преимуществом является то, что все клетки находятся в одной плоскости, поэтому их легче фотографировать.
Значение: Участие кадхерин в культивированных клетках, которое приближается к физиологическому состоянию клетки in vivo, может активировать путь Rac/IL6/Stat3. Это может быть особенно важно в дифференциации эпителиальных клеток. Используя описанные методы, наши результаты выявили интенсивность сигнала, исполнивого из этого пути в качестве центрального детерминанта в балансе между пролиферацией клеток против дифференциации, два принципиально противоположных процесса2. Глубокое исследование оси E-cadherin/Rac/Stat3 может выявить новые амфиболические компоненты пути в зависимости от уровня выражения, которые могут быть использованы в качестве мишеней для терапии рака. Для таких целей, полное ингибирование не будет необходимо обратить вспять неопластический фенотип. Частичное торможение было бы даже полезно, потому что остаточные количества могут фактически блокировать трансформацию и способствовать дифференциации. Это может варьироваться в зависимости от цели, а также тип опухоли в вопросе, как показано на различных поведение RacV12 против Stat3C, в HC11 против EpH4 клетки2,20.
Будущие приложения: Путь cadherin/Rac/IL6/Stat3 может играть аналогичную роль в дифференциации других эпителиальных клеток, таких как человеческая грудь MCF10A или собачья почка MDCK29 клеточных линий, а также другие типы дифференциации, которые зависят от клеточного слияния, таких как професипоциты и миобласты30, которые выражают различные типы кадр. Наконец, этот метод может быть использован для изучения роли Stat531 и других компонентов дифференциативных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Линия клеток HC11 была любезно предоставлена доктором Д. Мединой (Хьюстон, Техас). Авторы благодарны доктору Эндрю Крейгу из Королевского университета за множество реагентов и ценных предложений. Клетки EpH4 были подарком от доктора C. Roskelley (UBC, Ванкувер). Коллин Шик оказала отличную техническую помощь для 3D-культуры исследований.
Финансовая помощь Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда рака молочной железы (CBCF, Онтарио Глава), Канадского альянса исследований рака молочной железы , Онтарио Центры передового опыта, рака молочной железы действий Кингстон (BCAK) и Клэр Нельсон завещание фонда через гранты LR с благодарностью признается. BE получил грантовую поддержку от CIHR, CBCF, BCAK и онкологических исследований общества Инк PTG поддерживается Канады научно-исследовательский председатель, Канадский фонд инноваций, CIHR, NSERC и Канадского онкологического общества. MN была поддержана студентом из Терри Фокс Учебная программа в transdisciplinary исследований рака от NCIC, Высшей премии (ЗГА), и премия декана от Университета королевы. MG была поддержана постдокторской стипендий от армии США рака молочной железы программы, Министерство исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативный исследовательский комитет Королевского университета. VH была поддержана докторской стипендией CBCF и постдокторской стипендией от Программы обучения Фонда Терри Фокса в области трансдисциплинарных онкологических исследований в партнерстве с CIHR. Ханад Адан был получателем летнего обучения NSERC. BS была поддержана наградой выпускника Королевского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
