Summary
Vi beskriver tekniker för differentiering induktion av två bröst epitel linjer, HC11 och EpH4. Medan båda kräver fetala kalv serum, insulin och prolaktin för att producera mjölkproteiner, EpH4 celler kan helt skilja i mammografi i tredimensionell kultur. Dessa kompletterande modeller är användbara för signaltransduktionsstudier av differentiering och neoplasi.
Abstract
Cadherins spelar en viktig roll i regleringen av celldifferentiering samt neoplasi. Här beskriver vi ursprunget och metoderna för induktion av differentiering av två musbröstepitelcellinjer, HC11 och EpH4, och deras användning för att studera kompletterande stadier av mammary körtelutveckling och neoplastisk omvandling.
HC11 mus bröst epitel cell linje härstammar från bröstkörteln av en gravid Balb / c mus. Det skiljer när odlas till sammanflödet fäst vid en plast Petri maträtt yta i medium som innehåller fetala kalv serum och Hydrocortisone, Jagnsulin och Prolactin (HIP medium). Under dessa förhållanden producerar HC11-celler mjölkproteinerna β-kasein och vasslesyraprotein (WAP), liknande lakterande däggdjursepitelceller, och bildar rudimentära bröstkörtelliknande strukturer som kallas "kupoler".
EpH4-cellinjen härstammar från spontant förevigade musbröstkörtelepitelceller isolerade från en gravid Balb/c-mus. Till skillnad från HC11 kan EpH4-celler helt skilja åt i sfäroider (även kallade mammsfärer) när de odlas under tredimensionella (3D) tillväxtförhållanden i HIP medium. Celler trypsinized, upphängd i en 20% matris bestående av en blandning av extracellulära matrisproteiner som produceras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkomceller, pläterade ovanpå ett lager av koncentrerad matris beläggning en plast Petri skålen eller multiwell platta, och täckt med ett lager av 10% matris-innehållande HIP medium. Under dessa förhållanden bildar EpH4-celler ihåliga sfäroider som uppvisar apical-basal polaritet, en ihålig lumen, och producerar β-kasein och WAP.
Med hjälp av dessa tekniker visade våra resultat att intensiteten i katern/rac-signalen är avgörande för differentieringen av HC11-celler. Medan Rac1 är nödvändigt för differentiering och låga nivåer av aktiverad RacV12 öka differentiering, hög RacV12 nivåer blockera differentiering medan inducerande neoplasi. Däremot representerar EpH4-celler ett tidigare steg i däggdjurepiteldifferentiering, som hämmas av även låga nivåer av RacV12.
Introduction
I normala vävnader eller tumörer, celler har omfattande möjligheter för vidhäftning till sina grannar i en tredimensionell organisation, och detta härmade i kulturen av hög densitet celltillväxt. Cell-till-cell vidhäftning förmedlas främst genom kaherinreceptorer, som definierar cell- och vävnadsarkitektur. Intressant nog visades det nyligen att kaheriner också spelar en kraftfull roll i signaltransduktion, särskilt i överlevnad signalering1. Paradoxalt nog visade sig några av dessa cell-till-cell-vidhäftningssignaler som härrör från kaheriner nyligen delas av både differentiering och neoplasi2. Här beskriver vi metoder för induktion och bedömning av differentiering i två representativa typer av musbröstepitelcellinjer, HC11 och EpH4.
DEN HC11 mus bröst epitelial cell linjen kan ge en användbar modell för studier av epitel cell differentiering. HC11 celler är en COMMA-1D-härledd cellinje, som härrör från bröstkörteln av en mitten gravid Balb / c mus3. I motsats till andra COMMA-1D derivat kloner, HC11 klon har inget krav på exogent tillagd extracellulär matris eller samodling med andra celltyper för in vitro induktion av endogenβ-kasein genen av laktogena hormoner3. Denna cellinje har använts i stor utsträckning i differentieringstudier eftersom den har behållit viktiga egenskaper hos den normala bröstepitel: HC11 celler kan delvis rekonstruera duktepitel i en rensad bröst fett pad4. Dessutom kan de skilja i en tvådimensionell (2D) kultur när odlas till sammanflödet fäst vid en plast Petri maträtt yta i närvaro av en steroid som Hydrocortisone eller Dexametason, förutom Insulin och Prolactin (HIP medium) saknar epidermal tillväxtfaktor (EGF), en hämmare av differentiering5,6,7. . Under dessa förhållanden producerar HC11-celler mjölkproteiner som β-kasein och WAP, som kan detekteras av western blotting inom 4 dagar efter induktion. Samtidigt bildar en del av HC11 celler rudimentära bröstkörtelliknande strukturer som kallas "kupoler" på ett stokastiska sätt. Kupoler är synliga 4-5 dagar efter induktion och gradvis öka i storlek upp till dag 10, samtidigt med en ökning av β-kasein produktion8. Intressant nog har HC11 celler mutant p539, och representerar därför ett preneoplastic tillstånd. Av denna anledning är HC11-modellen idealisk för att studera signalnätverk av differentiering i samband med neoplasi i samma cellsystem.
EpH4 celler, ett derivat av IM-2 celler, är en nontumorigenic cellinje ursprungligen härrör från spontant förevigade mus bröstkörtel epitelceller isolerade från en mitten gravid Balb / c mus10. EpH4 celler bildar kontinuerliga epitelial monolayers i 2D-kultur, men inte skilja i körtelliknande strukturer10,11. Men efter 3D-tillväxt i ett material som består av en blandning av extracellulära matrisproteiner som produceras av EHS mus sarkomceller12 (EHS matris, matris eller Matrigel, se Table of Materials), förutom stimulering med HIP, EpH4 celler kan sammanfatta de inledande stadierna av bröstkörtel differentiering. Under dessa förhållanden bildar EpH4-celler sfäroider (även kallade mammografi) som uppvisar apical-basal polaritet och en ihålig lumen, och kan producera mjölkproteiner β-kasein och WAP, liknande lakterande däggdjur epitelceller. Tvärtemot HC11 celler, som är odifferentierade, och några uttryckliga mesenchymal markörer13, EpH4 celler uppvisar en rent luminal morfologi14. EpH4 celler har också rapporterats att producera mjölkproteiner i 2D-kultur genom stimulering med dexametason, insulin och prolaktin15. Detta tillvägagångssätt utesluter dock studier av regleringseffekter som efterliknar mikromiljön i 3D-kulturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plätering HC11 Celler
- I en laminär flödeshuva med sterila tekniker förbereda en flaska med 50 ml HC11 cellmedium: RPMI-1640 med 10% fetalt bovinserum (FBS), 5 μg/mL insulin och 10 ng/ml EGF (se Materialtabell).
- Platta cirka 400.000 celler per 3 cm Petri maträtt: Passera två 10 cm, 50% confluent Petri rätter i tjugo 3 cm rätter i HC11 medium. Cellerna måste vara väl utspridda men torkning måste undvikas.
- Sug upp mediet i en kolv med hjälp av en vakuumpump.
- Tillsätt 250 μl trypsin (se Materialtabell)per 10 cm platta. Snurra och slå plattan från sidorna samtidigt som den håller den horisontell för att sprida trypsin och att rubba de bifogade cellerna
- Observera under fas kontrast mikroskopi med en 4x mål för att se till att cellerna har börjat lossna från kanterna innan rörledningar.
- Aspirera cirka 1,5 ml HC11 medium i ett sterilt, 9 tums Pasteur pipett e och spruta den vertikalt mot cellerna. Rotera Petri skålen medan spruta för att rubba alla celler. Du måste arbeta snabbt för att undvika torkning av cellerna.
- Överför alla celler till flaskan med HC11 medium och virvel.
- Pipette 2 ml cellsuspension i varje 3 cm Petriskål. Rock petriskålarna på tvären för att sprida sej jämnt. Placera cellerna i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Nästa dag, eller när cellerna är ~ 90-100% confluent, aspirera mediet, och ersätta den med medium med FBS och insulin men saknar EGF.
2. Differentiering Induktion, övervakning och antal AV HC11 Celler
- Efter att ha odlat cellerna i medium saknar EGF för 24 h, tillsätt differentieringsmedium (HIP medium) till tio 3 cm plattor: RPMI-1640 kompletterad med 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortisone (se Materialtabell),5 μg/ml Insulin och 5 μg/ml Prolactin (se Materialbord) i upp till 10 dagar.
- Håll de andra tio 3 cm plattorna som kontroller: Byt till ett medium med 10% FBS och 5 μg/ml insulin som saknar EGF och HIP.
- Ändra mediet var 2–3:e dag till både HIP-behandlade celler och kontroller. Pipette mediet noggrant för att se till att cellerna inte lossnar.
- För att övervaka differentiering (dvs. bildandet av "kupoler"), observera cellerna under fas kontrast mikroskopi(figur 1A,vänster panel). Om cellerna uttrycker grönt fluorescensprotein (GFP), observera under fluorescensmikroskopi (excitation = 485/20; utsläpp = 530/25; förstoring 240x; 20x mål) (Figur 1A,höger panel).
- För att kvantifiera graden av differentiering, extrahera proteiner från en Petri maträtt var och en av HIP-behandlade celler och kontroller, en gång om dagen i totalt 10 dagar och sond västerländska blots för β-kasein (se Materialtabell) (figur 1B).
- Skrapa cellerna på is med 1,5 ml iskalla fosfat-buffrad saltlösning (PBS) i ett 1,8 ml plastcentrifugrör.
- Pellet cellerna vid 350 x g, 1 min, 4 °C.
- Tvätta snabbt pelleten 2x med iskall PBS. Dränera eventuella rester.
- Gör en lysbuffert: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0,5 mM fenylmetylulfid (PMSF), 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/ml leupeptin16. Tillsätt 100 μL per 3 cm Petriskål.
- Klargöra lysat genom centrifugering vid 10.000 x g i 10 min i kylan.
- Bestäm proteinkoncentration (se Materialtabell)och lasta 10–20 μg protein från varje prov på en 10% polyakrylamid-SDS gel.
- Elektrophorese för 15 h på 45 V, eller på 100 V för ~2–2,5 h.
- Överför till ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran med hjälp av en elektroblottingöverföringsapparat (se Materialtabell).
- Block med 5% bovinserumalbumin (BSA) i Tris-buffrad resaline med 0,1% Tween-20 (TBST).
- Tillsätt den primära antikroppen, getanti-β-kasein utspädd 1:2 000 eller mus anti-β actin utspädd 1:1000 (se Materialtabell).
- Tvätta 3x med TBST, 5 min varje gång.
- Tillsätt den sekundära antikroppen, pepparrotperoxidas (HRP) länkade åsna anti-get utspädd 1:2 500, eller HRP länkade häst anti-mus antikropp utspädd 1:10.000.
- Tvätta 3x med TBST, 5 min varje gång.
- Lägg till ECL-reagenser i membranet enligt tillverkarens anvisningar (se Materialförteckning).
3. Plätering och 3D-tillväxt av EpH4-celler i EHS Matrix
OBS: Matrisen är flytande vid temperaturer <10 °C och fast vid temperaturer över. Förvaras vid -80 °C. Tina vid 4 °C natten före användning. Förkyl vävnadsodlingsplattorna och pipettspetsarna vid -20 °C före hantering och håll matris-, plattorna och pipettspetsarna på isen för att förhindra att den stelnar.
- Odla EpH4-celler i 2D i RPMI-1640 medium med 10% FBS och 5 μg/ml insulin (EGF krävs inte).
- Förbered EpH4-tillväxtmedium kompletterat med 10% (v/v, 3 500 μL) eller 20% (v/v 2 000 μL) matris i två 50 ml koniska rör. Håll på is tills du är klar att använda.
- Coat 10 brunnar (1 cm2 vardera) av en 24 brunnsplatta med 150 μL outspädd matris. Sprid matrisen med en pipettspets. Undvik att skapa bubblor. Knacka försiktigt på sidorna av plattan medan du håller den horisontellt för att säkerställa att matrisen fördelas jämnt över botten av brunnen.
- Inkubera 24 brunnsplattan vid 37 °C för 1 h så att matrisen kan stelna.
- Trypsinize EpH4 celler som beskrivs ovan för HC11 celler och räkna dem med en hemocytometer. Överför 5 x 104 celler per brunn till ett sterilt koniskt centrifugrör på 1,5 ml och snurra vid 250 x g i 5 min.
- Aspirera försiktigt upp mediet och placera röret på is.
- Resuspend celler i 350 μL epH4 tillväxtmedium kompletterat med 20% matris med hjälp av en 1 ml pipett spets samtidigt som det koniska röret på is. Undvik bubblor. Det är viktigt att säkerställa en enda cellsuspension.
- När den nedre skiktmatrisen har stelnat (matrisen ska verka genomskinlig och ljusare i färg jämfört med den ursprungliga beläggningen av brunnarna), tillsätt 350 μl cellfjädring till varje belagd brunn och placera i en CO 2-inkubator vid 37 °C för ~1 h för att tillåta 20% matrisskiktet att stelna.
- Observera cellerna mikroskopiskt under fas kontrast med en 4x mål. Enstaka celler ska vara synliga.
- Tillsätt 200 μl EpH4-medium som innehåller 10 % matris ovanpå 350 μl celler som är upphängda i 20% matris. Inkubera vid 37 °C.
4. Differentiering Induktion av EpH4-celler som odlas i 3D (figur 2)
OBS: Förutom differentiering, EpH4 celler kan också genomgå tubulogenesis när stimuleras med HGF (hepatocyte tillväxtfaktor) i 3D-kultur. Tubulär utväxter kan ses efter 10 dagar av HIP och HGF stimulering.
- Börja differentieringinduktion av EpH4-celler 1 dag efter plätering i matrisen. Ta försiktigt bort 150 μl toppmedium som innehåller 10% matris från brunnarna med hjälp av en plast pipettspets. Tillsätt 200 μl EpH4-medium som innehåller HIP och 10% matris.
- Byt ut 10 % matris-HIP-medium varannan dag i upp till 10 dagar. Odla kontrollceller i samma 10% matris medium utan HIP.
- Övervaka mammsfärbildning under faskontrast(figur 3A,nedre panelen).
5. Tubulogenesis Induktion av EpH4-celler som odlas i 3D(figur 3A och 3C)
- Förbered 24 brunnsplattor och EpH4-celler för tillväxt i matrisen enligt steg 3.1–3.9. Dagen efter plätering av cellerna i matrisen, ta bort 150 μL EpH4 medium som innehåller 10% matris från brunnarna med hjälp av en plast pipett spets. Tillsätt 200 μl EpH4-medium som innehåller 10% matris, HIP och 20 ng/ml HGF (se Materialtabell).
- Byt ut 10% matris/HIP/HGF-medium varannan dag i upp till 12–14 dagar.
- Övervaka tubulibildningmikroskopiskt med hjälp av ett 20x eller 40x mål(figur 3A,höger panel).
6. Differentiering: Västra Blotting för β-kasein
- Försiktigt pipett e bort 10% matris-HIP medium från brunnarna. Skölj 20% matrisskiktet 2x med 350 μl iskall PBS. Sfäroiderna bör fortfarande finnas i matrislagret.
- Tillsätt 700–1 000 μl iskall PBS med 1 mM etendiamintetraacetisk syra (EDTA) direkt i brunnarna. Lossa försiktigt det nedre lagret av 100% matris från brunnen med en pipett spets för att återställa sfäroider som finns i det lagret. Skaka försiktigt i 30 min vid 4 °C.
- Överför försiktigt sfäroidsuspensionen till ett koniskt rör. Skölj brunnarna med ~500 μl PBS-EDTA för att återställa eventuella återstående sfäroider i brunnarna och lägg till det koniska röret.
- Berg på is i ytterligare 30 min. Se till att matrisen är helt upplöst. Om synliga matrisklumpar ses lägger du till mer PBS-EDTA eller skakar längre.
- Centrifugera lösningen för att pellet spheroiderna vid 350 x g i 5 min.
- Aspirera supernatant, lyse spheroids i iskalla lysbuffert, och sond för β-kasein, cyklin D1, och p120RasGAP av Western blotting som i steg 2,5 över16. Som primära antikroppar, använd get anti-β-kasein utspädd 1:2,000, kanin anti-cyklin D1 spädd 1:2.000, och mus anti-p120 spädd 1:2,000. För sekundära antikroppar, använd HRP-länkade åsna anti-get utspätt 1:2 500, HRP länkade åsna anti-kanin utspädd 1:2 500 och HRP-länkade häst anti-mus utspädd 1:10.000.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har länge varit känt att differentiering av epitelceller och adipocyter kräver sammanflödet och engagemang av kaheriner2. Vi och andra visade att cell-till-cell vidhäftningar och engagemang av E- eller N-cadherin och cadherin-11, som uppstår med sammanflödet av odlade celler, utlöser en dramatisk ökning av aktiviteten hos de små GTPases Rac och celldelningskontroll protein 42 (Cdc42), och denna process leder till aktivering av interleukin-6 (IL6) familj cytokiner och Stat3 (signal givare och aktivator av transkription-316,17)1,18,19. Eftersom många komponenter i cadherin/Rac/IL6/Stat3-vägen kan delta i både differentiering och neoplastisk omvandling, tillhandahåller de molekylära handtag för studier av sambandet mellan dessa två diametralt motsatta processer.
Med hjälp av de tekniker som beskrivs ovan, visade vi ett slående beroende av differentiering på styrkan i Rac signalen i HC11 celler: Medan endogena cRac1 krävs för differentiering, och på låga nivåer mutationally-aktiverad RacV12 orsakar en distinkt ökning av differentiering kapacitet, hög RacV12 nivåer utlösa en dramatisk block av differentiering medan inducerande neoplasi (Figur 1B). Däremot blockerade även låga nivåer av RacV12 uttryck differentiering i EpH4-celler2. Dessutom, även om RacV12 aktiverar Stat3 i många cellsystem, inklusive HC1116, mutationsmässigt aktiverad Stat3C blockerade differentiering medan inducerande neoplastisk omvandling20.
Vi utforskade vidare differentieringsegenskaperna hos EpH4-celler i en 3D-matriskultur. Β-kaseinproduktionen nådde en topp på 8–10 dagar, men cyklin D-1-uttrycket var maximalt 4–6 dagar efter HIP-stimulering (figur 3B). Dessa resultat stöder ett omvänt förhållande mellan spridning och differentiering i EpH4-modellen. Med hjälp av DAPI (nukleära) färgning och konfokal mikroskopi för att bestämma placeringen av enskilda epitelceller, observerade vi inre cell död och bildandet av ihåliga lumen i mammografi(figur 3A,C). Vi visade vidare att tillägg av HGF (20 ng/ml) vid 48 h till HIP-mediet resulterade i bildandet av rörformiga strukturer(figur 3A,C), i enlighet med tidigare elektronmikroskopistudier21. Dessa metoder med EpH4-modellen gör det möjligt att karakterisera specifika funktioner i däggdjursepiteldifferentiering och deras associering med distinkta signaltransduktionsvägar.
Bild 1: Bedömning och kvantifiering av HC11-celldifferentiering. (A)En kupol som bildas i HC11 celler som uttrycker låga nivåer av GFP-RacV12 vid 10 dagar efter induktion av differentiering. Vänster: Faskontrast; Höger: Fluorescens av samma fält (bilder som inte publicerats tidigare). Skalstång = 100 μm; Förstoring = 240x; 20x mål. (B)Effekten av RacV12 vid HC11 differentiering: Låg (körfält 19–24), mellanliggande (körfält 13–18) eller höga (körfält 7–12) nivåer i en Fusionskonstruktion mellan RacV12 -GFPuttrycktes i HC11-celler. Efter tillväxt i avsaknad av EGF för 24 h, celler inducerades att skilja med HIP tillägg, eller inte, som anges. Tvättmedelsextrakt bereds på det angivna antalet dagar senare och undersöktes för β-kasein eller β-actin som lastkontroll. Notera den dramatiska ökningen av β-kasein i låg RacV12-GFP uttrycker celler (körfält 21-24 vs 3-6), och den dramatiska minskningen på uttryck för hög RacV12-GFP (körfält 9-12). NE = Kontrollera kulturer, odlas i avsaknad av EGF, men inte framkallas att skilja (Niit et al.2, återges med tillstånd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk överläggmetod för odling av EpH4-celler i 3D-matriskultur. A) Brunnarna på en 6 brunnsplatta var ursprungligen belagda med 100% EHS matris som tilläts stelna vid 37 ° C bildar en gelled bädd av källaren membran som mäter cirka 2-5 mm i tjocklek. EpH4 celler var seedade på denna säng som en enda cell suspension i HIP medium med 20% matris. Detta var överlagrad med 10% matris i HIP medium. 10% matris medium ersattes varannan dag. Celler ökade och började bilda mammografi efter 4–5 dagar i kultur (se avsnittet Protokoll). (B)Faskontrastbilder av EpH4-celler i 2D-(monolayer) och 3D-kultur (mammsfär) fångades med ett mikroskop utrustat med en digitalkamera (300x förstoring). Representativa bilder visas i varje steg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Händelser i 3D acinar morfogenes av EpH4 i 3D-kultur. (A)EpH4-celler odlades i matrisbelagda 6 brunnsplattor och underhålls i komplett 3D-medium som i figur 2. Under de tidiga stadierna av morfogenes, celler förökade, bildade kluster, och organiserade i två grupper: (1) ett yttre lager av polariserade celler och (2) ett inre kluster av oorganiserade celler som genomgick celldöd, vilket motsvarar apoptos som tidigare12. Den senare ledde till bildandet av en ihålig lumen, kännetecknas av mörknande av mitten av mammografi som ses av fas kontrast mikroskopi. Tillägg av HGF (20 ng/mL) till mediet resulterade i bildandet av rörformiga strukturer. Mer än 60% av HGF-inducerad aggregat visade tubulogenesis, jämfört med obehandlad kontroll aggregat, vilket inte. Ett representativt faskontrastfotografi av celler i varje steg fångades med hjälp av ett mikroskop utrustat med en digitalkamera (300x förstoring; Skalstång = 100 μm). Resultaten är representativa för minst tre experiment. Schemat anpassades från Starova et al.22. (B)EpH4-celler som odlats i 3D skördades på de angivna dagarna. Proteinkoncentrationernormaliserades och lika proteinmängder (20 μg) utsattes för SDS-PAGE, följt av västerländsk tjusning och sondering med de angivna antikropparna. En homogeniserad bröstkörtel från en lakterande mus (MGT) användes som en in vivo jämförelse. p120RasGAP användes som en oberoende lastkontroll. Cyklin D1 uttryck ökade transiently sammanfaller med prolifererande celler under de första 3-4 dagarna. Däremot nådde β-kaseinuttrycket med 8–10 dagar, vilket motsvarar bildandet av mogna mammografier. Resultaten är representativa för två experiment. (C)Lumen bildning och tubulogenesis av mammografi bekräftades med DAPI färgning av kärn-DNA (fluorescerande blå) i aggregat som odlas på matris-belagda glas täcke. Celler fastställdes i 3% paraformaldehyd, permeabiliserad med 25 μg/ml-digitalitonin och ospecificerad bindning blockerades med 3% BSA. Cellerna färgades sedan för kärn-DNA med DAPI (blå). Täckglider monterades på glasrutschbanor med hjälp av ett monteringsmedium. Fotomikrografer togs av det centrala XY-axeln planet med hjälp av ett multiphoton confocal mikroskop (Skala bar = 100μm). Bilder i panel B och C är anpassade från Starova et al.22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HC11 celler är idealiska för studier av differentiering i samband med neoplastisk omvandling. En extra fördel är att HC11 celler lätt kan infekteras med Mo-MLV-baserade retrovirala vektorer för att uttrycka en mängd olika gener. I våra händer var EpH4 celler svårare att infektera med samma retrovirala vektorer än HC112.
Cell-till-cell kontakt och tillväxt gripande är viktiga förutsättningar för HC11 cell differentiering. Således, för att uppnå enhetlig differentiering över celllagret, är det viktigt att uppnå en enhetlig fördelning av celler i Petri skålen vid tidpunkten för sådd. Detta är särskilt viktigt om differentiering önskas. Trypsinization måste optimeras så att en enda cell fjädring uppnås och celler inte förlorar lönsamhet på grund av manipulationer.
Celler som trypsinized måste subconfluent (50–70%), eftersom celler som odlas till höga densiteter tenderar att starkt hålla sig till varandra, och att skilja dem är svårt. För att undvika att torka cellerna, aspirera med Petri skålen platt på golvet i laminarflödeshuven, luta sedan för att dränera snabbt. Täck Petriskålen med locket. Om det behövs kan du påskynda trypsins verkan genom att placera Petriskålen i en 37 °C-inkubator.
Eftersom cellerna är mycket confluent under 10 dagar efter induktion, är det viktigt att ersätta de näringsämnen som är uttömda. När mediet ändras bör man också vara noga med att undvika att cellerna lossnar, vilket kanske inte fastnar särskilt bra på plasten på grund av hög celltäthet. Fortfarande, enligt vår erfarenhet är det inte nödvändigt att använda Petri rätter belagda med fibronectin, kollagen, eller CellTak för att få bra differentiering resultat, till skillnad från differentiera rreadipocytes såsom 3T3L123 eller Balb/c3T3 derivat.
Korrekt proteinbestämning för blotting experiment är kritisk. Eftersom serumproteiner tenderar att fästa på vävnadskulturen sett plast är det viktigt att skrapa och tvätta cellerna i ett 1,5 ml plaströr som inte lockar proteiner och lägger till lysbufferten på cellpelleten i stället för att lysa cellerna direkt på Petriskålen24.
När det gäller proteinutvinning är det mycket viktigt att hålla alla tvätt- och lyslösningar iskall och Petri-diskarna eller EpH4-mammsfärerna på is hela tiden. Detta beror på att i avsaknad av kalcium i PBS tvätta cadherins inte är engagerade och som ett resultat Stat3-ptyr705 snabbt defosforerade25.
Storleken på de Petriskålar som beskrivs för HC11-celler är tillräcklig för 3–4 västerländska blots (dvs. mängden protein som återvinns per Petriskål är cirka 50 μg per 3 cm maträtt). Vi föredrar att använda 3 cm Petri rätter för differentiering experiment för att underlätta proteinutvinning. Om en 6 brunn bricka används istället, är det svårt att extrahera proteiner från en brunn i kylan samtidigt som resten av brunnarna sterila. Dessutom är CO2-koncentrationen viktig för differentiering och det är svårt att behålla den för resten av brunnarna som proteiner utvinns ur en brunn på bänken.
Enligt vår erfarenhet, till skillnad från differentiering av preadipocytes23, flera massor av fetala kalv serum kan stödja tillväxten samt differentiering av HC11 eller EpH4 celler. En hel del nyfödda kalv serum testas inte stödja differentiering, även om det kunde stödja normal tillväxt: cellerna tycktes skilja först men förlorade sin förmåga att skilja efter tre passager i nyfödda kalv serum.
Till skillnad från HC11-celler är differentiering av EpH4-celler tätt kopplad till den omgivande 3D-matrisarkitekturen. Vi beskriver de steg som krävs för EpH4 differentiering i 3D-kultur modifierad från tidigare studier26,27,28 och efterföljande proteinutvinning för analys av β-kaseinproduktion. EHS-matrisen är flytande vid låga temperaturer (<10 °C) och stelnar vid högre temperaturer. Det lagras normalt vid -80 °C, men arbetande alikvoter kan förvaras vid -20 °C. Tina matrisen vid 4 °C natten före användning och förkylvävnadsodlingsplattor och pipettspetsar vid -20 °C före hantering. För en korrekt bedömning av proteinkoncentration är det viktigt att eliminera matrisen helt innan extraktion med kall PBS tvätt eftersom matrisen är rik på protein, som kan förvirra proteinbestämning sett till.
EpH4 beroende av matrisen för differentiering har visats i flera experimentella modeller: Reichman et al.10 visade att EpH4 celler som orsakas av laktogena hormoner produceras β-kasein inom områden av laminin nedfall och intensifierade cytokeratin uttryck. Somasiri et al.11 visade att PI3-kinas krävs för adherens junction-beroende sfäroidbildning och differentiativ mjölkprotein genuttryck. Dessutom visade Brinkmann m.21 att uttrycket av transfected HGF cDNA i EpH4 celler inducerad förgrening tubulogenesis av sfäroider i en 3D-kultur modell, analogt med den observerade HGF-inducerad tubuli bildning sett här (Figur 3A,C). Dessa resultat illustrerar fördelarna med EpH4 cellinje modell för att studera signalering händelser som reglerar bröstkörtel differentiering.
EpH4 celler kan också bilda mammografi när pläterade vid koncentrationer av fetala kalv serum lägre än de 10% beskrivs. Intressant, de kan bilda mammografi er vid lägre koncentrationer, eller ens i avsaknad av 20% eller 10% matris, när pläterade ovanpå ett lager av 100% matris22,27. I avsaknad av matris i cellsuspensionen undviks nedkylning av cellerna. En extra fördel är att alla celler finns i ett enda plan, så de är lättare att fotografera.
Betydelse: Cadherin engagemang i odlade celler, som approximerar fysiologiska tillstånd av en cell in vivo, kan aktivera Rac/IL6/Stat3 vägen. Detta kan vara särskilt viktigt i epitelcell differentiering. Med hjälp av de tekniker som beskrivs, våra resultat utsatt intensiteten i signalen som härrör från denna väg som en central faktor i balansen mellan cellproliferation kontra differentiering, två i grunden motsatta processer2. Den djupgående undersökningen av E-cadherin/Rac/Stat3 axeln kan avslöja nya amfiboliska komponenter i vägen beroende på nivån på uttrycket, som kan utnyttjas som mål för cancerbehandling. För sådana mål skulle fullständig hämning inte vara nödvändigt att vända den neoplastiska fenotyp. Partiell hämning skulle även vara fördelaktigt, eftersom de återstående beloppen faktiskt kan blockera omvandling och främja differentiering. Detta kan variera med målet samt vilken typ av tumör i fråga, som visas från olika beteende RacV12 vs Stat3C, i HC11 vs EpH4 celler2,20.
Framtida tillämpningar: Cadherin/Rac/IL6/Stat3-vägen kan spela en liknande roll i differentieringen av andra epitelceller, såsom humant bröst MCF10A eller hundnjuren MDCK29 cellinjer, liksom andra typer av differentiering som är beroende av cellsammanflödet, såsom preadipocyter och myoblaster30, som uttrycker olika typer av kamoster. Slutligen kan denna teknik utnyttjas för undersökning av rollen som Stat531 och andra komponenter i olika vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
HC11 cel linje var vänligt tillhandahålls av Dr D. Medina (Houston, TX). Författarna är tacksamma mot Dr Andrew Craig av Queen's University för många reagenser och värdefulla förslag. EpH4 celler var en gåva från Dr C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick gav utmärkt tekniskt stöd för 3D-kulturstudier.
Det ekonomiska stödet från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), canadian Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) och Clare Nelson testamente fond genom bidrag till LR är tacksamt erkänt. BE fått bidragfrån CIHR, CBCF, BCAK och Cancer Research Society Inc. PTG stöds av en Kanada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC och Canadian Cancer Society. MN stöddes av ett studentskap från Terry Fox Training Program i tvärvetenskaplig cancerforskning från NCIC, en Graduate award (QGA), och en Dean's Award från Queen's University. MG stöddes av postdoktorala stipendier från US Army Breast Cancer Program, ministeriet för forskning och innovation i provinsen Ontario och advisory research committee of Queen's University. VH stöddes av en CBCF-doktorsgemenskap och ett postdoktoral stipendium från Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research i samarbete med CIHR. Hanad Adan var mottagare av en NSERC sommar studentship. BS stöddes av en Queen's University graduate award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).
