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방법 논문

남성 마우스의 성적 행동의 평가

21.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/60154

⸱

2020년 3월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, The Second Xiangya Hospital, Central South University, National Clinical Research Center for Mental Disorders and National Technology Institute on Mental Disorders, Hunan Key Laboratory of Psychiatry and Mental Health, 2Research Center for Pharmacology & Toxicology, Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Social Medicine and Health Management, Xiangya School of Public Health, Central South University

이 논문에서

요약

이 문서에서는 남성 마우스에서 성적 행동 테스트를 수행 하는 방법을 설명 합니다.

초록

성적 행동은 매우 종에 따라 다릅니다. 설치류는 약간 다른 성적 행동을 가지고 있지만, 마우스와 쥐는 유사한 성적 행동 패턴을 가지고있다. 이 문서의 목적은 호르몬 유도 에스트라스 난소 난소 암소 화 여성 모델 및 남성 마우스의 성적 행동의 평가에 대 한 실험 절차를 설명 하는. 가장 중요한 성적 행동 요소는 비디오 및 그림에서 입증됩니다. 성적 행동 테스트의 중요한 단계, 장점 및 한계도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 동작 매개 변수가 제시되고, 짝짓기의 장착, 내향성 및 사정 프로세스가 구별됩니다. 행동 매개 변수는 테스트 기간 동안 발생한 기간 및 개수 측면에서 평가됩니다.

서론

성숙한 남성 마우스에 있는 성적인 행동은 다른 두뇌 회로에 있는 관련하고 상호 의존적인 호르몬 시스템 및 신경 시스템의 일련의 상호 작용에서유래합니다 1. 또한 개발 경험, 학습, 맥락 및 적절한 파트너가 필요합니다. 행동 분석은 신경 또는 신경 사적 기능에 중요한 반영입니다. 따라서, 동물 모델에 대한 성적 행동 연구는 행동 신경 과학 및 기타 관련 연구에서 널리 사용되어 왔다2. 설치류에서 성적 행동의 정신은 많은 기사와 책1,3,4에설명되어있다 . 예를 들어, 쥐5에서 성적 행동에 대한 Scahs 및 Barfield의 설명은 마우스5에서유사한 행동 패턴을 이해하는 데 도움이되었습니다. 마우스는 행동 연구에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 과목 중 하나입니다. 선체 등6 남성 마우스 성적 행동의 상세한 소개를 했다: 남성 마우스 는 여성을 발생 하는 경우, 그것은 여성의 선 천 성 영역을 조사 하기 시작. 그런 다음, 수컷은 여성의 측면에 앞발을 눌러 뒤쪽에서 여성을 장착합니다. 여성은 특징적인 성적 수용 자세를 나타내며 척추를 활로 구부리고 꼬리를 신체의 한쪽으로 움직여 남성의 성적 침투에 대한 개방적 인트로이터스 (즉, lordosis)를 노출시다. 장착 후, 남성은 빠르고 얕은 골반 추력을 만들고 느리고 깊은 질 추력을 만듭니다. 수많은 내향성 후, 오래 지속되는 추력은 정액의 사정을 초래하며, 그 동안 남성 마우스는 여성6에서분리되거나 떨어지기 전에 약 25 s 동안 얼어 붙을 수 있습니다. 사정에서 남성 마우스 액세서리 땀 샘 은 copulatory 플러그를 형성하기 위해 경화 정액을 포함하는 혼합물을 생성 할 수있다. 마지막으로, 사정 에 이어, 남성은 생식기 그루밍을 시작하고 여성에 대한 관심의 부족을 표시합니다. 간단히 말해서, 남성 성적 행동의 기본 순서는 스니핑으로 구성, 다음, 장착, 내향성, 사정, 그리고 사정 후 그루밍. 마우스 성적 행동은 변형 차이를 나타낸다. 예를 들어, 사정 대기 범위는 594에서 6943 s이며, 내향제의 수는 5에서 100 이상입니다. 사정 후 대기 시간 범위는 17 분에서 60 분입니다. 그러나, 새로운 여성의 도입은이 시간 간격을 줄일 수 있습니다. 어떤 경우에는, 남성은 새로운 여성과 첫 번째 내향성에 사정7.

성적 행동의 평가를위한 주요 이벤트는 장착, 내향성, 사정입니다. 행동 과학자들은 각 행동의 빈도뿐만 아니라 대기 시간 및 시간 간격5,8의측정을 권장했습니다. 과거 연구에서 몇 가지 주요 측정 지표는 다음과 같습니다 마운트 의 수, 내외 사정의 수, 마운트 대기 시간, 내향 대기 시간, 사정 대기 시간, 사후 사정 마운트 대기 시간 (또는 사정 후 간격), 사정 후 내외 대기 시간, copulatory 시리즈의 수, 및 copulatory 시리즈의 기간. Park et al.8 및 Sachs et al.5는 설치류의 장착, 내향성 및 사정의 각 작용을 식별하는 방법을 설명했습니다. 장착은 남성이 뒤에서 여성을 장착하고, 앞다리로 측면을 만지고, 음경 삽입없이 신속하고 반복적으로 그의 성기를 밀어 넣는 것으로 정의됩니다. 음경 삽입이라고도 하는 내향성은 빠른 얕은 추력 후 길고 깊은 추력, 한 개의 뒷다리로 빠른 킥, 여성에서 남성의 현저한 측면 철수 와 같은 행위 중 하나 이상에 의해 식별됩니다. 사정은 내향성및 뒷다리의 고도의 감소보다 느리고 깊은 말단 골반 추력에 의해 확인됩니다. copulatory 시리즈는 사정에 장착에서 각 순서에 의해 확인된다. 본 연구에 사용되는 행동 매개 변수의 정의는 다음과 같습니다 : 1) 장착 대기 시간 : 여성의 도입에서 남성의 첫 번째 장착까지의 시간; 2) 내향적 대기 시간 : 여성의 도입에서 첫 번째 내향성까지의 시간; 3) 사정 대기 시간 : 첫 번째 내적에서 첫 번째 사정까지의 시간 (일반적으로 마지막 골반 추력에 따라); 4) 사후 사정 마운트 대기 시간 : 사정에서 다음 장착까지의 시간; 5) 사후 사정 내외 적 대기 시간 : 사정과 다음 내향성에서 시간; 6) 마운트 수 : 첫 사정 전 장착 횟수; 7) 내향적 인 수 : 첫 번째 사정 전에 내향적 인 수; 8) copulatory 시리즈의 수 : 관찰 기간 동안 copulatory 시리즈의 수; 9) copulatory 시리즈의 기간 : 관찰 기간 동안 모든 copulatory 시리즈의 시간.

성행위 및 관련 행동은 남성의 홈 케이지 또는 밀폐 된 경기장에서 수행 될 수 있으며, 그 중 리스만의 "비밀 없음"미러 링 박스라는 장치가 결합 행동을 관찰하기 위해 도입됩니다3. 비디오 카메라는 측면보기와 복부보기에서 경사 거울을 통해 마우스의 동작을 동시에 기록하기 위해 상자 앞에 배치됩니다. 그러나,이 방법은 필연적으로 쥐의 환경 스트레스를 제거하기 위해 더 이상 습관에 이르게 밝은 조명을 필요로한다. 측정 방법에 관해서는, 비디오 기반 행동 분석은 행동을 기록하고 정량화하는 것이 좋습니다4. 1/1000s 이상의 권장 셔터 속도를 갖춘 프레임별 비디오 사전 옵션이 있는 비디오 레코더를 사용하여 빠른 마우스 움직임을 기록할 수 있습니다. 어두운 환경에서 녹화할 때는 고해상도 적외선 카메라가 필요합니다. 필름을 분석하려면 컴퓨터 조작을 위해 개별 동작 프레임을 캡처할 수 있는 프레임 그래버가 있는 컴퓨터가 필요합니다. 마우스는 매우 다양 하 고 거의 모든 치료 후 보상 동작을 표시할 수 있습니다. 모호성은 모든 움직이는 신체 부위4에대해 존재할 수 있습니다. 따라서 일부 동작을 분석하려면 해상도가 더 높고 속도가 빠른 카메라가 필요할 수 있습니다.

마우스에서 남성의 성적 행동은 변형차이, 호르몬 변화 및 유전자돌연변이체 1,3,9,10을포함한 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. McGill 및 Blight11은 마우스 결합 동작의 변형 률 차이를 보여 주었습니다. 예를 들어, C57BL/6 남성은 일반적으로 신속하게 내향성을 얻고 약 20 분11에서사정합니다. DBA/2 남성은 내향성을 얻기 위해 느리지만 빠르게 사정합니다. BALB/c 남성은 구애의 긴 기간 으로 인해 사정 (1 시간의 평균 대기 시간)을 달성하기 위해 느립니다11. 남성 호르몬 용이 하 고 남성 성적 행동을 유지2,그리고 남성 호르몬 수준에 변화 성적 행동 성능을 변경할 수 있습니다12. 수술 거세 및 antiandrogen 치료 남성 호르몬의 수준을 줄일 수 있습니다 및 성적 행동의 급속 한 감소와 성적 동기 부여 및 성적 흥분을 일으키는13. 관리 된 남성 호르몬 거세 쥐에서 precopulatory 및 copulatory 행동을 복원할 수 있습니다. 마지막으로, 녹아웃 과 녹다운 마우스는 야생 형 마우스에 비해 성적 행동의 측면에서 차이를 표시합니다. 예를 들어, Adcy3, Cnga2 및 Gnao의 표적 돌연변이를 가진 수컷 마우스는 페로몬을 검출하는 감소된 능력을 나타내고, 반면 Trpc2 녹아웃 마우스는 변경된 파트너 선호도14,15,16을나타낸다. 쥐의 성적 행동에 대한 형질 전환 및 녹아웃의 다른 효과는 Crawley3에의해 설명됩니다.

여기서, 호르몬으로 수용될 수 있는 훈증화된 여성과 남성 마우스의 페어링에서 성적 행동을 평가하는 가장 일반적인 절차 중 하나가 설명된다. 실험 프로토콜은 마우스에서 성적 행동 실험을 수행하기 위한 제시된다. 또한, CD-1 마우스에서 사회적 고립으로 인한 성적 행동 패턴의 변화의 예가 도시되어 있다.

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프로토콜

모든 실험은 실험실 동물 관리의 원칙의 지침에 따라 수행되었다 (NIH 간행물 No. 80-23, 개정 1996) 및 의약 연구소의 실험 동물 센터의 아카데미의 승인 및 감독하에 공장 개발 (중국).

1. 축산

  1. 집 암컷 및 수컷 마우스를 25°C에서 12시간 동안 빛/12시간 암흑 주기.
  2. 물과 표준 펠릿 식단을 무료로 이용할 수 있습니다.
  3. 다른 시설에서 수송하는 경우 마우스가 수술 전 7일 동안 환경에 적응할 수 있도록 하십시오.

2. 암컷 마우스의 난소 절제술

  1. 이소플루란(인덕션의 경우 ~4-5%, 유지보수를 위해 ~1-2%)으로 여성(산후 8주, 생후 6주 이상)을 얼굴 콘 마스크를 통해 100% 산소로 마취시요.
  2. 적절한 호흡률(예: 2s당 1회 이상)과 함께 30대 이상 자발적인 움직임이 없는지 확인하여 적절한 마취 깊이를 달성했는지 확인합니다. 또는 뒷발의 발가락에 부드러운 압력에 마우스의 반응을 테스트합니다.
    참고 : 정상적인 호흡 속도는 ~ 180 / 분입니다. 50 %의 속도 하락은 마취 시17일 허용됩니다.
    1. 안과 연고를 사용하여 마취 상태에서 각막 건조및 눈 외상을 예방하십시오.
    2. 마우스의 체온을 36°C 이상으로 유지하십시오. 필요한 경우 마취 기간 동안 추가 열 지원을 제공합니다.
  3. 사용하기 전에 75% 에탄올로 수술대와 단단한 표면을 살균하고 소독하십시오.
  4. 동물을 멸균 된 커튼위에 놓습니다.
  5. 피부를 노출하기 위해 마우스 뒷면의 요추 위에 털을 양자로 면도하십시오.
  6. 노출된 피부를 75% 에탄올로 살균합니다.
  7. 두 허벅지 뿌리의 중심에서 ~1 cm 거리의 머리쪽으로 뒤쪽에 단일 중간선 절개(길이 약 0.5 cm)를 만듭니다(위치는 그림 1에나와 있음).
  8. 작은 가위를 사용하여 피부를 침투하여 근육 층을 노출시키기 위해 기본 근육에서 피하 조직을 부드럽게 풀어보냅니다.
  9. 얇은 근육 층 아래에 난소를 찾아 복강으로 들어가기 위해 작은 절개 (길이 약 5mm)를 만듭니다.
    1. 작은 핀셋을 사용하여 복강 왼쪽에 있는 조직을 약간 당겨 흰색 지방 조직 주위로 감싸는 왼쪽 난소를 보여줍니다(육안으로 볼 수 있는 반투명, 불규칙한 질량, 그림 1참조).
  10. 난소를 둘러싼 난소 지방 패드를 무딘 집게로 철회하여 난관을 노출시다.
  11. 출혈을 방지하기 위해 난관 주위에 단일 합자를 수행합니다.
  12. 작은 가위를 사용하여 난관을 부드럽게 분리하고 난소를 제거하십시오.
  13. 모든 난소 조직이 제거되어 있는지 확인하기 위해 난관을 주의 깊게 확인하십시오. 난소는 표면에 불규칙한 적두가있는 약 5mm × 4mm × 3mm입니다.
  14. 난관의 나머지 부분을 복강으로 다시 놓습니다.
  15. 흡수성 봉합사로 근육 층을 봉합하십시오.
  16. 오른쪽으로 피부를 당겨 오른쪽 근육 층을 노출하고 2.9-2.16 단계를 반복하여 오른쪽 난소를 제거합니다.
  17. 흡수성 봉합사를 사용하여 피부 절개를 닫습니다.
    1. 감염을 방지하기 위해 페니실린 나트륨 (마우스 당 10,000 단위 / 10g)으로 각 마우스를 복강 내 주사하십시오.
    2. 절개 부위를 따라 피부 아래에 리도카인(4 mg/kg, 0.4 mL/kg의 1% 용액)을 주입합니다. 또한 통증 치료를 위해 3일 동안 식수에 이부프로펜(50-60 mg/kg/day, 500 mL의 물에서 어린이 모트린 10mL)을 지속적으로 공급합니다.
  18. 각 마우스를 멸균된 케이지에 개별적으로 넣습니다.
  19. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 약 1-2 시간 동안 면밀한 관찰을 하십시오.
    1. 침구없이 깨끗한 케이지에서 종이 타월에 동물을 복구합니다. 이 단계는 기관 방해 또는 폐렴의 위험을 최소화합니다. 마취 회복 시 추가 열 지원을 제공합니다. 수술 부위를 모니터링하여 상처의 파열을 방지합니다.
  20. 회복 기간 (수술 후 약 24 시간)에 따라 마우스를 홈 케이지로 되돌리시고.
  21. 수술 후 적어도 2 주 동안 실험을 수행하지 마십시오.

3. 여성의 호르몬 유발 에스트로스

  1. McLean 외18에기술된 바와 같이 질 얼룩을 수행함으로써 여성의 에스트로스 단계를 결정합니다. 에스트로스 주기 변화는 여성의 난소 절제술이 성공했음을 나타냅니다.
  2. 에스트라디올 벤조에이트(마우스 당 20 μg, 멸균된 올리브 오일 0.1 mL에 용해, 복강 내)를 48시간 전에 성행동 시험 전에 주입한다.
  3. 프로게스테론 (마우스 당 500 μg, 0.1 mL의 오일에 용해, 복강 내) 4 h 전에 성적 행동 시험.
    참고 : estrus 여성의 자격은 한 케이지에서 성적으로 활발하고 경험이 풍부한 남성과 동거 할 때 남성 마우스의 생식기 삽입을 3 번 이상 수용하는 여성에 의해 결정됩니다.

4. 성적 행동 시험 준비

  1. 마우스 움직임을 관찰할 수 있는 투명한 전면 벽을 제외하고, 검은 색 플렉시 유리 벽이있는 직사각형 및 열린 필드 박스 (40cm x 40cm x 40cm)에서 수컷 마우스의 성적 행동 테스트를 수행합니다.
  2. 일반 객실 조명을 650 럭스로 설정합니다.
    참고: 비정상적인 행동 패턴을 피하기 위해 마우스를 직접 조명해서는 안 됩니다.
  3. 컴퓨터에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 마우스의 움직임과 동작을 비디오 테이프로 녹화합니다.
  4. 암흑 주기의 첫번째 시간 도중 남성 마우스에 행동 시험을 능력을 발휘하십시오.

5. 습관화

  1. 실험실을 조용히 유지하십시오.
  2. 마우스를 오픈 필드 박스의 중앙에 놓고 30 분 동안 자유롭게 환경을 탐색 할 수 있습니다.
  3. 새로운 환경에서 스트레스를 방지하기 위해 기기에서 시험일 2일 연속으로 마우스를 습관화한다.
    참고 : 마우스는 스트레스를 느끼지 않고 자유롭게 이동하고 탐구해야합니다. 남성과 여성 마우스 모두 테스트 환경에 습관화 될 필요가있다.

6. 행동 성 아세

  1. 테스트가 시작되기 전에 카메라를 켭니다.
  2. 테스트 상자의 열린 필드 중앙에서 테스트할 마우스를 놓고 5분 동안 자유롭게 탐색하여 환경에 적응할 수 있습니다.
  3. 암컷을 예험상자에 넣는다.
  4. 30 분 동안 사회 및 짝짓기 행동과 남성과 여성 마우스 사이의 상호 작용을 기록합니다.
  5. 카메라를 끄고 비디오가 저장된지 확인합니다.
  6. 시험 상자에서 여성을 가지고 질 플러그의 형성을 기록합니다.
    참고: 짝짓기를 허용한 여성 마우스는 하루 만에 다른 성적 행동 테스트에 사용할 수 없습니다.
  7. 암컷을 홈 케이지에 다시 놓습니다.
  8. 수컷을 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
  9. 장치 내의 소변, 대변 및 패딩을 청소합니다.
  10. 75% 에탄올로 시험된 마우스의 냄새를 제거합니다.
  11. 6.1-6.10 단계를 반복하여 다음 남성 마우스의 테스트를 시작합니다.

7. 행동 데이터 추출

  1. 비디오 녹화를 재생하고 행동 매개 변수를 추출합니다(그림 2참조).
    1. 30분 만에 탈것을 기록합니다.
    2. 30분 만에 내재 횟수를 기록합니다.
    3. 여성의 도입부터 첫 번째 장착까지의 시간을 장착 대기 시간으로 기록합니다.
    4. 여성의 도입에서 첫 번째 내향성 대기 시간으로 시간을 기록합니다.
    5. 첫 번째 내외에서 첫 번째 사정까지 의 시간을 사정 대기 시간으로 기록하십시오.
    6. 사정 후 마운트 대기 시간으로 다음 장착에 사정에서 시간을 기록합니다.
    7. 30 분 에 copulatory 시리즈의 기록 수. copulatory 시리즈는 사정에 장착에서 각 시퀀스입니다.
    8. 30 분 모든 copulatory 시리즈의 시간을 녹화 시리즈의 기간으로 기록합니다.

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결과

격리된 CD-1 마우스와 그룹 수용 CD-1 마우스 사이의 성적 행동의 비교가 도시된다. 수컷 CD-1 마우스를 무작위로 격리-사육군(IS, 케이지당 마우스 1개, n=30) 및 그룹-하우딩그룹(GH, 케이지당 5마리의 마우스, n=15)으로 배정하였다. 마우스는 산후 일에서 격리 사육을 겪었다 23 일 93. 그 후, 두 마우스 그룹 모두 성적 행동을 평가하였다. 우리의 연구는 copulation의 성공률이 GH 단에서 보다는 IS 단에서 더 낮은 경향이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다 (IS: 80.0%, GH: 86.7%), 단 사이 통계적으로 유의한 다름이 관찰되지 않더라도 (p = 0.458). 장착 대기 시간은 GH 그룹(p = 0.002, 도 3A)보다IS 그룹에서 더 길었으며, 이는 전자가 성적 행동을 시작하는 데 더 많은 시간이 필요했음을 나타낸다. 내향성 대기 시간은 GH 군(p=0.015, 도 3

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토론

제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 여성의 난소 절제술에 관해서는, 뒤에서 열리는 수술 절개는 복부에서보다 덜 해롭습니다. 난소의 위치가 깊다는 것을 감안할 때, 절개가 복부에서 열릴 때 다른 장기를 당기는 것은 종종 출혈로 이어지고 불분명한 수술 시력(20)을초래한다. 우리는 난소에 쉽게 도달하고 수술 시간을 단축할뿐만 아니라 수술의 안전을 보장하기 위해 뒷면에 절개를 수행했습니다.

수술 중 멸균 조건의 유지 보수는 생존을 위해 중요합니다. 수술 공간, 악기, 외과 의사 및 동물의 네 가지 주요 변수가 수술 시 고려됩니다. 작업 공간과 수술실을 포함한 수술 공간의 경우, 필요한 모든 표면을 수술 전에 적절한 소독제(예: 희석 표백제, 과산화수소 제품)로 세척하고 소독합니다. 또한 오토클레이브가 있는 가압 증기를 권장합니다. 외과 수술 중, 교통 흐름은 수술실에서 제한됩니다. 외과 적 수술에서 새로 멸균 된 기구와 재료...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

루콩, 장홍시아, 장베이유, 후미가 실험에 대한 제안에 감사를 표한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
합창 수화물Sinopharm Chenmical 시약 Co., Ltd.
20160225 코팅 VICRYL Plus 봉합사Ethicon, Inc.누락
된 Estradiol benzoateJ & 공급자:K Scientific, Ltd.
에탄올 절대베이징 화학 작품 Co., Ltd.
이부프로펜(어린이용 모트린)Shanghai Johnson & 공급자:Johnson Co., Ltd.
공급자:IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.
리도카인HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd.
수컷 및 암컷 CD-1 마우스Vital River BeijingSCXK(figure-materials-1)2013-0023
올리브 오일
페니실린 나트륨North China Pharmaceutical Co., Ltd.
프로게스테론J& 공급자:K Scientific, Ltd.
소니 디지털 카메라Sony CorporationHDR-CX290E
테스트 박스DIY
ThinkStation 컴퓨터LenovoS/N PCOGLQKG
기화기 IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.E05904-009엠
L930Q170201607151606294782171805011170506107F5126420LR50Q07

참고문헌

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  18. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. Journal of Visualized Experiments. (67), e4389(2012).
  19. Liu, Z. W., et al. Postweaning Isolation Rearing Alters the Adult Social, Sexual Preference and Mating Behaviors of Male CD-1 Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 21(2019).
  20. TIan, E. P., Long, T., Qin, D. N. Establishment and applications of mating model in male rat. Chinese Journal of Andrology. 22 (1), 7-10 (2008).
  21. University of Minnesota Academic Health Center Research Service. Anesthesia Guidelines: Mice. , Available from: https://www.researchservices.umn.edu/services-name/research-animal-resources/research-support/guidelines/anesthesia-mice (2019).
  22. Leypold, B. G., et al. Altered sexual and social behaviors in trp2 mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6376-6381 (2002).

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