Summary
מאמר זה מתאר כיצד לבצע בדיקות התנהגות מינית בעכברים זכרים.
Abstract
התנהגות מינית היא מאוד. ספציפית למינים למרות מכרסמים יש התנהגויות מיניות שונות מעט, עכברים וחולדות יש דפוס דומה התנהגות מינית. מטרתה של מאמר זה היא לתאר את המודל הנשי המושרה ביותר הנגרמת על ידי הורמון והליך ניסיוני להערכת התנהגות מינית של עכברים זכרים. האלמנטים החשובים ביותר התנהגות מינית מומחש וידאו ואיורים. הצעדים הקריטיים, היתרונות והמגבלות של בדיקת ההתנהגות המינית מוסברים גם כן. לבסוף, את הפרמטרים ההתנהגות מוצגים, והרכבה, החוסר, ותהליכי שפיכה בהזדווגות הם נבדלים. פרמטרים התנהגותיים מוערך במונחים של משך שאירע וספירות במהלך תקופת הבדיקה.
Introduction
התנהגות מינית בעכברים זכרים בוגרים נובעת מאינטרקציה של סדרה של מערכות הורמונליות קשורות ותלויות ומערכות עצביות במעגלים ממוח שונים1. כמו-כן, היא דורשת ניסיון התפתחותי, למידה, הקשר ושותף מתאים. ניתוח התנהגותי הוא השתקפות חשובה. בתפקוד העצבי או הנוירוקרוין מכאן, מחקר התנהגות מינית על מודלים בעלי חיים כבר בשימוש נרחב במדעי ההתנהגות ומחקר אחרים הקשורים2. האיתוגרמה של התנהגויות מיניות אצל מכרסמים הוסבר במאמרים רבים ספרים1,3,4. למשל, התיאור של ההתנהגות המינית של Scahs ו Barfield בחולדה5 עזר להבין תבנית התנהגותית דומה בעכברים5. העכבר הוא אחד הנושאים הנפוצים ביותר למחקרים התנהגותיים. הול ואח '6 נתן הקדמה מפורטת של התנהגות גברית עכבר מינית: כאשר עכבר זכר נתקל נקבה, הוא מתחיל לחקור את האזור האנואיברי של הנקבה. לאחר מכן, הזכר לוחץ את כפות הרגליים שלו מול מגדותיו של הנקבה כדי לטעון את הנקבה מאחור. הנקבה מציגה תנוחה מבחינה מינית מאפיין, כיפוף עמוד השדרה שלה לתוך קשת והזזת זנבו לצד אחד של הגוף, חשיפת אינטרוטוס פותח לחדירה המינית של הזכר (כלומר, lordosis). בעקבות ההרכבה, הזכר עושה מהירה, שטחי האגן דחיפות, ואחריו דחיפות ומהנרתיק ומעמיק. לאחר מספר רב של חוסר בעיות, דחף לאורך זמן ארוך התוצאות בפליטת הזרע, שבמהלכו העכבר הגברי עשוי להקפיא על 25 s לפני ביטול טעינה או נפילה מן הנקבה6. בשפיכה העכבר הגברי בלוטות אביזר עשוי לייצר תערובת המכילה זרע התקשה ליצור את התקע השמאלי. לבסוף, בעקבות השפיכה, הזכר מתחיל לטפח באברי המין ומציג חוסר עניין בנקבה. בקיצור, הרצף הבסיסי של התנהגות המין הגברי מורכב לרחרח, לאחר, הרכבה, חוסר הפיכה, פליטה, ושלאחר שפיכה לטפח. עכבר התנהגות מינית מוצגים הבדלים זן. למשל, שפיכה השהיות נעות בין 594 ל 6943 s, ואת המספרים של טווח האינטטרסיות מ 5 כדי יותר מ 100. השהיות שלאחר השפיכה נעות בין 17 ל 60 דקות. עם זאת, המבוא של הנקבה הרומן יכול להקטין את הזמן הזה. במקרים מסוימים, הזכר גומר בחוסר היעילות הראשון עם הנקבה החדשה7.
האירועים העיקריים להערכת התנהגות מינית הם הרכבה, intromission, ושפיכה. מדענים התנהגותיים המליצו על המדידה של לא רק את התדירות של כל פעולה, אלא גם את ההשהיה ואת מרווח הזמן שלה5,8. כמה מחווני המדידה העיקריים במחקרים הקודמים כוללים: מספר טעינות, מספר הפסקות, השהיית הר, השהיית השהיה, השהיית פליטה, השהיה לאחר הפליטה של הר (או לאחר הפליטה מרווחי זמן), השהיה לאחר השפיכה, מספר סדרות הcopulission, ומשך סדרת הסדרה. פארק ואח '8 ו זקס ואח '5 תיאר כיצד לזהות כל פעולה של הרכבה, intromission, ופליטת מכרסמים. ההרכבה מוגדרת בתור הזכר המגביה את הנקבה מאחור, מכניסה את האגפים עם התחת שלו, ומדחף את הפין שלו במהירות ובאופן מהיר ללא החדרת פין. Intromission, הידוע גם בשם הוספת הפין, מזוהה על ידי אחת או יותר מהפעולות הבאות: דחיפה ארוכה, עמוקה לאחר דחיפות שטחי מהיר, בעיטה מהירה עם רגל אחת, ונסיגה לרוחב מסומן של הזכר מן הנקבה. שפיכה מזוהה על ידי דחף האגן הטרמינל כי הוא איטי יותר ועמוק יותר מזה של חוסר מחלות וירידה בגובה הרגליים האחוריות. סדרה שקותית מזוהה על ידי כל רצף מטעינה לשפיכה. ההגדרות של פרמטרים התנהגותיים המשמשים במחקר הנוכחי מפורטות כדלקמן: 1) השהיית הרכבה: הזמן ממבוא של הנקבה להרכבה הראשונה של הזכר; 2) השהיית חוסר הכרה: הזמן ממבוא של הנקבה לחוסר ההתחלה הראשון; 3) השהיית שפיכה: הזמן מחוסר היעילות הראשון לשפיכה הראשונה (בדרך כלל בעקבות דחף האגן האחרון); 4) לאחר הפליטה הר ההשהיה: הזמן משפיכה להרכבה הבאה; 5) השהיית פוסט-הפיכה: הזמן משפיכה ומניעת התגובה הבאה; 6) מספר טעינות: מספר זמני הטעינה לפני השפיכה הראשונה; 7) מספר האינטרוסיות: מספר האי לפני השפיכה הראשונה; 8) מספר סדרות שקופאותית: מספר סדרות הספרים בתקופת התצפית; 9) משך הסדרה: הזמן של כל הסדרות המשולסות בתקופת התצפית.
התנהגות מינית והתנהגות קשורה יכולה להתבצע בכלוב הבית של הזכר או בזירה סגורה, ביניהם מנגנון בשם "אין סודות" של ריסמן תיבת שיקוף מוצגת להתבונן התנהגות ההזדווגות3. מצלמת וידאו ממוקמת לפני התיבה כדי להקליט בו את הפעולה של העכברים מתוך תצוגה לרוחב ודרך מראה נוטה מתוך נוף הגחוני. עם זאת, שיטה זו מחייבת אור בוהק, אשר בהכרח מוביל להרגלה ארוך יותר כדי למנוע לחץ סביבתי בעכברים. באשר לשיטת המדידה, ניתוח התנהגותי מבוסס וידאו מומלץ להקליט ולכמת התנהגות4. מקליט וידאו כי יש מסגרת על ידי מסגרת וידאו אפשרות מראש עם מהירויות תריס מומלצים יותר מ 1/1000 s ניתן להשתמש כדי להקליט תנועות עכבר מהיר. מצלמת האינפרא-אדום ברזולוציה גבוהה נחוצה בעת הקלטה בסביבה אפלה. כדי לנתח את הסרט, מחשב עם חוטף מסגרת כדי לאפשר למסגרות בודדות של התנהגות להילכד עבור טיפול במחשב נדרש. עכברים הם מאוד צדדי והוא יכול להציג התנהגות פיצוי לאחר כמעט כל טיפול. עמימות יכולה להתקיים על כל גוף נע חלק4. מכאן, ניתוח התנהגויות מסוימות עשוי לדרוש עדיין רזולוציה גדולה יותר מצלמות מהירות גבוהה יותר.
התנהגויות מיניות של גברים בעכברים מושפעים מגורמים רבים, כולל הבדלים בזנים, שינויי הורמונים, ומוטנסים של גנים1,3,9,10. מקגיל ומידפון11 מומחש ההבדלים הזנים באופני ההזדווגות של העכבר. לדוגמה, C57BL/6 זכרים בדרך כלל לצבור במהירות ולפלוט בתוך כ 20 דקות11. הזכרים DBA/2 איטיים בכדי לצבור מהירות ולפלוט במהירות. גברים BALB/c הם איטיים כדי להשיג פליטה (השהיה הממוצעת של 1 h) עקב תקופה ארוכה של חיזור11. טסטוסטרון מקלה ומתחזק התנהגות מינית גברית2, ושינויים ברמות הטסטוסטרון יכול לשנות את ביצועי ההתנהגות המינית12. הן סירוס ניתוחי וטיפול אנטי אנדרוגן יכול להפחית את רמת הטסטוסטרון ולגרום לירידה מהירה של התנהגויות מיניות ואפילו מוטיבציה מינית ועוררות מינית13. טסטוסטרון מנוהל יכול לשחזר התנהגויות מראש והתנהגות בעכברים מסורסים. לבסוף, נוק אאוט עכברים להציג הבדלים היבטים של התנהגויות מיניות לעומת עכברים סוג פראי. לדוגמה, עכברים זכרים עם מוטציות ממוקדות של Adcy3, Cnga2, ו-מוצג מראה מופחת יכולת לזהות פרומונים, בעוד Trpc2 עכברים הסתרה להראות העדפה שונה של השותף14,15,16. תופעות אחרות של transgenics ו הסתרה על התנהגות מינית של עכברים מוסברים על ידי קרולי3.
כאן, אחד ההליכים השכיחים ביותר כדי להעריך את ההתנהגות המינית בזיווג של עכבר גברי עם נקבה ovariectomized שכבר מוכן להיות פתוח מתואר. פרוטוקול ניסיוני מוצג לביצוע ניסויים בהתנהגות מינית בעכברים. בנוסף, מוצג דוגמה לשינוי דפוסי התנהגות מינית הנובעים מבידוד חברתי בעכברים מדגמי CD-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה (NIH פרסום No. 80-23, תוקן 1996) ותחת אישור ופיקוח של האקדמיה למרכז ניסויים בבעלי חיים של המכון למרפא פיתוח הצמח (סין).
1. גידול בעלי חיים
- הבית נשים ועכברים גברים ב 25 ° צ' עבור 12 h אור/12 h מחזורים כהים.
- מספקים גישה חופשית למים ולדיאטה סטנדרטית.
- אפשר לעכברים לתקן את הסביבה במשך 7 ימים לפני המבצע אם מועברים ממתקן אחר.
2. כריתת אונוקטומיה בעכברים נשיים
- באמצעות מסכת קונוס פנים (8 שבועות, לא פחות משישה שבועות) עם isofלידה (~ 4-5%) לצורך האינדוקציה, ~ 1 – 2% לתחזוקה) ב-100% חמצן.
- בדקו כי העומק המתאים של האסתזיה הושגה על-ידי ודאו שאין תנועות בהתנדבות למעלה מ-30, בשילוב עם קצב נשימתי מתאים (למשל, נשימה אחת לכל 2 או יותר). לחילופין, בדוק את תגובת העכבר ללחץ עדין על הבהונות של הכפות האחוריות.
הערה: קצב הנשימה הרגיל הוא ~ 180/min. ירידה בתעריף של 50% מקובלת במהלך ההרדמה17.- השתמש משחה אופטלמולוגית כדי למנוע ייבוש הקרנית וטראומה העין בזמן תחת הרדמה.
- לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר על 36 ° c או מעל. לספק תמיכה בחום משלים במהלך תקופת ההרדמה בעת הצורך.
- חטא וחטא את כל כלי הניתוח והמשטחים הקשים של שולחן הניתוחים עם 75% אתנול לפני השימוש.
- הניחו את החיה על העטוף הסטרילי.
- גילוח פרווה בקיעים מעל עמוד השדרה המותני על גב העכבר כדי לחשוף את העור.
- לחטא את העור החשוף עם 75% אתנול.
- הפוך בודד קו אמצע החתך (כ 0.5 ס מ אורך) בגב ממרכז שתי שורשי הירך לכיוון ראש של ~ 1 ס"מ מרחק (מיקום מוצג באיור 1).
- השתמש במספריים קטנים כדי לחדור את העור כדי לשחרר בעדינות את הרקמה התת עורית מן השריר הבסיסי כדי לחשוף את שכבת השריר.
- אתר את השחלה תחת שכבת השריר הדק ולעשות חתך קטן (כ 5 מ"מ אורך) כדי להיכנס לחלל הצפק.
- השתמשו בפינצטה קטנה כדי למשוך את הרקמה מעט בצד שמאל של חלל הבטן כדי להראות את השחלה השמאלית עוטפת את רקמת השומן הלבן (מסה שקופה, לא סדיר כפי שנראה על ידי עין בלתי, ראה איור 1).
- למשוך את משטח שומן השחלות סביב השחלה עם מלקחיים קהה לחשוף את תעלת ההטלה.
- בצע ליגטורה יחידה סביב צינור ההטלה כדי למנוע דימום.
- השתמש במספריים קטנים כדי לנתק בעדינות את צינור ההטלה ולהסיר את השחלה.
- בדוק את תעלת ההטלה בקפידה כדי לוודא שכל רקמות השחלות יוסרו. השחלה היא כ 5 מ"מ × 4 מ"מ × 3 מ"מ עם גושים לא סדיר על פני השטח.
- הניחו את החלק הנותר של תעלת ההטלה בחזרה לחלל הבטן.
- תפר את שכבת השריר עם תפרים נספגים.
- משוך את העור לצד ימין כדי לחשוף את שכבת השריר בצד ימין ולהסיר את השחלה הימנית על ידי שלבים חוזרים 2.9 – 2.16.
- סגרו את חתך העור בעזרת תפרים נספגים.
- להזריק כל intraperitoneally העכבר עם הנתרן פניצילין (10,000 יחידות/10 גרם לכל עכבר) כדי למנוע זיהום.
- הכנס לידוקאין (4 מ"ג/ק"ג, 0.4 mL/ק ג של 1% פתרון) מתחת לעור לאורך האתר של החתך. כמו כן, לספק איבופרופן (50 – 60 מ"ג/ק"ג/יום; 10 מ ל של מומדי ילדים ב 500 mL של מים) ברציפות במים השתייה עבור 3 ימים עבור טיפול בכאב.
- מניחים כל עכבר לתוך כלוב מעוקר בנפרד.
- לשמור תחת השגחה צמודה בערך 1 – 2 עד עד התאושש באופן מלא מן ההרדמה.
- לשחזר חיות על מגבות נייר בכלוב נקי ללא מצעים. שלב זה מפחית את הסיכון של חסימה או דלקת ריאות. לספק תמיכה בחום משלים במהלך התאוששות הרדמה. לעקוב אחר האתר כירורגי כדי למנוע את הקרע של הפצע.
- בעקבות תקופת ההחלמה (כ 24 שעות לאחר הניתוח), מניחים עכברים בחזרה לכלוב הבית שלהם.
- לא לבצע את הניסוי לפחות 2 שבועות לאחר הניתוח.
3. הורמון המושרה ייחום אצל נקבות
- לקבוע את השלב הראותי של הנקבות על ידי ביצוע הכתם הנרתיק כפי שמתואר במקקלין ואח '18. אין שינוי במחזור האסטרוס מעיד על כך שתהליך הניתוח של הנקבה הצליח.
- הכנס בנזואט אסטרדיול (20 μg לכל עכבר, הומס 0.1 mL של שמן זית מעוקר, intraperitoneally) 48 h לפני מבחן התנהגות מינית.
- הכנס פרוגסטרון (500 μg לכל עכבר, מומס 0.1 mL של שמן, intraperitoneally) 4 h לפני מבחן התנהגות מינית.
הערה: הזכאות של נקבה ייחום נקבעת על ידי הנקבה לקבל החדרת איברי המין של העכבר הגברי 3 פעמים או יותר, כאשר הם ההרגל עם גבר פעיל מינית ומנוסה בכלוב אחד.
4. הכנה למבחן ההתנהגות המינית
- ניהול מבחן התנהגות מינית של עכברים זכרים בתיבת שדה מלבני פתוח (40 ס"מ x 40 ס"מ x 40 ס"מ) עם קירות פלקסיגלס שחור, למעט קיר קדמי שקוף המאפשר התבוננות של תנועת העכבר.
- הגדר את התאורה בחדר כללי ל 650 lux.
הערה: העכברים לא צריכים להיות מוארים ישירות כדי למנוע דפוסי התנהגות חריגים. - השתמש במצלמה דיגיטלית המקושרת למחשב כדי להקליט את התנועה ואת אופן הפעולה של העכברים.
- בצע את בדיקת ההתנהגות על העכברים הזכרים בשעות הראשונות של המחזור האפל.
5. הרגלה
- . השאר את חדר הניסוי בשקט
- מניחים את העכברים להיבדק במרכז תיבת השדה הפתוחה, מה שמאפשר להם לחקור את הסביבה בחופשיות 30 דקות.
- עכברים Habituate במשך יומיים רצופים לפני יום הבדיקה במנגנון כדי למנוע לחץ מהסביבה החדשה.
הערה: עכברים צריכים לנוע ולחקור בחופשיות בלי להרגיש מתח. גם עכברים זכרים ונקבות צריכים לנובעת לסביבת הבדיקה.
6. מאמר התנהגותי
- הפעל את המצלמה לפני תחילת הבדיקה.
- למקם את העכבר כדי להיבדק במרכז השדה הפתוח בתיבת הבדיקה, המאפשר חיפושי חינם 5 דקות כדי התאקלם לסביבה.
- מניחים נקבה באסטרוס. לתוך תיבת המבחן
- תעד את התנהגויות החברה וההזדווגות ואת האינטראקציות שבין העכברים לזכר ונקבה במשך 30 דקות.
- כבה את המצלמה וודא שהווידאו נשמר.
- קח את הנקבה מתוך תיבת המבחן ולהקליט את היווצרות תקע הנרתיק.
הערה: עכבר נשי שקיבל הזדווגות לא יכול להיות מועסק במבחן אחר התנהגות מינית ביום אחד. - מניחים את הנקבה בחזרה לכלוב הבית שלה.
- . החזר את הזכר לכלוב הבית שלו
- נקו את השתן, הצואה והריפוד בתוך המנגנון.
- הסר את הריח של העכברים נבדק עם 75% אתנול.
- להתחיל את המבחן של העכבר הגברי הבא על ידי חוזר שלבים 6.1 – 6.10.
7. מיצוי הנתונים ההתנהגותית
- השמע בחזרה את הקלטת הווידאו וחלץ את הפרמטרים ההתנהגותיים (ראה איור 2).
- הקלט את מספר הטעינות בתוך 30 דקות.
- הקלט את מספר האינטסיות בתוך 30 דקות.. לספור את דחף האגן כחוסר החלטיות
- רשום את הזמן ממבוא של הנקבה להרכבה הראשונה כהשהיה מתקנת.
- להקליט את הזמן ממבוא של הנקבה. לחוסר היעילות הראשון בתור השהיה
- הקלט את הזמן מחוסר היעילות הראשון לשפיכה הראשונה כהשהיה בשפיכה.
- הקלט את הזמן משפיכה להרכבה הבאה כהשהיה בטעינה לאחר הפליטה.
- מספר הרשומה של סדרת הרשומות בתוך 30 דקות. סדרה שקותית היא כל רצף מהרכבה לשפיכה.
- הקלט את השעה של כל סדרת הרשומות בתוך 30 דקות כמשך הסדרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השוואה בין התנהגות מינית בין עכברים 1 הגדל בבידוד, שוכנו הקבוצה עכברים-1 מוצג. זכר CD-1 עכברים הוקצו באופן אקראי לתוך קבוצה מוהקת בידוד (הוא, עכבר אחד לכל כלוב, n = 30) ו קבוצה שוכנו קבוצה (GH, חמישה עכברים לכל כלוב, n = 15). העכברים עברו גידול בידוד מיום שלאחר הלידה 23 עד יום 93. אז שתי הקבוצות של העכברים. העריכו על התנהגות מינית המחקר שלנו מצא כי שיעור ההצלחה של הזדווגות נטו להיות נמוך בקבוצה IS מאשר בקבוצת GH (IS: 80.0%, GH: 86.7%), למרות שאין הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בין קבוצות נצפתה (p = 0.458). השהיית ההרכבה היתה ארוכה יותר בקבוצה IS מאשר בקבוצת GH (p = 0.002, איור 3א), המציינת כי הקודם נדרש זמן רב יותר ליזום התנהגות מינית. השהיית intromission היה עוד בקבוצה IS מאשר בקבוצת GH (p = 0.015, איור 3ב), המציינת כי הקודם נדרש זמן רב יותר כדי לבצע את הכנסת הפין לנרתיק של הנקבה. אין הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בין שתי הקבוצות נצפתה במונחים של השהיית פליטה והשהיה לאחר הפליטה. משך הסדרה היה קצר יותר בקבוצת IS מאשר בקבוצת GH (p = 0.002, איור 3ג). לא הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין שתי הקבוצות נצפו במונחים של מספר טעינות, מספר בליטות, ומספר סדרה19 (ראו טבלה 1).
| בידוד-הגדלה | שוכנות קבוצה | t/t | p | |
| N | 30 | 15 | ||
| השהיית השהיה של | 788.70 ± 262.77 | 365.03 ± 288.65 | -3.87 | 0.002 |
| השהיית אי-מטרומייון | 937.30 ± 369.87 | 542.94 ± 352.40 | -2.75 | 0.015 |
| השהיית שפיכה | 16.58 ± 9.78 | 17.37 ± 13.03 | -0.2 | 0.845 |
| השהיית טעינה לאחר פליטה | 173.00 ± 89.84 | 192.87 ± 106.91 | 0.58 | 0.565 |
| משך הסדרה | 88.27 ± 52.40 | 151.65 ± 40.87 | 3.44 | 0.002 |
| מספר טעינות b | 2.4 ± 2.0 | 3.3 ± 3.3 | 1.09 | 0.282 |
| מספר בליטות | 20.1 ± 12.9 | מיכל ה, 36.3 ± 12.3 | 0.58 | 0.564 |
| מספר הסדרות הנקומות | 7.0 ± 4.3 | 9.3 ± 4.6 | 1.55 | 0.131 |
| ממוצע ± SD; יחידה היא שנייה. b היחידה נחשבת. | ||||
שולחן 1: פרמטרים של התנהגות מינית של בידוד ועכברים שוכנו הקבוצה.
איור 1: כריתת אונוקטומיה של עכברים נשיים. מיקום החתך האנכי והשחלה הימנית מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך של התנהגות מינית של עכברים. החץ האדום מציין שהנקבה. והחץ הצהוב מצביעים על הזכר (א) הזכר מרחרח אזורים באברי-המין-אנאלי בתחילת ההתנהגות המינית. (ב) הזכר גובר על הנקבה. (ג) תנוחת האי של הזכר. (ד) שפיכה של הזכר. (ה) הזכר מטפח את אזורי איברי המין לאחר השפיכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מבחן התנהגות מינית. (א) מגרש בתיבה של ההשהיה הגוברת של העכבר IS ו-GH. (ב) מגרש בתיבה של השהיית חוסר היעילות של העכבר IS ו-GH. (ג) משך ההזדווגות הכולל של העכבר IS ו-GH. *p < 0.05, * *p < 0.01. איור זה השתנה מליו ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המוצג. בנוגע לניתוחי הנשים, חתך הניתוח שנפתח מאחור הוא פחות מזיק מהבטן. בהתחשב כי המיקום של השחלה הוא עמוק, מושך איברים אחרים כאשר החתך לחתוך פתוח מן הבטן לעתים קרובות מוביל דימום ותוצאות ראייה כירורגית לא ברורה20. ביצעת את החתך על הגב כדי להגיע לשחלה בקלות ולקצר את הזמן כירורגי, כמו גם כדי להבטיח את הבטיחות של הניתוח.
התחזוקה של תנאים סטריליים במהלך הניתוח חשוב להישרדות. ארבעה משתנים עיקריים נחשבים במהלך הליך כירורגי: המרחב הכירורגי, המכשירים, המנתח והחיה. עבור החלל הכירורגי, כולל סביבות עבודה וחדרי כירורגי, כל המשטחים הנחוצים מנוקים ומחוטאת בחומרי חיטוי מתאימים (למשל, באקונומיקה מדוללת, מוצרי מי חמצן) לפני הניתוח. בנוסף, מומלץ לעבור קיטור עם מיכל חיטוי. במהלך הליך כירורגי, זרימת התנועה מוגבלת בחדר הניתוח. בהליך כירורגי, מכשירים חדשים לעיקור וחומרים יש להשתמש עבור כל חיה. כאשר מכשירים נופלים מחוץ לשדה סטרילי או להיות מזוהם, הם צריכים להיות מוחלפים מיד. בינתיים, לאחר כביסה/קרצוף ידיים וזרועות ביסודיות, מנתחים צריכים לדון את כל הבגדים סטרילי, כולל שמלה סטרילית וכפפות ניתוח סטרילי. אם חומר כלשהו מזוהם, המאמר המושפע צריך להשתנות מיד לפני הניתוח (למשל, שמלה חדשה או כפפה כירורגית). לבסוף, שיער מהאתר כירורגי וסביבתה יש להסיר למניעת זיהום. העור חייב להיות מקורצף עם 75% אתנול לאחר הסרת שיער. מקוצץ חשמלי או קרם להסרת שיער ניתן להשתמש כדי להסיר את השיער. לפני הניתוח מונחת העטוף הסטרילי על בעל החיים המאפשר גישה לאתר הכירורגי למניעת זיהום.
שלושה היבטים של הטיפול לאחר ניתוח של בעלי החיים דורשים תשומת לב: התאוששות הרדמה, כאבים וניטור האתר כירורגי, והסרת תפר. עם סיום ההליך הכירורגי, בעלי החיים חייבים להיות מנוטרים במהלך ההחלמה מההרדמה. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא הגיע לתודעה מספקת כדי לשמור על שכיבה, ואין להחזירו לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהחלים לחלוטין. בנוסף, יש לספק תנאי שחזור מתאימים, כולל סביבה חמימה מחפצים שעלולים לגרום נזק. לדוגמה, מגבות נייר במקום מצעים קלח תירס משמשים התאוששות של עכברים וצעצועים גדולים או קערות מים מוסרים מעטים בעלי חיים גדולים. על פי ההנחיות של אוניברסיטת מינסוטה, כריתת הערמונית של הנקבה גורמת בינוני עד כאב חמור. כך, כאבים חייב להיות מנוהל ישירות לאחר הניתוח על ידי parenteral הזרקה או אוראלי gavage21. במחקר זה, הזרקת לידוקאין מתחת לעור בוצעה לאחר ניתוח ומים המכילים איבופרופן היה מנוהל עבור לפחות 1 – 2 ימים לטיפול בכאב. עם זאת, יש להתייעץ עם וטרינר בפיתוח תוכנית ההרגעה. לבסוף, בריאות אחרי ניתוח של בעל החיים והאתר הכירורגי חייב להיות נצפה ונרשם לפחות 3 ימים. שורת הפעלה או אטבי פצעים משמשים לצורך החתך, שיש להסירו מהעור 7 – 14 ימים לאחר הניתוח21. במחקר זה, קו נספג כדי תפר את החתך כדי למנוע הסרת תפרים שימש.
ייחום של הנקבה היה נשלט באופן מלאכותי עם כריתת הערמונית ושימוש הורמונלי, במקום להשתמש באישה עם ייחום טבעי. צעד זה נלקח כדי להבטיח את העקביות של הקבלה המינית של הנקבה במבחן ולהבטיח את אמינות המידות בעת ניטור התנהגות ההזדווגות הגברית. יתר על כן, הורמון הנגרמת על ידי נקבה ייחום לעשות שימוש חוזר בסדרה של ניסויים, ואת ההשפעה של ההריון נמנעת. Estrus אצל הנקבה הוא המושרה על ידי הזרקת בנזודיט האסטרוקול ו פרוגסטרון לפני הניסוי. שיטה זו קלה לניהול, יש שיעור הצלחה גבוהה, ונקבות ייחום מרובות ניתן להשיג באותו זמן, ובכך לשפר במידה רבה את יעילות הבדיקה.
עכברים מבחינה מינית ומנוסים מראים דפוסי התנהגות שונים. תשומת לב צריכה להיות משולמת למהימנות הבדיקה מחדש של הניסוי בשלבים שונים של התפתחות עכברים. השינוי הדינמי בהתנהגות המינית צריך להיחשב לפני עריכת הבחינה ובשלב התכנון הניסיוני. במחקר זה, גברים תמימים מינית שימשו למבחן התנהגות מינית ורק את ההתרחשות הראשונה של התנהגות מינית נמדד ללא כל הכשרה לפני המבחן. הזדווגות היא התוצאה הסופית של סדרה של הגילוי, הרכבה, חוסר היעילות והפליטה. קיימת הגבלה לפרוטוקול הנסיוני הנוכחי בעת החלתם על עכברים מוטנטים. לדוגמה, עכברים זכרים עם מוטציות ממוקדות של Adcy3, Cnga2, ו-מוצג מופחת היכולת לזהות פרומונים14,15,16, בעוד עכברים Trpc2 הסתרה להראות העדפה שונה השותף22. ייתכן שהפרוטוקול הנוכחי לא יוכל להפגין את התנהגותו המינית של עכברים מוטנטים בשל יכולתה המופחת לזהות פרומונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לו קונג, ג'אנג Hongxia, ג'אנג באייאה, ו-הו מי עבור הצעותיהם לניסויים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
- The staff of the Jackson laboratory. Biology of the Laboratory Mouse. , Second Edition, Dover publications, inc. New York. Chapter 11 (2007).
- Burns-Cusato, M., Scordalakes, E. M., Rissman, E. F. Of mice and missing data: what we know (and need to learn) about male sexual behavior. Physiology & Behavior. 83 (2), 217-232 (2004).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse?. , Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. (2006).
- Whishaw, I. Q., Haun, F., Kolb, B. Analysis of Behavior in Laboratory Rodents. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1999).
- Sachs, B., Barfield, R. Functional Analysis of Masculine Copulatory Behavior in the Rat. 7, (1976).
- Hull, E. M., Dominguez, J. M.
- Mosig, D. W., Dewsbury, D. A. Studies of the copulatory behavior of house mice (Mus musculus). Behavioral Biology. 16 (4), 463-473 (1976).
- Park, J. H. Assessment of Male Sexual Behavior in Mice. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice. Gould, T. 63, Humana Press. (2011).
- Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Frontiers in Neuroendocrinology. 31 (3), 341-358 (2010).
- Levine, L., Barsel, G. E., Diakow, C. A. Mating behaviour of two inbred strains of mice. Animal Behavior. 14 (1), 1-6 (1966).
- McGill, T. E. Sexual Behavior in Three Inbred Strains of Mice. Behaviour. 19 (4), 341 (1962).
- James, P. J., Nyby, J. G. Testosterone rapidly affects the expression of copulatory behavior in house mice (Mus musculus). Physiology & Behavior. 75 (3), 287-294 (2002).
- Arteaga-Silva, M., Rodriguez-Dorantes, M., Baig, S., Morales-Montor, J. Effects of castration and hormone replacement on male sexual behavior and pattern of expression in the brain of sex-steroid receptors in BALB/c AnN mice. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 147 (3), 607-615 (2007).
- Zhang, Z., et al. Deletion of Type 3 Adenylyl Cyclase Perturbs the Postnatal Maturation of Olfactory Sensory Neurons and Olfactory Cilium Ultrastructure in Mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1 (2017).
- Mandiyan, V. S., Coats, J. K., Shah, N. M. Deficits in sexual and aggressive behaviors in Cnga2 mutant mice. Nature Neurosciemce. 8 (12), 1660-1662 (2005).
- Choi, C. I., et al. Simultaneous deletion of floxed genes mediated by CaMKIIalpha-Cre in the brain and in male germ cells: application to conditional and conventional disruption of Goalpha. Experimental & Molecular Medicine. 46, 93 (2014).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments. (59), e3396 (2012).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. Journal of Visualized Experiments. (67), e4389 (2012).
- Liu, Z. W., et al. Postweaning Isolation Rearing Alters the Adult Social, Sexual Preference and Mating Behaviors of Male CD-1 Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 21 (2019).
- TIan, E. P., Long, T., Qin, D. N. Establishment and applications of mating model in male rat. Chinese Journal of Andrology. 22 (1), 7-10 (2008).
- University of Minnesota Academic Health Center Research Service. Anesthesia Guidelines: Mice. , Available from: https://www.researchservices.umn.edu/services-name/research-animal-resources/research-support/guidelines/anesthesia-mice (2019).
- Leypold, B. G., et al. Altered sexual and social behaviors in trp2 mutant mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6376-6381 (2002).
