Summary
In questo articolo viene descritto come eseguire test di comportamento sessuale nei topi maschi.
Abstract
Il comportamento sessuale è altamente specifico della specie. Anche se i roditori hanno comportamenti sessuali leggermente diversi, topi e ratti hanno un modello comportamentale sessuale simile. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere il modello femminile estrus ovariato minoratizzato dall'ormone e la procedura sperimentale per la valutazione del comportamento sessuale dei topi maschi. Gli elementi comportamentali sessuali più importanti sono dimostrati nel video e nelle illustrazioni. I passaggi critici, vantaggi, e limitazioni del test di comportamento sessuale sono spiegati pure. Infine, vengono presentati i parametri di comportamento e si distinguono i processi di montaggio, intromissione ed eiaculazione nell'accoppiamento. I parametri comportamentali vengono valutati in termini di durata e conteggi durante il periodo di test.
Introduction
Il comportamento sessuale nei topi maschi maturi deriva dall'interazione di una serie di sistemi ormonali e sistemi neurali correlati e interdipendenti in circuiti cerebrali diversi1. Richiede anche esperienze di sviluppo, apprendimento, contesto e un partner appropriato. L'analisi comportamentale è una riflessione importante sulla funzione neurale o neurocrina. Quindi, studio sul comportamento sessuale su modelli animali è stato ampiamente utilizzato nelle neuroscienze comportamentali e altre ricerche correlate2. L'etogramma dei comportamenti sessuali nei roditori è stato spiegato in molti articoli e libri1,3,4. Per esempio, Scahs e Barfield descrizione del comportamento sessuale nel ratto5 ha aiutato a capire un modello comportamentale simile nei topi5. Il topo è uno dei soggetti più comunemente utilizzati per gli studi comportamentali. Hull et al.6 ha dato una presentazione dettagliata dei comportamenti sessuali del topo maschio: Quando un topo maschio incontra una femmina, inizia a indagare la regione anogenitale della femmina. Poi, il maschio preme le zampe anteriori contro i fianchi della femmina per montare la femmina dalla parte posteriore. La femmina presenta una caratteristica postura sessualmente ricettiva, piegando la colonna vertebrale verso il basso in un arco e muovendo la coda su un lato del corpo, esponendo un'introito di apertura per la penetrazione sessuale del maschio (cioè, lordosi). Dopo il montaggio, il maschio produce spinte pelviche rapide e poco profonde, seguite da spinte vaginali lente e profonde. Dopo numerose intromissioni, una spinta di lunga durata si traduce nell'eiaculazione dello sperma, durante la quale il topo maschio può congelare per circa 25 s prima di smontare o cadere dalla femmina6. All'eiaculazione le ghiandole accessorie del topo maschio possono produrre una miscela contenente sperma che si indurisce per formare la spina copulatoria. Infine, dopo l'eiaculazione, il maschio inizia la toelettatura genitale e mostra una mancanza di interesse per la femmina. In breve, la sequenza di base del comportamento sessuale maschile consiste nello sniffing, following, montaggio, intromissione, eiaculazione e toelettatura post-eiaculazione. Il comportamento sessuale del topo mostra differenze di tensione. Ad esempio, le latenze di eiaculazione vanno da 594 a 6943 s e il numero di intromissioni varia da 5 a più di 100. Le latenze post-eiaculazione vanno da 17 a 60 min. Tuttavia, l'introduzione di una nuova femmina può diminuire questo intervallo di tempo. In alcuni casi, il maschio eiacula alla prima intromissione con la nuova femmina7.
I principali eventi per la valutazione del comportamento sessuale sono il montaggio, l'intromissione e l'eiaculazione. Gli scienziati comportamentali hanno raccomandato la misurazione non solo della frequenza di ogni azione, ma anche della sua latenza e intervallo di tempo5,8. Alcuni dei principali indicatori di misurazione negli studi precedenti includono: numero di supporti, numero di intromissioni, latenza di montaggio, latenza intromissione, latenza eiaculazione, latenza di montaggio post-eiaculatoria (o intervalli post-eiaculatori), latenza introtoriale post-eiaculatoria, numero di serie copulatorie e durata della serie coaculatoria. Park et al.8 e Sachs et al.5 hanno descritto come identificare ogni azione di montaggio, intromissione ed eiaculazione dei roditori. Il montaggio è definito come il maschio che monta la femmina dalla parte posteriore, palpando i fianchi con le zampe anteriori, e spingendo il pene rapidamente e ripetutamente senza inserimento del pene. L'introduzione, nota anche come inserimento del pene, è identificata da uno o più dei seguenti atti: una spinta lunga e profonda dopo rapide spinte poco profonde, un calcio rapido con una zampa posteriore e un marcato ritiro laterale del maschio dalla femmina. L'eiaculazione è identificata da una spinta pelvica terminale che è più lenta e profonda di quella di un'introduzione e una riduzione dell'elevazione della gamba posteriore. Una serie copulatoria è identificata da ogni sequenza dal montaggio all'eiaculazione. Le definizioni dei parametri comportamentali utilizzati nel presente studio sono elencate come segue: 1) Latenza di montaggio: il tempo dall'introduzione della femmina al primo montaggio del maschio; 2) Latenza di intromissione: il tempo dall'introduzione della femmina alla prima intromissione; 3) Latenza dell'eiaculazione: il tempo dalla prima intromissione alla prima eiaculazione (generalmente dopo l'ultima spinta pelvica); 4) Latenza di montaggio post-eiaculatoria: il tempo dall'eiaculazione al montaggio successivo; 5) Latenza intromissione post-eiculatoria: il tempo dall'eiaculazione e la successiva intromissione; 6) Numero di supporti: il numero di tempi di montaggio prima della prima eiaculazione; 7) Numero di intromissioni: il numero di intromissioni prima della prima eiaculazione; 8) Numero di serie copulatorie: il numero di serie copulatorie durante il periodo di osservazione; 9) Durata delle serie copulatorie: il tempo di tutte le serie copulatorie durante il periodo di osservazione.
Il comportamento sessuale e il comportamento correlato possono essere condotti nella gabbia di casa del maschio o in un'arena chiusa, tra i quali viene introdotto un apparato chiamato "No Secrets" scatola speculare di Rissman per osservare il comportamento diaccoppiamento 3. Una videocamera viene posizionata davanti alla scatola per registrare contemporaneamente l'azione dei topi da una vista laterale e attraverso uno specchio inclinato da una vista ventrale. Tuttavia, questo metodo richiede luci luminose, che inevitabilmente porta ad un'assuefazione più lunga al fine di eliminare lo stress ambientale nei topi. Per quanto riguarda il metodo di misurazione, si raccomanda l'analisi comportamentale basata su video per registrare e quantificare il comportamento4. Un videoregistratore con un'opzione di avanzamento video fotogramma per fotogramma con velocità consigliate per l'otturatore superiori a 1/1000 s può essere utilizzato per registrare i movimenti rapidi del mouse. La fotocamera a infrarossi ad alta risoluzione è necessaria durante la registrazione in un ambiente buio. Per analizzare la pellicola, è necessario un computer con un frame grabber per consentire l'acquisizione dei singoli fotogrammi di comportamento per la manipolazione del computer. I topi sono estremamente versatili e possono mostrare un comportamento compensativo dopo quasi ogni trattamento. Possono esistere ambiguità su ogni parte4del corpo in movimento. Quindi, l'analisi di alcuni comportamenti può richiedere una risoluzione ancora maggiore e autovelox.
I comportamenti sessuali maschili nei topi sono influenzati da molti fattori, tra cui differenze di ceppo, cambiamenti ormonali e mutanti genici1,3,9,10. McGill e Blight11 hanno illustrato le differenze di deformazione nei comportamenti di accoppiamento del topo. Ad esempio, i maschi C57BL/6 in genere acquisiscono intromissione rapidamente ed eiaculare in circa 20 min11. I maschi DBA/2 sono lenti ad ottenere l'intromissione ma eiaculare rapidamente. I maschi BALB/c sono lenti a raggiungere l'eiaculazione (latenza media di 1 h) a causa di un lungo periodo di corteggiamento11. Il testosterone facilita e mantiene il comportamento sessuale maschile2, e cambiamenti nei livelli di testosterone possono alterare le prestazioni di comportamento sessuale12. Sia la castrazione chirurgica e il trattamento antiandrogeno può ridurre il livello di testosterone e provocare un rapido declino dei comportamenti sessuali e anche la motivazione sessuale e l'eccitazione sessuale13. Il testosterone somministrato può ripristinare comportamenti prepulpulatori e copulatori nei topi castrati. Infine, i topi knockout e knockdown mostrano differenze nelle sfaccettature dei comportamenti sessuali rispetto ai topi di tipo selvaggio. Ad esempio, i topi maschi con mutazioni mirate di Adcy3, Cnga2 e Gnao presentano una ridotta capacità di rilevare i feromoni, mentre i topi knockout Trpc2 mostrano alterata preferenza partner14,15,16. Altri effetti della transgenica e knockout sul comportamento sessuale dei topi sono spiegati da Crawley3.
Qui, viene descritta una delle procedure più comuni per valutare il comportamento sessuale nell'accoppiamento di un topo maschio con una femmina ovarictomizzata che è stata ormonalemente innescata per essere ricettiva. Viene presentato un protocollo sperimentale per condurre esperimenti di comportamento sessuale nei topi. Inoltre, viene mostrato un esempio di cambiamento dei modelli di comportamento sessuale derivanti dall'isolamento sociale nei topi CD-1.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati nel rispetto delle linee guida dei Principi di Cura Animale di Laboratorio (Pubblicazione NIH n. 80-23, rivista 1996) e sotto l'approvazione e la supervisione dell'Accademia del Centro Animale Sperimentale dell'Istituto di Medicinale Sviluppo delle piante (Cina).
1. Allevamento di animali
- Casa topi di sesso femminile e maschile a 25 gradi centigradi per cicli scuri 12 h luce/12 h.
- Fornire libero accesso all'acqua e una dieta pelleta standard.
- Lasciare che i topi si acclimatino al loro ambiente per 7 giorni prima dell'operazione se trasportati da un impianto diverso.
2. Ovariectomia nei topi femminili
- Anestesizza la femmina (8 settimane postnatale, non meno di 6 settimane di età) con isoflurano (4-5% per l'induzione, 1-2% per la manutenzione) in ossigeno al 100% tramite una maschera di cono facciale.
- Verificare che la profondità appropriata dell'estesia sia stata raggiunta assicurandosi che non vi siano movimenti volontari per oltre 30 s, in combinazione con una frequenza respiratoria appropriata (ad esempio, 1 respiro per 2 s o più). In alternativa, testare la risposta del mouse a una leggera pressione sulle punta delle zampe posteriori.
NOTA: La normale frequenza respiratoria è di 180 USD/min. Un calo del tasso del 50% è accettabile durante l'anestesia17.- Utilizzare unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale e traumi agli occhi durante l'anestesia.
- Mantenere la temperatura corporea del mouse a o superiore a 36 gradi centigradi. Fornire supporto termico supplementare durante il periodo di anestesia quando necessario.
- Sterilizzare e disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e le superfici dure del tavolo operatorio con il 75% di etanolo prima dell'uso.
- Mettere l'animale su un drappo sterile.
- Rasare la pelliccia bilateralmente sopra la colonna lombare sul retro del mouse per esporre la pelle.
- Sterilizzare la pelle esposta con il 75% di etanolo.
- Fare una singola incisione mediana (circa 0,5 cm di lunghezza) sul retro dal centro delle due radici della coscia verso la testa di 1 cm di distanza (posizione è mostrato nella Figura 1).
- Utilizzare piccole forbici per penetrare la pelle al tessuto sottocutaneo delicatamente libero dal muscolo sottostante al fine di esporre lo strato muscolare.
- Individuare l'ovaio sotto il sottile strato muscolare e fare una piccola incisione (circa 5 mm di lunghezza) per ottenere l'ingresso alla cavità peritoneale.
- Utilizzare piccole pinzette per tirare leggermente il tessuto sul lato sinistro della cavità addominale per mostrare l'avvolgimento dell'ovaio sinistro intorno al tessuto adiposo bianco (una massa irregolare traslucida come visto dall'occhio nudo, vedi Figura 1).
- Ritirare il cuscinetto di grasso ovarico che circonda l'ovaio con pinze smussate per esporre l'ovidotto.
- Eseguire una singola legatura intorno all'oldotto per prevenire il sanguinamento.
- Utilizzare piccole forbici per recidere delicatamente l'ovidotto e rimuovere l'ovaio.
- Controllare attentamente l'ovidotto per confermare che tutti i tessuti ovarici siano stati rimossi. L'ovaio è di circa 5 mm x 4 mm e 3 mm con noduli irregolari sulla superficie.
- Riposizionare la parte restante dell'ovidotto nella cavità addominale.
- Suturare lo strato muscolare con suture assorbibili.
- Tirare la pelle sul lato destro per esporre lo strato muscolare sul lato destro e rimuovere l'ovaio destro ripetendo i passi 2.9–2.16.
- Chiudere l'incisione cutanea utilizzando suture assorbibili.
- Iniettare ogni topo intraperitonealmente con sodio di penicillina (10.000 unità / 10 g per mouse) per prevenire l'infezione.
- Iniettare lidocaina (4 mg/kg, 0,4 mL/kg di una soluzione dell'1%)) sotto la pelle lungo il sito dell'incisione. Fornire anche ibuprofene (50-60 mg/kg/giorno; 10 mL di Motrin per bambini in 500 mL di acqua) continuamente in acqua potabile per 3 giorni per il trattamento del dolore.
- Posizionare ogni topo in una gabbia sterilizzata singolarmente.
- Tenere sotto stretta osservazione per circa 1-2 h fino a quando completamente recuperato dall'anestesia.
- Recuperare gli animali su asciugamani di carta in una gabbia pulita senza biancheria da letto. Questo passaggio riduce al minimo il rischio di ostruzione tracheale o polmonite. Fornire supporto termico supplementare durante il recupero anestetico. Monitorare il sito chirurgico per prevenire la rottura della ferita.
- Dopo il periodo di recupero (circa 24 h dopo l'intervento chirurgico), riporre i topi nella loro gabbia di casa.
- Non eseguire l'esperimento per almeno 2 settimane dopo l'intervento chirurgico.
3. Estrus ormonale indotto nelle femmine
- Determinare lo stadio estrous delle femmine eseguendo uno striscio vaginale come descritto in McLean et al.18. Nessun cambiamento di ciclo estrus indica che l'ovariectomia della femmina ha avuto successo.
- Iniettare benzoato estradiol (20 g per topo, disciolto in 0,1 mL di olio d'oliva sterilizzato, intraperitonealmente) 48 h prima del test del comportamento sessuale.
- Iniettare il progesterone (500 g per topo, sciolto in 0,1 mL di olio, intraperitamente) 4 h prima del test del comportamento sessuale.
NOTA: L'ammissibilità di una femmina erusiè è determinata dall'inserimento genitale di un topo maschio 3 o più volte, quando convivono con un maschio sessualmente attivo ed esperto in una gabbia.
4. Preparazione per il test del comportamento sessuale
- Condurre il test di comportamento sessuale dei topi maschi in una scatola di campo rettangolare e aperta (40 cm x 40 cm x 40 cm) con pareti in plexiglass nero, ad eccezione di una parete anteriore trasparente che consente l'osservazione del movimento del mouse.
- Impostare l'illuminazione generale della stanza a 650 lux.
NOTA: i topi non devono essere illuminati direttamente per evitare comportamenti anomali. - Utilizzare una fotocamera digitale collegata a un computer per registrare il movimento e il comportamento dei mouse.
- Eseguire il test comportamentale sui topi maschi durante le prime ore del ciclo scuro.
5. L'abitudine
- Tieni la stanza degli esperimenti tranquilla.
- Posizionare i topi da testare al centro della scatola di campo aperta, permettendo loro di esplorare l'ambiente liberamente per 30 min.
- Topi abituati per 2 giorni consecutivi prima della giornata di prova nell'apparecchio per evitare stress dal nuovo ambiente.
NOTA: I topi dovrebbero muoversi ed esplorare liberamente senza sentire stress. Sia i topi maschi che quelli femminili devono essere abituati all'ambiente di test.
6. Saggi comportamentali
- Accendere la fotocamera prima dell'inizio del test.
- Posizionare il mouse da testare al centro del campo aperto nella scatola di prova, consentendo l'esplorazione gratuita per 5 min per acclimatarsi all'ambiente.
- Inserire una femmina in estrus nella scatola di prova.
- Registrare i comportamenti sociali e di accoppiamento e le interazioni tra i topi maschi e femmine per 30 min.
- Spegnere la fotocamera e verificare che il video sia stato salvato.
- Estrarre la femmina dalla scatola di prova e registrare la formazione di un tappo vaginale.
NOTA: Un topo femmina che ha accettato l'accoppiamento non può essere impiegato in un altro test di comportamento sessuale in un giorno. - Riportare la femmina nella sua gabbia di casa.
- Riporta il maschio alla sua gabbia di casa.
- Pulire l'urina, le feci e l'imbottitura all'interno dell'apparecchio.
- Rimuovere l'odore dei topi testati con 75% di etanolo.
- Avviare il test del topo maschio successivo ripetendo i passaggi da 6.1 a 6,10.
7. Estrazione dei dati comportamentali
- Riprodurre la registrazione video ed estrarre i parametri comportamentali (vedere Figura 2).
- Registrare il numero di supporti in 30 min.
- Registrare il numero di intromissioni in 30 min. Conte una spinta pelvica come intromissione.
- Registrare il tempo dall'introduzione della femmina al primo montaggio come latenza di montaggio.
- Registrare il tempo dall'introduzione della femmina alla prima introduzione come latenza di intromissione.
- Registrare il tempo dalla prima intromissione alla prima eiaculazione come latenza di eiaculazione.
- Registrare il tempo dall'eiaculazione al montaggio successivo come latenza di montaggio post-eiaculatoria.
- Numero record di serie copulatorie in 30 min. Una serie copulatoria è ogni sequenza dal montaggio all'eiaculazione.
- Registra il tempo di tutte le serie copulatorie in 30 min come la durata della serie copulatoria.
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Representative Results
Viene mostrato un confronto del comportamento sessuale tra topi CD-1 allevati in isolamento e topi CD-1 ospitati in gruppo. I topi maschi CD-1 sono stati assegnati in modo casuale in un gruppo allevato in isolamento (IS, un topo per gabbia, n - 30) e un gruppo di gruppo (GH, cinque topi per gabbia, n - 15). I topi sono stati sottoposti ad allevare in isolamento dal giorno postnatale 23 al giorno 93. Quindi, entrambi i gruppi di topi sono stati valutati per il comportamento sessuale. Il nostro studio ha rilevato che il tasso di successo della copula tendeva ad essere più basso nel gruppo IS rispetto al gruppo GH (IS: 80.0%, GH: 86,7%), anche se non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa tra i gruppi (p - 0,458). La latenza di montaggio era più lunga nel gruppo IS che nel gruppo GH (p - 0,002, Figura 3A), indicando che il primo richiedeva più tempo per avviare il comportamento sessuale. La latenza di intromissione era più lunga nel gruppo IS che nel gruppo GH (p - 0.015, Figura 3B), indicando che il primo richiedeva più tempo per eseguire l'inserimento del pene nella vagina della femmina. Nessuna differenza statisticamente significativa tra i due gruppi è stata osservata in termini di latenza di eiaculazione e latenza di montaggio post-eiculatoria. La durata della serie copulatoria è stata più breve nel gruppo IS rispetto al gruppo GH (p - 0,002, Figura 3C). Non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i due gruppi in termini di numero di supporti, numero di intromissioni e numero di serie copulatorie19 (cfr. tabella 1).
| Allevato in isolamento | Alloggiato in gruppo | t/t' | P | |
| N | 30 | 15 | ||
| Latenza di montaggio | 788,70 x 262,77 | 365,03 - 288,65 | -3.87 | 0.002 |
| Latenza intromissione | 937,30 x 369,87 | 542,94 x 352,40 | -2.75 | 0.015 |
| Latenza eiaculazione | 16,58 x 9,78 | 17,37 - 13,03 | -0.2 | 0.845 |
| Latenza di montaggio post-eiculatoria | 173,00 : 89,84 | 192,87 - 106,91 | 0.58 | 0.565 |
| Durata della serie copulatoria | 88.27 : 52,40 | 151,65 : 40,87 | 3.44 | 0.002 |
| Numero di supporti b | 2,4 x 2,0 | 3,3-3,3 | 1.09 | 0.282 |
| Numero di intromissioni | 20,1%12,9 | 22,6-12,3 | 0.58 | 0.564 |
| Numero di serie copulatorie | ORE 0,0,4,3 | 9,3,4,6 | 1.55 | 0.131 |
| Media : SD; un'unità è seconda(s). b unità è conteggi. | ||||
Tabella 1: Parametri comportamentali sessuali dei topi allevati in isolamento e ospitati in gruppo.
Figura 1: Ovariectomia di topi femminili. Vengono visualizzate la posizione dell'incisione verticale e l'ovaia destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo di comportamento sessuale dei topi. La freccia rossa indica la femmina e la freccia gialla indica il maschio. (A) Lo sniffing da parte del maschio delle aree anali-genitali all'inizio del comportamento sessuale. (B) Il maschio che monta la femmina. (C) La postura di intromissione del maschio. (D) L'eiaculazione del maschio. (E) Il maschio governando le aree genitali dopo l'eiaculazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati del test del comportamento sessuale. (A) Trama a scatola della latenza di montaggio dei topi IS e GH. (B) Grafico box della latenza di intromissione dei topi IS e GH. (C) La durata totale dell'accoppiamento dei topi IS e GH. :p < 0,05, p< 0,01. Questa cifra è stata modificata da Liu etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo presentato. Per quanto riguarda l'ovariectomia delle femmine, l'apertura dell'incisione chirurgica dalla schiena è meno dannosa di quella dell'addome. Dato che la posizione dell'ovaio è profonda, tirando altri organi quando l'incisione viene tagliata dall'addome spesso porta a sanguinamento e si traduce in visione chirurgica poco chiara20. Abbiamo eseguito l'incisione sulla schiena per raggiungere facilmente l'ovaio e accorciare il tempo chirurgico, nonché per garantire la sicurezza dell'intervento chirurgico.
Il mantenimento di condizioni sterili durante l'intervento chirurgico è importante per la sopravvivenza. Quattro variabili principali sono considerate durante una procedura chirurgica: lo spazio chirurgico, gli strumenti, il chirurgo e l'animale. Per lo spazio chirurgico, compresi gli spazi di lavoro e le sale chirurgiche, tutte le superfici necessarie vengono pulite e disinfettate con disinfettanti appropriati (ad esempio, candeggina diluita, prodotti perossido di idrogeno) prima dell'intervento. Inoltre, si consiglia vapore pressurizzato con un'autoclave. Durante una procedura chirurgica, il flusso di traffico è limitato nella sala chirurgica. In una procedura chirurgica, gli strumenti e i materiali di nuova sterilizzazione devono essere utilizzati per ogni animale. Quando gli strumenti cadono al di fuori del campo sterile o vengono contaminati, devono essere immediatamente sostituiti. Nel frattempo, dopo aver lavato / strofinato le mani e le braccia accuratamente, i chirurghi devono indossare tutto l'abbigliamento sterile, tra cui un abito sterile e guanti chirurgici sterili. Se un materiale è contaminato, l'articolo interessato deve essere modificato immediatamente prima dell'intervento chirurgico (ad esempio, nuovo abito o guanto chirurgico). Infine, i capelli dal sito chirurgico e dall'area circostante devono essere rimossi per la prevenzione della contaminazione. La pelle deve essere strofinata con 75% di etanolo dopo la depilazione. Clipper elettrici o crema depilatoria possono essere utilizzati per rimuovere i capelli. Prima dell'intervento chirurgico, un drappo sterile viene posto sopra l'animale permettendo l'accesso al sito chirurgico per la prevenzione della contaminazione.
Tre aspetti del trattamento post-chirurgico degli animali richiedono attenzione: recupero anestetico, analgesia e monitoraggio del sito chirurgico, e rimozione della sutura. Al termine della procedura chirurgica, gli animali devono essere monitorati durante il recupero dall'anestesia. L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha recuperato sufficiente coscienza per mantenere la recumbenza severa e non deve essere restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Inoltre, devono essere fornite adeguate condizioni di recupero, tra cui un ambiente caldo privo di oggetti che potrebbero causare danni. Ad esempio, gli asciugamani di carta invece della biancheria da letto di pannocchia vengono utilizzati nel recupero dei topi e i giocattoli di grandi dimensioni o le ciotole d'acqua vengono rimossi dalle grandi penne per animali. Secondo le linee guida dell'Università del Minnesota, l'ovariectomia della femmina provoca dolore da moderato a grave. Pertanto, l'analgesia deve essere somministrata direttamente post-operatoria mediante iniezione parenterale o gavage orale21. In questo studio, un'iniezione di lidocaina sotto la pelle è stata eseguita dopo l'intervento chirurgico e l'acqua contenente ibuprofene è stata somministrata per almeno 1-2 giorni per il trattamento del dolore. Tuttavia, un veterinario deve essere consultato nello sviluppo del piano analgesico. Infine, la salute post-chirurgica dell'animale e il sito chirurgico devono essere osservati e registrati per un minimo di 3 giorni. Una linea operativa o rotture della ferita vengono utilizzati per suturare l'incisione, che dovrebbe essere rimosso dalla pelle 7–14 giorni dopo l'intervento chirurgico21. In questo studio, è stata utilizzata una linea assorbibile per suturare l'incisione per evitare la rimozione della sutura.
L'estro della femmina è stato controllato artificialmente con l'ovariectomia e l'uso di ormoni, invece di usare una femmina con estrus naturale. Questo passo è stato fatto per garantire la coerenza della ricettività sessuale della femmina nel test e garantire l'affidabilità delle misurazioni durante il monitoraggio del comportamento di accoppiamento maschile. Inoltre, la femmina estrus indotta dall'ormone può essere riutilizzata in una serie di esperimenti e l'influenza della gravidanza è prevenuta. Estrus nella femmina è indotta dall'iniezione di benzoato estradiol e progesterone prima dell'esperimento. Questo metodo è facile da gestire, ha un alto tasso di successo, e più femmine estrus possono essere ottenuti allo stesso tempo, migliorando così notevolmente l'efficienza del test.
Topi sessualmente ingenui ed esperti mostrano diversi modelli di comportamento. Occorre prestare attenzione all'affidabilità di prova-retest dell'esperimento in varie fasi dello sviluppo dei topi. Il cambiamento dinamico nel comportamento sessuale deve essere considerato prima di condurre il test e nella fase di progettazione sperimentale. In questo studio, i maschi sessualmente ingenui sono stati utilizzati per il test del comportamento sessuale e solo la prima occorrenza di comportamento sessuale è stata misurata senza alcun allenamento prima del test. La copulazione è il risultato finale di una serie di rilevamento, montaggio, intromissione ed eiaculazione dei feromoni. C'è una limitazione all'attuale protocollo sperimentale quando applicato ai topi mutanti. Ad esempio, i topi maschi con mutazioni mirate di Adcy3, Cnga2 e Gnao presentano una ridotta capacità di rilevare feromoni14,15,16, mentre i topi knockout Trpc2 mostrano una preferenza del partner modificata22. Il protocollo attuale potrebbe non essere in grado di esibire il comportamento sessuale dei topi mutanti a causa della sua ridotta capacità di rilevare feromoni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Lu Cong, shang Hongxia, e Hu Mi per i loro suggerimenti per gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
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- Burns-Cusato, M., Scordalakes, E. M., Rissman, E. F. Of mice and missing data: what we know (and need to learn) about male sexual behavior. Physiology & Behavior. 83 (2), 217-232 (2004).
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