Summary
この記事では、雄のマウスで性的行動テストを実行する方法について説明します。
Abstract
性的行動は種に特有の高いものです。げっ歯類は性的行動がわずかに異なりますが、マウスとラットは同様の性的行動パターンを持っています。この記事の目的は、ホルモン誘発性のエロスオバリーク化雌モデルと雄マウスの性行動評価のための実験的手順を説明することです。最も重要な性的行動要素は、ビデオとイラストで示されています。性的行動テストの重要なステップ、利点、および制限についても説明します。最後に、挙動パラメータが提示され、嵌合における取り付け、イントロミッション、射精プロセスが区別されます。動作パラメータは、テスト期間中に発生した期間とカウントの観点から評価されます。
Introduction
成熟した雄マウスにおける性的行動は、異なる脳回路における一連の関連および相互依存性ホルモン系および神経系の相互作用から生じる1.また、開発経験、学習、コンテキスト、適切なパートナーも必要です。行動分析は神経または神経分泌機能に関する重要な反映である。したがって、動物モデルに関する性行動研究は、行動神経科学および他の関連研究2において広く使用されている。げっ歯類の性的行動のエチオグラムは、多くの記事や本1、3、4で説明されています。例えば、ScahsとBarfieldのラット5における性的行動の記述は、マウス5の同様の行動パターンを理解するのに役立ちました。マウスは行動研究で最も一般的に使用される対象の1つである。Hullら 6は、男性のマウスの性的行動の詳細な導入を与えた:男性のマウスが女性に遭遇すると、それは女性の無先天性領域を調査し始める。その後、男性は前足を女性の脇腹に押し付けて、後ろからメスを取り付ける。女性は特徴的な性的受容姿勢を示し、背骨を弓に曲げ、尾を体の片側に移動させ、男性の性的浸透(すなわち、ロルドシス)の開口部を露呈する。取り付けに続いて、男性は急速で浅い骨盤推力を作り、続いてゆっくりと深い膣推力を行う。多数のイントロミッションの後、長持ちする推力は精液の射精をもたらし、その間にオスのマウスはメス6を降ろしたり脱落したりする前に約25分間凍結する可能性がある。射精時にオスマウスの付属腺は、交付プラグを形成するために硬化する精液を含む混合物を生成し得る。最後に、射精後、男性は生殖器のグルーミングを開始し、女性への関心の欠如を表示します。簡単に言えば、男性の性的行動の基本的なシーケンスは、スニッフィング、続く、取り付け、内挿、射精、射精後のグルーミングで構成されています。マウスの性的行動は、緊張の違いを示す。たとえば、射精の遅延は 594 ~ 6943 秒で、イントロミッションの数は 5 ~ 100 を超えます。射精後の遅延は17〜60分の範囲です。しかし、新しい女性の導入は、この時間間隔を減少させることができます。いくつかのケースでは、男性は新しい女性7との最初の内挿で射精します。
性的行動の評価のための主要なイベントは、マウント、イントロミッション、および射精です。行動科学者は、各アクションの頻度だけでなく、その待ち時間と時間間隔5、8の測定を推奨しています。過去の研究におけるいくつかの主要な測定指標には、マウント数、イントロミッション数、マウント遅延、イントロミッション遅延、射精遅延、射精後のマウント遅延(または射精後間隔)、射精後のイントロミッション遅延、交付系列の数、および交付シリーズの持続時間が含まれます。Park et al.8および Sachs ら5では、げっ歯類の取り付け、内挿、射精の各作用を特定する方法について説明しました。取り付けは、男性が後部から女性を取り付け、前足で彼女の脇腹を触らせ、陰茎を挿入することなくペニスを迅速かつ繰り返し突き刺す男性と定義されます。陰茎挿入とも呼ばれる内挿は、急速な浅い推力の後の長く深い推力、1つの後ろ足を持つ急速なキック、および女性からの男性の顕著な横引きの行為の1つ以上によって識別される。射精は、内挿および後脚の標高の減少よりも遅く、深い末端骨盤推力によって識別される。交付シリーズは、取り付けから射精までの各シーケンスによって識別されます。本研究で使用される行動パラメータの定義は次のようにリストされています: 1)取り付け遅延:女性の導入から男性の最初の取り付けまでの時間;2)イントロミッション遅延:女性の導入から最初のイントロミッションまでの時間。3)射精遅延:最初の射精までの時間(一般的に最後の骨盤推力に従う);4)射精後のマウント遅延:射精から次のマウントまでの時間。5)射精後の開始の遅延:射精からの時間と次の開始6)マウント数:最初の射精前の取り付け回数。7)イントロミッションの数:最初の射精前のイントロミッションの数。8)交番数:観測期間中の交番シリーズの数;9)交点系列の持続時間:観察期間中のすべての交付シリーズの時間。
性的行動および関連行動は、男性の自宅のケージまたは囲まれたアリーナのいずれかで行うことができるが、その中でリスマンの「秘密なし」ミラーボックスと呼ばれる装置が交配行動3を観察するために導入される。ビデオカメラは、横のビューから、腹側のビューから傾斜した鏡を介して同時にマウスのアクションを記録するためにボックスの前に配置されます。しかし、この方法は、必然的にマウスの環境ストレスを排除するために、より長い習慣につながる明るい光を必要とします。測定方法については、ビデオベースの行動分析を行い、動作を記録し、定量化することをお勧めします。1/1000 s より大きい推奨シャッター速度を持つフレームごとのビデオアドバンスオプションを持つビデオレコーダーは、急速なマウスの動きを記録するために使用することができます。暗い環境で録画する場合は、高解像度の赤外線カメラが必要です。フィルムを分析するには、コンピュータ操作のために個々の動作フレームをキャプチャできるようにフレームグラバーを備えたコンピュータが必要です。マウスは非常に汎用性が高く、ほぼすべての治療後に補償行動を示すことができます。すべての動く身体部分4についてあいまいさが存在する可能性があります。したがって、いくつかの動作の分析は、さらに高い解像度と高速カメラを必要とするかもしれません。
マウスにおける男性の性的行動は、株の違い、ホルモンの変化、遺伝子変異1、3、9、10を含む多くの要因の影響を受ける。マギルとBlight11は、マウス交配動作における歪みの違いを示した。例えば、C57BL/6の男性は、通常、迅速に内挿を得て、約20分11で射精します。DBA/2の男性は、内挿を得るために遅いですが、急速に射精.BALB/cの男性は、長い求愛期間11のために射精(平均遅延1時間)を達成するのが遅い。テストステロンは、男性の性的行動を促進し、維持します 2, テストステロンのレベルの変化は、性的行動のパフォーマンスを変更することができます12.外科的去勢と抗アンドロゲン治療の両方がテストステロンのレベルを低下させ、性的行動の急速な低下、さらには性的動機と性的覚醒を生じることができる。投与されたテストステロンは去勢されたマウスの前和および交付行動を回復できる。最後に、ノックアウトマウスとノックダウンマウスは、野生のタイプのマウスと比較して性的行動の面の違いを表示します。例えば、Adcy3、Cnga2、およびGnaoの標的変異を有する雄マウスはフェロモンを検出する能力を低下させ、一方、Trpc2ノックアウトマウスは変化したパートナーの好み14、15、16を示す。マウスの性的行動に対するトランスジェニックおよびノックアウトの他の効果は、クローリー3によって説明される。
ここでは、ホルモン的に受容的にプライミングされた卵巣化された女性との雄マウスのペアリングにおける性的行動を評価する最も一般的な手順の1つが記載されている。マウスで性的行動実験を行うための実験的なプロトコルが提示される。また、CD-1マウスにおける社会的孤立に起因する性行動パターンを変化させる例を示す。
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Protocol
すべての実験は、実験動物の治療の原則のガイドラインに従って行われました (NIH出版第80-23号、改訂 1996) 薬用研究所実験動物センターの承認と監督の下で工場開発(中国)
1. 畜産
- 25°Cで雌マウスと雄マウスを12時間光/12時間暗いサイクルで収容する。
- 水と標準的なペレットダイエットへの無料アクセスを提供します。
- 別の施設から搬送された場合、操作前に7日間、マウスを環境に順応させます。
2. 雌マウスにおける卵巣切り分け
- イゾフルラン(誘導の場合は〜4-5%、メンテナンスの場合は〜1-2%)で女性(出生後8週間、6週以上)をフェイスコーンマスクで100%酸素で麻酔します。
- 適切な呼吸数(例えば、2秒あたり1呼吸以上)と組み合わせて、30秒以上の自発的な動きがないことを確認することによって、適切な麻酔の深さが達成されたことを確認してください。あるいは、後足のつま先に対する穏やかな圧力に対するマウスの反応をテストします。
注:正常呼吸数は~180/分です。50%の低下率は麻酔中に許容される17.- 麻酔下で角膜乾燥や眼外傷を防ぐために眼科軟膏を使用してください。
- マウスの体温を36°C以上に保ちます。必要に応じて麻酔期間中の補足熱サポートを提供します。
- 手術台のすべての手術器具と硬い表面を75%エタノールで使用前に殺菌し、消毒します。
- 動物を無菌ドレープに置きます。
- マウスの後ろの腰椎の上に毛皮を両側で剃り、皮膚を露出させます。
- 75%エタノールで露出した皮膚を殺菌する。
- 2つの太ももの根の中心から〜1cmの距離の頭に向かって背部に単一の正中線切開(長さ約0.5cm)を作る(位置は図1に示す)。
- 小さいはさみを使用して皮膚を貫通し、筋肉層を露出させるために根底の筋肉から皮下組織を穏やかに解放する。
- 細い筋肉層の下に卵巣を見つけ、腹腔への入り口を得るために小さな切開(長さ約5mm)を作ります。
- 小さなピンセットを使用して腹腔の左側の組織をわずかに引っ張って、白い脂肪組織の周りに折り返す左側の卵巣を示す(半透明で、肉眼で見た不規則な塊、図1参照)。
- 卵巣を取り巻く卵巣脂肪パッドを鈍い鉗子で引き込み、卵性を露出させる。
- 出血を防ぐために、卵管の周りに単一の合字を行います。
- 小さいはさみを使って卵管を優しく切断し、卵巣を取り除きます。
- すべての卵巣組織が除去されていることを確認するために、卵管を注意深くチェックしてください。卵巣は表面に不規則な結節を有する約5mm×4mm×3mmである。
- 卵管の残りの部分を腹腔に戻します。
- 吸収性縫合糸で筋肉層を縫合する。
- 右側に皮膚を引っ張って右側の筋肉層を露出させ、ステップ2.9~2.16を繰り返して右卵巣を取り除きます。
- 吸収性縫合糸を使用して皮膚切開を閉じます。
- 感染を防ぐために、ペニシリンナトリウム(10,000単位/10g)を各マウスの腹腔内に注入する。
- 皮膚の下にリドカイン(4mg/kg、1%溶液の0.4 mL/kg)を注入します。また、イブプロフェン(50〜60mg/kg/日;500mLの水で子供のモトリンの10 mL)を3日間連続的に飲料水中に提供して痛みの治療を行います。
- 各マウスを滅菌ケージに個別に入れます。
- 麻酔から完全に回復するまで、約1〜2時間の注意深い観察の下に置いてください。
- 寝具なしできれいなケージのペーパータオルで動物を回復します。このステップは気管閉塞または肺炎の危険を最小にする。麻酔回復時に補足熱サポートを提供します。外科的部位を監視して、創傷の破裂を防ぎます。
- 回復期間(手術後約24時間)に続いて、マウスを自宅のケージに戻します。
- 手術後少なくとも2週間は実験を行わない。
3. 女性のホルモン誘導性のエロス
- マクリーンら18.に記載されているように膣の塗り傷を行うことにより、女性のエストラスステージを決定する。全く気循環変化は、女性の卵巣切除術が成功したことを示す。
- エストラジオールベンゾエート(マウスあたり20μg、0.1 mLの滅菌オリーブオイル、腹腔内)に48時間前に性的行動試験を注入する。
- プロゲステロン(マウスあたり500μg、0.1 mLの油、腹腔内に溶解)を性的行動試験の4時間前に注入する。
注:エストラスメスの適格性は、男性のマウスの性器挿入を受け入れる女性によって決定されます 3 回以上, 彼らは1つのケージに性的に活発で経験豊富な男性と同居するとき.
4. 性行為テストの準備
- マウスの動きを観察できる透明な前壁を除いて、黒いプレキシガラスの壁を持つ長方形とオープンフィールドボックス(40 cm x 40 cm x 40 cm)で雄のマウスの性的行動テストを行います。
- 一般の部屋の照明を650ルクスに設定します。
注: 異常な動作パターンを避けるために、マウスを直接照射しないでください。 - コンピュータにリンクされたデジタルカメラを使用して、マウスの動きと動作をビデオテープで撮影します。
- 暗いサイクルの最初の時間の間に雄マウスの行動テストを行います。
5. 習慣化
- 実験室は静かにしてください。
- 開いたフィールドボックスの中央にマウスを置き、30分間自由に環境を探索できるようにします。
- 新しい環境からのストレスを防ぐために、試験日の前に2日間連続してマウスを習慣化します。
注:マウスはストレスを感じることなく自由に移動し、探索する必要があります。オスマウスと雌マウスの両方が試験環境に慣れている必要があります。
6. 行動アッセイ
- テストの開始前にカメラの電源を入れます。
- テストボックスのオープンフィールドの中央にマウスを置き、5分間の無料探査を環境に順応させます。
- メスをエストラスに入れ、テストボックスに入れます。
- 社会的および交配行動と雄マウスと雌マウスの相互作用を30分間記録する。
- カメラの電源を切り、ビデオが保存されていることを確認します。
- テストボックスから女性を取り出し、膣プラグの形成を記録します。
注:交配を受け入れたメスのマウスは、1日で別の性的行動テストで採用することはできません。 - メスを自宅のケージに戻します。
- 男性を自宅のケージに戻します。
- 尿、便、および装置内のパディングをきれいにします。
- 75%エタノールで試験したマウスの臭いを取り除く。
- ステップ 6.1 ~ 6.10 を繰り返して、次のオスマウスのテストを開始します。
7. 行動データの抽出
- ビデオ録画を再生し、動作パラメータを抽出します (図 2を参照)。
- 30分でマウント数を記録します。
- 30分でイントロミッションの数を記録し、骨盤推力をイントロミッションとしてカウントします。
- 女性の導入から最初のマウントまでの時間を、取り付け遅延時間として記録します。
- 女性の導入から最初のイントロミッションまでの時間を、イントロミッション遅延として記録します。
- 最初のイントロミッションから最初の射精までの時間を射精の待ち時間として記録します。
- 射精から次のマウントまでの時間を射精後のマウント遅延として記録します。
- 30分での交番シリーズの記録数。交付シリーズは、取り付けから射精までの各シーケンスです。
- 交付シリーズの持続時間として30分ですべての交付シリーズの時間を記録します。
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Representative Results
分離して飼育されたCD-1マウスとグループ収容CD-1マウスの性行動の比較が示される。雄のCD-1マウスは、隔離飼育群(IS、ケージあたり1匹のマウス、n=30)およびグループ収容群(GH、ケージあたり5匹のマウス、n=15)に無作為に割り当てられた。マウスは出生後23日目から93日目まで隔離飼育を受けた。次いで、両方の群のマウスが性的行動について評価された。我々の研究では、交尾の成功率はGH群よりもIS群で低い傾向があることがわかった(IS:80.0%、GH:86.7%)が、グループ間に統計的に有意な差は認められなかった(p = 0.458)。取り付け遅延は、GH群(p = 0.002、図3A)よりもISグループで長く、前者が性的行動を開始するのにより多くの時間を必要とすることを示している。内解遅延は、GH群(p = 0.015、図3B)よりもIS群において長く、前者が女性の膣にペニスを挿入するのに長い時間を必要とすることを示す。射精遅延と射精後のマウント遅延の点では、2つのグループの間に統計的に有意な差は認められなかった。交付系列の持続時間は、GH群よりもIS群において短かった(p= 0.002、図3C)。2つの群の間に統計的に有意な差は、マウント数、イントロミッション数、および交番系列19の数の点で認められなかった(表1参照)。
| 分離飼育 | グループ収容 | t/t' | P | |
| N | 30 | 15 | ||
| レイテンシの取り付け | 788.70 ± 262.77 | 365.03 ± 288.65 | -3.87 | 0.002 |
| イントロミッションの遅延 | 937.30 ± 369.87 | 542.94 ± 352.40 | -2.75 | 0.015 |
| 射精の待ち時間 | 16.58 ± 9.78 | 17.37 ± 13.03 | -0.2 | 0.845 |
| 射精後のマウント遅延 | 173.00 ± 89.84 | 192.87 ± 106.91 | 0.58 | 0.565 |
| 交付シリーズの期間 | 88.27 ± 52.40 | 151.65 ± 40.87 | 3.44 | 0.002 |
| マウント数 b | 2.4±2.0 | 3.3±3.3 | 1.09 | 0.282 |
| イントロミッションの数 | 20.1±12.9 | 22.6±12.3 | 0.58 | 0.564 |
| 交番シリーズの数 | 7.0±4.3 | 9.3±4.6 | 1.55 | 0.131 |
| 平均 ± SD;単位は秒(複数可)です。b単位はカウントされます。 | ||||
表1:分離飼育マウスおよびグループ収容マウスの性的行動パラメータ
図1:雌マウスの卵巣切り欠け垂直切開および右卵巣の位置を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの性的行動の過程赤い矢印は女性を示し、黄色の矢印は男性を示します。(A) 男性が性的行動の開始時に肛門性器領域を嗅ぎ分ける。(B) 女性を取り付ける男性。(C)男性のイントロミッション姿勢。(D) 男性の射精。(E) 男性は射精後に生殖器領域をグルーミングする。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:性的行動テストの結果(A)ISマウスおよびGHマウスの取り付け遅延のボックスプロット。(B) ISマウス及びGHマウスのイントロミッション遅延の箱ひげ図(C) ISマウスとGHマウスの交配期間の合計。*p < 0.05, **p < 0.01.この図は、劉ら19.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示されたプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。女性の卵巣切除術に関しては、後ろから開く手術切開は腹部からの切開よりも有害ではない。卵巣の位置が深いことを考えると、切開部が腹部から切り開かれたときに他の器官を引っ張ることはしばしば出血を引き起こし、不明確な外科的視力20をもたらす。背中の切開を行い、簡単に卵巣に到達し、手術時間を短縮し、手術の安全性を確保しました。
手術中の無菌状態の維持は生存のために重要である。手術中の4つの主な変数が考慮されます:外科手術の間に:外科スペース、器械、外科医および動物。ワークスペースおよび外科室を含む外科空間のために、すべての必要な表面は外科手術の前に適切な消毒剤(例えば、希薄化された漂白剤、過酸化水素製品)によって浄化され、消毒される。さらに、オートクレーブ付きの加圧蒸気が推奨されます。外科的処置の間、交通の流れは外科室で限られる。外科的処置では、新たに殺菌された器具および材料はすべての動物のために使用されるべきである。器具が無菌フィールドの外に落ちたり、汚染された場合、それらはすぐに交換されるべきです。一方、手と腕を徹底的に洗浄/スクラブした後、外科医は無菌ガウンと無菌外科用手袋を含むすべての無菌服装を着用する必要があります。いずれかの材料が汚染されている場合、影響を受ける物品は、手術の直前に変更する必要があります(例えば、新しいガウンや外科用手袋)。最後に、汚染を予防するために、外科部位および周囲の毛を除去すべきである。皮膚は脱毛後75%エタノールで洗浄する必要があります。電気バリカンや脱毛クリームは、髪を除去するために使用することができます。手術前に、動物の上に無菌ドレープを置き、汚染を予防するための外科用部位へのアクセスを可能にする。
動物の手術後治療の3つの側面:麻酔薬の回復、鎮痛および外科的部位モニタリング、縫合糸除去。手術の完了時に、動物は麻酔からの回復中に監視されなければならない。動物は、胸部の不全を維持するのに十分な意識を取り戻すまで放置してはならないし、完全に回復するまで他の動物の会社に戻してはならない。さらに、危害を及ぼす可能性のあるオブジェクトのない暖かい環境を含む、適切な回復条件を提供する必要があります。例えば、トウモロコシのコブ寝具の代わりにペーパータオルがマウスの回収に使用され、大きなおもちゃや水鉢が大きな動物のペンから取り除かれます。ミネソタ大学のガイドラインによると、女性の卵巣切り分けは中等度から重度の痛みを引き起こす。したがって、鎮痛は、非経口注射または経口ギャベージ21によって術後に直接投与されなければならない。本研究では、皮膚下のリドカイン注射を手術後に行い、イブプロフェンを含む水を痛みの治療のために少なくとも1〜2日間投与した。しかし、獣医は鎮痛計画の開発に相談する必要があります。最後に、動物の手術後の健康と手術部位を観察し、最低3日間記録する必要があります。手術ラインまたは創傷クリップは、手術21の7〜14日後に皮膚から取り除くべき切開を縫合するために使用されます。本研究では、縫合糸除去を避けるために切開を縫合する吸収性ラインを用いた。
女性のエストラスは、自然のエストラスを持つ女性を使用する代わりに、卵巣切除術とホルモンの使用で人工的に制御されました。このステップは、テストにおける女性の性的受容性の一貫性を確保し、男性の交配行動を監視する際の測定値の信頼性を保証するために行われた。さらに、ホルモン誘発性のエロスメスを一連の実験で再利用することができ、妊娠の影響を防ぎます。雌のエストラスは、実験の前にエストラジオールベンゾアートとプロゲステロンを注入することによって誘導される。この方法は管理が容易で、高い成功率を有し、かつ複数の発情雌が同時に得られ、したがって、試験の効率を大幅に向上させることができる。
性的にナイーブで経験豊富なマウスは、異なる行動パターンを示します。マウスの開発のさまざまな段階で実験のテスト再テスト信頼性に注意を払う必要があります。性的行動の動的変化は、試験を実施する前と実験設計段階で考慮する必要があります。この研究では、性的にナイーブな男性が性的行動検査に使用され、性的行動の最初の発生のみがテスト前の訓練なしで測定された。交尾は、フェロモン検出、取り付け、イントロミッション、射精のシリーズの最終結果です。変異マウスに適用する場合には、本実験プロトコルに制限がある。例えば、Adcy3、Cnga2、およびGnaoの標的変異を有する雄マウスは、フェロモン14、15、16を検出する能力を低下させ、一方、Trpc2ノックアウトマウスは変化したパートナーの好みを示す22を示す。本プロトコルはフェロモンを検出する能力が低下するため、変異マウスの性的挙動を示すことができない場合がある。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
Lu Cong、張紅夏、張北越、胡美の実験の提案に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Choral hydrate | Sinopharm Chenmical Reagent Co., Ltd. | 20160225 | |
| Coated VICRYL Plus Sutures | Ethicon, Inc. | missing | |
| Estradiol benzoate | J&K Scientific, Ltd. | L930Q170 | |
| Ethanol absolute | Beijing Chemical Works Co., Ltd. | 20160715 | |
| Ibuprofen (Children's Motrin) | Shanghai Johnson & Johnson Co., Ltd. | 160629478 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | 217180501 | |
| Lidocaine | HebeI Tiancheng Pharmacreutical Co., Ltd. | 1170506107 | |
| Male and female CD-1 mice | Vital River Beijing | SCXK( )2013-0023 |
|
| Olive oil | |||
| Penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd. | F5126420 | |
| Progesterone | J&K Scientific, Ltd. | LR50Q07 | |
| Sony digital camera | Sony Corporation | HDR-CX290E | |
| Test box | DIY | ||
| ThinkStation Computer | Lenovo | S/N PCOGLQKG | |
| Vaporizer for Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd. | E05904-009M |
References
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