Summary
الغرض من هذه الدراسة هو إنشاء والتحقق من صحة نموذج الحيوانية للبحوث في مراحل الانتعاش والعواقب من نقص التروية في الدماغ عن طريق اختبار احتشاء الدماغ والوظيفة الحسية الحركية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط/ضخ (MCAO/R) بعد 1-90 أيام في الفئران.
Abstract
وكان الغرض من هذه الدراسة لإنشاء والتحقق من صحة نموذج نقص ترويه الدماغ الحيوانية في مراحل الانتعاش والعواقب. تم اختيار نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط/الضخ (MCAO/R) في الفئران الذكور سبرايج-داولي. عن طريق تغيير وزن الفئران (260 − 330 ز) ، ونوع الخيط الترباس (2636/2838/3040/3043) والدماغ احتشاء الوقت (2-3 ح) ، وارتفاع درجه لونغا ، وحجم احتشاء أكبر ونسبه نجاح أكبر نموذج تم فرزها باستخدام النتيجة لونغا وتلطيخ عقاري. تم الحصول علي حاله النموذج الأمثل (300 g ، 3040 الترباس الموضوع ، 3 ح الدماغ احتشاء الوقت) واستخدامها في فتره المراقبة اليوم 1-90 بعد ضخ عن طريق تقييم وظائف حسي وحجم احتشاء. وفي ظل هذه الظروف ، كان لاختبار عدم التماثل الثنائي فارق كبير من 1 إلى 90 يوما ، وكان لاختبار الشبكة والمشي فارق كبير من 1 إلى 60 يوما ؛ يمكن ان يكون كل من الاختلافات اختبار الوظيفية حسي مناسبه. وهكذا ، تم العثور علي الشرط الأكثر ملاءمة لنموذج الفئران رواية في مراحل الانتعاش والعواقب من نقص التروية في الدماغ: 300 g الفئران التي خضعت MCAO مع الترباس 3040 الموضوع ل 3 ح احتشاء الدماغ ومن ثم reperfused مستخدمه. وكانت الاختبارات الوظيفية الحسية المناسبة اختبارا ثنائيا لعدم التماثل واختبارا لشبكه المشي.
Introduction
وينقسم نقص التروية الدماغية إلى ثلاث مراحل مع مؤشرات مختلفه بعد السكتة الدماغية: المرحلة الحاده (في غضون أسبوع واحد) ، ومرحله الانتعاش (1 أسبوع إلى 6 أشهر) ، ومرحله العواقب (أكثر من 6 أشهر). في الوقت الحاضر ، تركز معظم الدراسات علي المرحلة الحاده من نقص التروية الدماغية بسبب تاثيره الكبير والنماذج البحثية متعددة النسبية1،2،3. ومع ذلك ، لا يمكن تجاهل مراحل الانتعاش والعواقب من نقص التروية الدماغية بسبب مضاعفاتها طويلة الأجل من الإعاقات. ولذلك ، فان الغرض من هذه الدراسة هو استكشاف نموذج الحيوانية مستقره وموثوق بها وبسيطه نسبيا للبحث في الانتعاش ومراحل عواقب نقص التروية في الدماغ.
من بين العديد من نماذج نقص ترويه الدماغ التجريبية ، ونحن نستخدم انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) عن طريق الادراج الترباس الموضوع في الشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA). هذا النموذج يشبه السكتة الدماغية البشرية ، والتي يمكن ان تنتج كميات أكبر احتشاء ، والنتيجة في العديد من الاضطرابات السلوكية المتعلقة السكتة الدماغية ، ويمكن ان تسمح ضخ الدم (ص) عن طريق أزاله الترباس الموضوع4،5،6. ويعتبر MCAO/R أيضا نموذج الذهب معيار الحيوانية من نقص التروية الدماغ7. وعلاوة علي ذلك ، فان شده أصابه الدماغ يعتمد علي القطر وطول الادراج من الترباس الموضوع ، ومده نقص التروية في الدماغ ، ووزن الحيوانية (أكبر الفئران لديها أدمغه أكبر والاوعيه الدماغية أكثر سمكا)8. ولذلك ، عن طريق تغيير نوع الترباس الموضوع ، والوقت احتشاء ، ووزن الفئران ، ويمكن الاطلاع علي نموذج مناسب للانتعاش ومراحل عواقب نقص التروية الدماغية في الفئران MCAO/R. للتحقق من صحة نموذج الفئران ، قمنا باجراء دراسة لمده يوم واحد ، 35 يوم ، و 60 يوم ، و 90 يوما لنموذج MCAO/R باستخدام الاختبارات الخاصة بالوظائف الحسية والحركية (اختبار التباين الثنائي ، وفحص شبكه المشي ، واختبار الروتارود ، واختبار حبل الرفع).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق المعهد الوطني للصحة علي إجراءات واستخدام المواد الحيوانية لرعاية واستخدام الماشية المختبرية. يتم تعديل هذا البروتوكول علي وجه التحديد لاختبارات انسداد الشريان الدماغي الأوسط/ضخ (MCAO/R) والوظيفة الحسية الحركية.
1-التصميم التجريبي والتجميع
- استخدام الفئران MCAO/R نموذج لشاشه الفئران الدماغ طريقه نموذج الدماغية مع إصابات الدماغ أكثر حده ونسبه نجاح أكبر نموذج باستخدام نقاط لونغا وتلطيخ عقاري.
- اجراء التجربة علي الذكور Sprague-Dawley الفئران وزنها 260 − 330 ز التي هي من 7 − 9 أسابيع من العمر. وزن الفئران الحقيقي هو 275 ± 15 ز ل275 ز ، 300 ± 10 ز ل300 ز ، و 320 ± 10 ز ل 320 ز.
- استخدام المجموعات السبع التالية (الوزن ، والخيط نوع الترباس ، احتشاء الوقت): المجموعة 1 مع 15 الفئران (275 غ ، 2636 ، 2 ح) ؛ المجموعة 2 مع 15 الفئران (275 غ ، 2636 ، 3 ح) ؛ مجموعه 3 مع 15 فيران (275 [غ], 2838, 2 [ه]); مجموعه 4 مع 15 فيران (275 [غ], 2838, 3 [ه]); مجموعه 5 مع 13 فيران (300 [غ], 3040, 3 [ه]); مجموعه 6 مع 10 فيران (320 [غ], 3040, 3 [ه]); مجموعه 7 مع 13 الفئران (300 غ ، 3043 ، 3 ح).
- دراسة حاله استرداد الدماغ من قبل التلطيخ العقاري ، واستخدام الاختبارات الوظيفية الحسية المناسبة للاشاره إلى العجز طويل الأمد في الوظائف من خلال اختبار عدم التماثل الثنائي ، اختبار الشبكة والمشي ، اختبار الروتارود ورفع اختبار الحبل بعد 1 ، 35 ، 60 ، 90 يوما من MCAO/R.
- استخدام الذكور Sprague-Dawley الفئران وزنها 300 ± 10 ز التي هي 8 − 9 أسابيع من العمر.
- استخدام المجموعات الخمسة التالية: عنصر تحكم (عادي) مع 20 الفئران; 1 يوم مجموعه مع 16 فيران; [ا] 35 يوم مجموعه مع 16 فيران; [ا] 60 يوم مجموعه مع 17 فيران; ومجموعه اليوم 90 مع 19 الفئران.
- بعد النتيجة لونغا في الخطوة 1.1 أو الاختبارات الوظيفية حسي في الخطوة 1.2 ، تخدير وقطع راس جميع الفئران لتلطيخ عقاري.
2-إنشاء نموذج أحادي الجانب من طراز MCAO/R في الجرذان9
ملاحظه: اثناء العملية ، استخدم الملقط المجهري برفق لمنع كسر الاوعيه الدموية. تجنب الاضرار التي لحقت الأعصاب والاوعيه الدموية الأخرى في عنق الجرذ عندما يتم عزل السفينة. يجب توخي الحذر لتقديم تقنيه العقيم المناسبة لجميع العمليات الجراحية البقاء علي قيد الحياة. التقنية الموضحة لاحقا في الفيديو يجب ان تمارس من خلال الاجراء بأكمله.
- في جميع انحاء الجراحة ، والحفاظ علي درجه حرارة الجسم من الفئران في 37.0 ± 0.5 درجه مئوية في ترموستات الحيوانية الصغيرة. اعداد أربعه 6 سم 5-0 الغرز.
- تعيين معدل تدفق الأكسجين من اله التخدير الحيوانية الصغيرة (مع جهاز معالجه الغاز النفايات) في 0.4 − 0.6 L/min وتركيز ايزوفلونان ليكون 5 ٪. ضع الجرذ في اله التخدير.
- بعد ان أغمي علي الحيوانية ، وضع الفئران علي طاوله الإصلاح الجراحية. قم بتوصيل فم الجرذ بقناع اله التخدير (يبقي معدل تدفق الأكسجين دون تغيير ؛ اضبط تركيز ايزوفلونان علي 3%). تاكد من ان الحيوانية قد دخلت التخدير العميق من خلال مراقبه عدم وجود توتر اقصي ، وردود الفعل القرنية ، والم.
- إصلاح أطرافه للكذب علي طاوله التشغيل مع ضمادات الورق (أو أدوات أخرى).
- أزاله معطف الرقبة مع اله حلاقه كهربائيه وتعقيم مع 75 ٪ الكحول (اليود هو أفضل). أصلح فم الجرذ بخطاف
- قطع 2 − 3 سم علي طول الشكل الطولي المركزي للرقبة مع مقص العيون.
- افصل الشريان السباتي المشترك. فصل العضلات تحت الجلد مع ملقط العيون. استخدام الجرارات محليه الصنع للكشف تماما عن مجال الرؤية. بعد فصل العضلة الاماميه للقصبة الهوائية مع ملقط العيون ، منفصلة علي طول الوتر الأيمن للانسداد الرئوي حتى يصبح الشريان السباتي الشائع مرئيا.
- عزل الشريان السباتي المشترك ، الشريان السباتي الخارجي والشريان السباتي الداخلي مع ملقط العيون. Ligate الشريان السباتي المشترك (عقده الصلبة) ، الشريان السباتي الخارجي بعيدا عن نهاية القلب (عقده الصلبة) ، والشريان السباتي الداخلي (عقده فضفاضة) مع الغرز 5-0. خط الشريان السباتي الخارجي بالقرب من نهاية القلب مع الغرز 5-0.
- ادراج الترباس مؤشر ترابط. قطع فتحه صغيره في الشريان السباتي الخارجي باستخدام مقص العيون وادراج بلطف الترباس الموضوع. Ligate خياطه الشريان السباتي الخارجي الذي كان في عقده فضفاضة وقطع الشريان السباتي الخارجي.
- فك عقده فضفاضة من الشريان السباتي الداخلي والاستمرار في إدخال الترباس الموضوع إلى بداية الشريان الدماغي الأوسط (خياطه ملحوظ). ثم قطع الترباس الموضوع المكشوفة.
- بعد الوصول إلى الوقت الدماغي (2-3 h) ، إصلاح كسر الشريان السباتي الخارجي مع ملقط واحد ، وسحب بلطف من الترباس الموضوع مع ميكروملقط آخر. عندما يتم سحب الطرف الامامي من الترباس الموضوع تماما من الشريان السباتي الداخلي ، نربط الشريان السباتي الخارجي الذي اصطف مع الغرز 5-0 ، ومن ثم سحب الترباس الموضوع تماما.
- تخفيف الشريان السباتي المشترك ، و جص ~ 50,000 U من مسحوق الصوديوم البنسلين علي سطح الجرح لمنع العدوى. خياطه العضلات تحت الجلد والبشرة مع 4 الغرز.
- إعطاء ~ 0.2 مل من المحلول الملحي المعقم إلى الفئران عن طريق الفم باستخدام حقنه 1 مل (SQ-القلم الحقن هو أفضل) لمنع نقص المياه بعد الجراحة بعد وضع الفئران مره أخرى إلى القفص.
- اختيار الحيوانية بعد 24 ساعة من ضخه وفقا لنقاط لونغا10. حدد الحيوانية مع درجه لونغا من 1 − 3 لتلطيخ عقاري المقبل في الخطوة 1.1 ، والحيوانية مع درجه لونغا من 2 − 3 نقاط لل 1 ، 35 ، 60 ، 90 أيام الدراسة في الخطوة 1.2.
ملاحظه: النتيجة لونغا10: 0 النتيجة ، لا العجز العصبي ؛ 1 درجه ، وعدم تمديد المخلب الأيسر ؛ 2 درجه ، وتدور علي اليسار ؛ 3 نقاط ، والسقوط إلى اليسار ؛ 4 درجه ، لا يمكن ان يمشي تلقائيا ولديه وعي الاكتئاب. - تحليل نقاط لونغا بواسطة ANOVA في اتجاه واحد. القيم المعروضة تمثل يعني ± ذاكره P < 0.05 تشير إلى الفرق.
3. الصبغ العقاري
ملاحظه: يجب ان يكون العفن شريحة الدماغ الفئران وشفره قبل تبريده في-20 درجه مئوية الثلاجة قبل استخدامها لمنع التصاق الناجمة عن اختلاف درجه الحرارة الكبيرة. اثناء تلطيخ ، ومنع التصاق بين شرائح الدماغ ولوحه الثقافة ، والتي يمكن ان تؤدي إلى تلطيخ غير كافيه.
- تخدير الفئران بواسطة حقن داخل الصفاق من 400 ملغم/كغ من هيدرات الكلورال بعد النتيجة لونغا في الخطوة 1.1 أو الاختبارات الوظيفية حسي في الخطوة 1.2.
- قطع راس الجرذ مع مقص الجراحية أو مع جهاز قطع راس الفئران. أزاله الدماغ مع مقص الجراحية وملقط الأرقاء.
- وضع الدماغ في الثلاجة في-20 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لتسهيل تشريح.
- أزاله الدماغ من الثلاجة ووضعه في مرحله ما قبل تبريد الفئران شريحة الدماغ العفن. اقطع الدماغ إلى سته أجزاء متتالية بسماكة 2 مم مع شفره مبرده مسبقا.
- وصمه عار المقاطع مع 2 ٪ 5-تريف# ينيل-2H-تيتراازولييوم كلوريد (عقاري) في لوحه ثقافة 6-حسنا.
- ثقافة الأقسام ل 30 − 60 [مين] في 37 [ك] في يهز سرير. الوجه المقاطع كل 10 دقيقه حتى منطقه نقص التروية في الدماغ والمنطقة العادية من الواضح الأبيض والأحمر.
- خط شرائح الدماغ عموديا في النظام من الخلف إلى الامام من الدماغ. استخدم مسطره للتاكد من ان الطول الإجمالي لكل سطر هو نفسه. التقاط الصور مع الكاميرا الرقمية.
- حللت الحجم احتشاء.
- ما قبل المعالجة الصورة مع برنامج فوتوشوب
- استيراد الصورة باستخدام فوتوشوب CS6. 00:00-00:14
- انقر فوق تحديد لتحديد شرائح الدماغ ، انقر فوق تحديد | معكوس. 00:15-00:36
- انقر فوق المقدمة لتحديد اسود ثم انقر فوق موافق. 00:37-00:42
- اضغط علي Alt + Delete لتعبئة لون الخلفية و CTRL + D للغاء التحديد. 00:43-00:46
- انقر فوق ملف | حفظ إلى سطح المكتب. 00:47-01:08
- المعالجة المسبقة للصورة مع برنامج صوره Pro Plus.
- فتح صوره برو زائد 6.0 البرمجيات واستيراد الصورة. 01:09-01:24
- لتعديل العيب ، اضبط السطوع باستخدام أداه تحسين التباين ، بحيث تكون الخلفية سوداء. 01:25-01:37
- استخدم أداه الوسيط في عامل التصفية لأزاله التمييزات. 01:38-01:46
- حساب اليسار (العادي) منطقه الدماغ مع برنامج صوره برو بلس
- حدد اللون باستخدام التجزئة وضبط قيمه H/S/I، بحيث يتم فصل شرائح الدماغ من الخلفية السوداء. 01:47-02:12
- العودة إلى العد | الحجم. 02:13-02:16
- انقر علي الكونت | تقسيم الكائنات في التحرير لفصل الدماغ عن الخط الأوسط. سوف يميز البرنامج تلقائيا مناطق الدماغ اليمني واليسرى. 02:17-02:49
- حساب منطقه الدماغ احتشاء الحق مع صوره برو بلس البرمجيات
- تنفيذ الخطوة 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- اختر العدد | الحجم. 03:15-03:21
- انقر علي رسم | دمج أداه الكائنات في تحرير. حدد منطقه نقص التروية يدويا وانقر فوق Count لحساب منطقه نقص التروية. 03:16-05:31
- حساب منطقه الدماغ الصحية مع برنامج صوره برو بلس
- تنفيذ الخطوة 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- حدد اللون باستخدام التجزئة وضبط قيمه H/S/I، بحيث يتم فصل الجزء العادي من شرائح الدماغ من الخلفية السوداء. 06:45-07:10
- العودة إلى العد | حجم وانقر علي العد لحساب هذه المنطقة. 07:11-07:21
- انقر علي تقسيم الكائنات في تحرير لفصل الدماغ من الخط الأوسط. سوف يميز البرنامج تلقائيا مناطق الدماغ اليمني واليسرى. 07:22-08:08
- ما قبل المعالجة الصورة مع برنامج فوتوشوب
- حساب حجم الاحتشاء (٪) واحتشاء ويتقلص حجم (٪):
احتشاء حجم (٪) = [الحق احتشاء المنطقة/(2 × منطقه الدماغ الأيسر)] x 100.
احتشاء ويتقلص حجم (٪) = [(منطقه الدماغ اليسرى-حق منطقه الدماغ الصحة)/(2 × منطقه الدماغ الأيسر)] x 100.
ملاحظه: الدماغ الأيمن هو الجزء المصاب. تم تحليل البيانات بواسطة ANOVA في اتجاه واحد. القيم المعروضة تمثل يعني ± ذاكره P < 0.05 تشير إلى الفرق.
4. تقييم الوظيفة الحسية الحركية
ملاحظه: تم اختيار الفئران (300 g ، 3040 الترباس الموضوع ، 3 ح الدماغ احتشاء الوقت) مع درجه لونغا من 2 − 3 لأداء التجارب الدالة حسي من 1-90 يوما. الحفاظ علي الهدوء وعدم إزعاج الماشية خلال هذه الفترة من الدراسة. تم تحليل البيانات بواسطة ANOVA ثنائيه الاتجاه. القيم المعروضة تمثل يعني ± ذاكره P < 0.05 تشير إلى الفرق.
- اختبار عدم التماثل الثنائي11
- التفاف الشريط الورق (5 سم طويلة ، 0.8 سم علي نطاق واسع) علي جزء الصافن من كل مخلب من الفئران ثلاث مرات مع الضغط علي قدم المساواة.
- بالنسبة لكل جرذ ، سجل عدد المرات التي يتم فيها الاتصال بكل مخلب وأزاله الشريط في 5 دقائق مع الكاميرا ، بما في ذلك مرات مخلب تتاثر وأوقات مخلب المتضررة.
- بعد 30 دقيقه ، كرر الخطوات 4-1-1 و 4.1.2 مره أخرى.
- حساب متوسط قيمه التحيز الحسي الحركي (٪):
التحيز sensorimotor (٪) = (غير متاثر مخلب مرات-المتضررة مرات مخلب)/(لم تتاثر مخلب مرات + المتضررة مخلب مرات) × 100
- الشبكة--اختبار المشي
- وضع الفئران في وسط منصة سطح شبكه مرتفعه (المنطقة: 1 م2؛ الارتفاع: 90 سم) مع فتحات الشبكة من 2.5 سم2.
- دفع الوركين الفئران بخفه لتشجيع الفئران لاجتياز سطح الشبكة.
- تسجيل عدد من أخطاء القدم التي ادلي بها غير متاثر (اليمين) والمتضررة (اليسار) الأطراف وعدد الخطوة الإجمالي في 1 دقيقه مع الكاميرا.
- حساب أوقات الخطا:
مرات الخطا (%) = [غير متاثر (يمين) أطراف الطرف المصابة (يسار)/العدد الإجمالي للخطوة x 100.
ملاحظه: تمت أزاله إجمالي عدد الخطوات أدناه بيانات 20 خطوه.
- Rotarod اختبار12،13
- اعداد الفئران الدورية شريط جهاز التعب (قطر 90 مم) من الفئران باستخدام برنامج دعم لسرعه 13 دوره في الدقيقة علي مدي 5 دقيقه علي الكمبيوتر.
- بدء تشغيل برامج الكمبيوتر ووضع الفئران علي درجات rotarod في نفس الوقت.
- إنهاء المحاكمة إذا كان الجرذ يسقط قباله درجه أو يبقي المشي لمده 5 دقائق وتسجيل الوقت الدورية.
- وقد بقية الفئران لمده 30 دقيقه.
- كرر الخطوات 4.3.2 − 4.3.4 مرتين واختر الحد الأقصى للقيمة ليكون آخر وقت للدوران.
- رفع اختبار حبل14
- وضع أداه حبل رفع (70 سم ارتفاع; الحبل هو 0.2 سم في القطر و 40 سم طويلة) علي المكتب.
- يكون الجرذ قبضه الحبل مع الأطراف الاماميه وشنق الجرذ.
- تسجيل وقت شنقا وحساب الدرجات.
ملاحظه: درجه من 3:0 − 2 ق علي الحبل; وهناك درجه من 2:3 − 4 ق علي الحبل. درجه من 1:5 − 6 ثانيه علي الحبل; وهناك نقاط من 0: أكثر من 7 ق علي الحبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الاجراء المذكور أعلاه لنموذج MCAO/R مع نقاط لونغا وتلطيخ عقاري, علاجات مختلفه من متوسط الوزن (275/300/320 ز), أنواع الترباس (2636/2838/3040/3043; الجدول 1) والأوقات الدماغية (2-3 h) واستخدمت ضخ يوم 1 لشاشه لنموذج نقص التروية الدماغ الأمثل في الفئران. وكانت المعلمات نموذج من 300 g الوزن ، 3040 الموضوع الترباس ، و 3 ساعة الدماغ احتشاء الوقت الأكثر ملاءمة لأكبر احتشاء دماغي ، اعلي درجه لونغا ونسبه نجاح أكبر نموذج. وقد تحسن هذا بشكل ملحوظ علي العلاج التقليدي من 275 g الوزن ، 2636 الموضوع الترباس ، و 2 ح الدماغ الوقت احتشاء (الشكل 1).
وعلاوة علي ذلك ، الفئران مع 300 g الوزن ، 3040 الصفحات الترباس ، 3 ح الدماغ احتشاء الوقت و 2 − 3 وقد خضعت درجه لونغا الاختبارات الحسية الحركية (اختبار عدم تناسق ثنائي ، اختبار شبكه المشي ، واختبار rotarod ، واختبار حبل رفع) وتلطيخ عقاري لدراسة الانتعاش حاله نقص التروية الدماغية من 1-90 أيام. كان الاحتشاء ويتقلص حجم 23.4%, 19.6%, 16.1% ([ب] < 0.01, يقارن مع اليوم اولي) و 15.7% ([ ب] < 0.01 , يقارن مع اليوم اولي) بعد 1, 35, 60, و 90 أيام آخر [مسكو/ر], علي التوالي (شكل 2). في اليوم الأول بعد MCAO/R ، وكان حجم احتشاء أكبر. في وقت, الاحتشاء أصبح حجم صغيره والانكماش حجم أصبح كبيره. الاحتشاء ويتقلص حجم [نو لونجر] يغير بعد 60 أيام من [مجو/ر].
التحيز الحسي الحركي في اختبار عدم التماثل الثنائي ، مرات خطا الشبكة-المشي في اختبار الشبكة والمشي ورفع درجه حبل في اختبار حبل رفع كل زيادة كبيره ، في حين ان الوقت rotarod في اختبار rotarod انخفض بشكل ملحوظ بعد 1 يوم من MCAO/R (الشكل 3) ، الذي أشار إلى ان جميع الاختبارات الاربعه كانت ذات مغزى في مرحله نقص التروية الدماغية الحاده. ومع ذلك ، التحيز الحسي الحركي الوحيد الحفاظ علي اضطرابات وظيفية كبيره مع طريقه تعتمد علي الوقت بعد 35 ، 60 و 90 يوما من MCAO/R. كانت هناك اختلافات كبيره في أوقات الخطا الشبكة المشي في اختبار الشبكة المشي بعد 35 و 60 يوما من MCAO/R. وأشارت هذه النتائج إلى ان اختبار عدم التماثل الثنائي واختبار المشي علي الشبكة يمكن ان يكونا اختبارين مناسبين للدالة الحسية الحركية لمرحله التعافي والعواقب في الجرذان.
الرقم 1:300 g الوزن ، 3040 الموضوع الترباس ، 3 ح الدماغ الوقت احتشاء قد يكون الشرط الأمثل للاصابه الدماغية الدماغية الناجمة عن MCAO/R. (الف ، باء) صور و [كارغرم] من احتشاء حجم من دماغ نسيج ([ن] = 9 − 12). (ج) نتيجة لونغا (ن = 9 − 12). (د) إحصاءات نسبه النجاح النموذجية للفئران (ن = 10 − 15). نموذج نسبه النجاح = (العدد الإجمالي للفئران الفئران الموت بعد MCAO/R-الفئران الفشل بعد MCAO/R)/العدد الإجمالي للفئران. الفئران الفشل هي الفئران النموذجية التي لم يكن لديك درجه لونغا مناسبه. تمثل أشرطه الخطا ذاكره ، *p < 0.05 ، * *p < 0.01. وقد عدل هذا الرقم من ليو وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: انخفاض حجم الاحتشاء وتقلص تدريجيا من 1 إلى 90 يوما بعد MCAO/R. (ا) تلطيخ الانسجه الدماغية للفئران. (ب) الرسم الكاريكاتوري الخاص بالاحتشاء وتقليص الحجم (ن = 16 − 19). تمثل أشرطه الخطا ذاكره ، * *P < 0.01 مقابل اليوم الأول بعد mcao/R. وقد عدل هذا الرقم من ليو وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختبار عدم التماثل الثنائي واختبار الشبكة والمشي كانت الاختبارات المناسبة للدالة الحسية الحركية في مرحله التعافي والمراحل من نقص ترويه الدماغ. (ا) الطرف الأيمن الذي يمزق القدرة علي المحاباة في تجربه الفصل. (B) مرات خطا الشبكة المشي في اختبار الشبكة المشي. (ج) طول الفترة الزمنيه في اختبار الروتارود. (د) النتيجة في رفع اختبار الحبل. تمثل أشرطه الخطا ذاكره ، n = 15 − 19 ، *p < 0.05 ، * * *p < 0.001. وقد عدل هذا الرقم من ليو وآخرون15. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| نوع | قطر الترباس الموضوع | قطر راس الخيط الترباس | الوزن الموصي به من الفئران | مستوي |
| 2636 | 0.26 مم | 0.36 مم | 250-280 غ | A4 |
| 2838 | 0.28 مم | 0.38 مم | 280-350 غ | A4 |
| 3040 | 0.30 مم | 0.40 مم | 360-400 غ | A4 |
| 3043 | 0.30 مم | 0.43 مم | > 400 غ | A4 |
| ملاحظه: الترباس مؤشر الترابط مستوي A4 هو المعيار ان نهاية الراس هو نصف كرويه ، وتغطي الطرف الامامي مع بولي يسين ، ملحوظ ، تعقيمها ، وشراء علي الاستخدام دون اي علاج (تم تعديل هذا الجدول من ليو وآخرون ، 2018). | ||||
الجدول 1: المعلومات وصمه عار الموضوع. وقد تم تعديل هذا الجدول من ليو وآخرون15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العديد من النماذج وضع الأساليب والمؤشرات السلوكية التي تستخدم بشكل جيد في نقص التروية الدماغية الحاده قد لا يكون لها تغييرات كبيره في مراحل الانتعاش والعواقب من نقص التروية الدماغية16,17. ومع ذلك ، فان عدد المرضي الذين يعانون من نقص ترويه الدماغ في مراحل الانتعاش والعواقب هو أعظم. من الضروري اختيار نموذج الحيوانية مناسبه للتعافي ومراحل السكتة الدماغية من نقص التروية.
نحن نستخدم نموذج MCAO/R في الفئران لفحص الوزن المناسب من الفئران (260 − 330 ز) ، ونوع من الترباس الموضوع (2636/2838/3040/3043) ، ووقت احتشاء الدماغ (2-3 ح) للاصابه احتشاء الأكثر شده ، وارتفاع نسبه النجاح نموذج ، والمؤشرات السلوكية مرئية ، والتي سوف تكون مناسبه للتعافي ومراحل العواقب من نقص التروية في الدماغ.
الفئران التي تزن 300 g مع الترباس 3040 الموضوع و 3 ح الدماغ احتشاء الوقت لديها كميات أكبر احتشاء, العيوب السلوكية أكثر شده, ونسبه نجاح أكبر نموذج (الشكل 1). وعلاوة علي ذلك ، قدمنا أساليب التحقق من هذا النموذج الفئران بواسطة التلطيخ والاختبارات وظيفة حسي (الثنائي اختبار عدم التماثل ، والشبكة المشي الاختبار ، rotarod اختبار ورفع اختبار حبل) 1-90 أيام بعد ضخ. وجدنا ان اختبار عدم التماثل الثنائية واختبار شبكه المشي يمكن استخدامها للبحث في الانتعاش ومراحل عواقب نقص التروية لان الاختلافات الكبيرة في هذه المؤشرات الماضي 90 أيام و 60 أيام ، علي التوالي. الكبيرة الاحتشاء ويتقلص حجم, ال أكثر شديده ال [سنفورموتور] عجز, اي يستطيع كنت رايت في شكل 2 وشكل 3.
هذا الأسلوب هو أساسا مناسبه لنقص التروية الدماغية الناجمة عن MCAO. ومع ذلك ، فان النموذج لديه اختلافات في تشريح المخ بين البشر والجرذان ، مثل درجه الدورة الدموية الجانبية. وهناك قيد آخر هو ان استرداد المواد البيضاء لا يمكن ان ينظر اليها من قبل التلطيخ. يمكن للدراسات الاضافيه لتداول الضمانات واستعاده المواد البيضاء مع MR التصوير أو غيرها من الأساليب تاكيد القيمة التنبؤيه لهذا النموذج.
المسالة الأكثر اهميه هي ان مهارة إنشاء نموذج MCAO/R في الفئران ليست سهله وتتطلب الممارسة. قبل التجربة ، تاكد من نسبه نجاح النموذج المقبول والمتوازي. هناك حاجه إلى المزيد من الاداات والأساليب لاختبار الوظيفة الحسية الحركية في مراحل التعافي والسكتة الدماغية. إذا تم استخدام مهمة أكثر صعوبة ، مثل زيادة سرعه من 10 إلى 30 دوره في الدقيقة ، قد تظهر فتره أطول من العجز في اختبار rotarod. قد تكون الاختبارات السلوكية الأخرى مناسبه أيضا لهذا النموذج ، مثل الكشف عن المشية. وينبغي ان تستخدم طرق الكشف أكثر دقه للمرضي في مراحل الانتعاش وعواقب من نقص التروية في الدماغ ، والتي يمكن التعرف علي تاثير المخدرات أو غيرها من الاداات العلاجية.
كنموذج حيواني جديد لدراسة نقص ترويه الدماغ في مراحل الانتعاش والعواقب ، فان الطريقة المعروضة هنا ذات مغزى وتستحق التعميم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81603315 ، 81603316) ، وخطه مفتاح R & D لمقاطعه جيانغشي في الصين (20171ACH80001) ، ومشاريع التعاون الصناعي والأكاديمي في كليات وجامعات مقاطعه فوجيان في الصين (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
- Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
- Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
- Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
- Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
- Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
- Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
- Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
- Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
- DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
- Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
- Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
- Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).
