Summary
Het doel van deze studie is het vaststellen en valideren van een diermodel voor onderzoek in de herstel-en sequela stadia van hersen ischemie door het testen van herseninfarct en sensorimotorische functie na de middelste cerebrale slagader occlusion/reperfusie (MCAO/R) na 1-90 dagen bij ratten.
Abstract
Het doel van deze studie was het vestigen en valideren van een dier hersenen ischemie model in het herstel en sequela stadia. Een middelste cerebrale slagader occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in mannelijke Sprague-Dawley ratten werd gekozen. Door het gewicht van de rat (260 − 330 g) te veranderen, werden het schroefdraad bout type (2636/2838/3040/3043) en de herseninfarct tijd (2-3 h), een hogere Longa-Score, een groter infarct-volume en een grotere succesratio van het model gescreend met behulp van de Score van de Longa en de TTC-kleuring. De optimale model conditie (300 g, 3040 schroefdraad bout, 3 uur herseninfarct tijd) werd verworven en gebruikt in een observatieperiode van 1-90 dagen na reperfusie via beoordeling van sensorimotorische functies en infarct volume. Onder deze omstandigheden had de bilaterale asymmetrie test een significant verschil van 1 tot 90 dagen, en de grid-Walking test had een significant verschil van 1 tot 60 dagen; beide verschillen kunnen een geschikte sensorimotorische functionele test zijn. Dus, de meest geschikte voorwaarde van een roman rat model in het herstel en sequela stadia van hersenen ischemie werd gevonden: 300 g ratten die onderging MCAO met een 3040 draadbout voor een 3 h herseninfarct en vervolgens reperfused. De geschikte sensorimotorische functionele testen waren een bilaterale asymmetrie test en een grid-Walking test.
Introduction
Hersenen ischemie is onderverdeeld in drie stadia met verschillende post-Stroke indicatoren: de acute fase (binnen 1 week), de herstelfase (1 week tot 6 maanden), en de gevolgen fase (meer dan 6 maanden). Momenteel, de meeste studies richten op de acute fase van hersenen ischemie vanwege zijn significante effect en multi-relatieve onderzoek modellen1,2,3. Echter, de herstel-en gevolgen stadia van hersen ischemie kunnen niet worden genegeerd als gevolg van hun lange termijn complicatie van handicaps. Daarom is het doel van deze studie om te verkennen van een stabiele, betrouwbare en relatief eenvoudige diermodel voor het onderzoek van het herstel en sequela stadia van hersenen ischemie.
Onder de vele experimentele hersenen ischemie modellen, gebruiken we middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) via schroefdraad bout inbrengen in de rechter middelste cerebrale slagader (MCA). Dit model is vergelijkbaar met menselijke beroerte, die grotere infarct volumes kan produceren, resulteren in vele gedragsstoornissen gerelateerd aan een beroerte, en kan het toestaan van bloed reperfusie (R) door het verwijderen van de schroefdraad bout4,5,6. MCAO/R wordt ook beschouwd als de gouden standaard diermodel van hersenen ischemie7. Bovendien, de ernst van de hersenletsel hangt af van de diameter en de invoeging lengte van de schroefdraad bout, de duur van hersen ischemie, en het dierlijke gewicht (grotere ratten hebben grotere hersenen en dikkere cerebrale vaten)8. Daarom, door het veranderen van de schroefdraad bout type, de infarct tijd, en de rat gewicht, een geschikt model kan worden gevonden voor het herstel en sequela stadia van hersenen ischemie in MCAO/R ratten. Om het Rat-model te valideren, voerden we een 1-daagse, 35-dag, 60-dag, en 90-dag studie van de MCAO/R model met behulp van TTC kleuring en sensorimotorische functie experimenten (een bilaterale asymmetrie test, een grid-Walking test, een rotarod test en een hijs touw test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedure en het gebruik van dierproef personen zijn goedgekeurd door het National Institute of Health for the Care and use of Lab animals. Dit protocol is specifiek aangepast voor de tests van de middelste cerebrale slagader occlusie/reperfusie (MCAO/R) en sensorimotorische functie.
1. experimenteel ontwerp en groepering
- Gebruik een rat MCAO/R-model voor het scherm van een rat hersenen ischemische model methode met meer ernstige hersenletsel en grotere model succesratio met behulp van de Score van Longa en TTC-kleuring.
- Voer het experiment uit op mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 260 − 330 g die 7 − 9 weken oud zijn. Het echte Rat gewicht is 275 ± 15 g voor 275 g, 300 ± 10 g voor 300 g, en 320 ± 10 g voor 320 g.
- Gebruik de volgende zeven groeperingen (gewicht, schroefdraad bout type, infarct tijd): groep 1 met 15 ratten (275 g, 2636, 2 h); groep 2 met 15 ratten (275 g, 2636, 3 h); groep 3 met 15 ratten (275 g, 2838, 2 h); groep 4 met 15 ratten (275 g, 2838, 3 h); groep 5 met 13 ratten (300 g, 3040, 3 h); groep 6 met 10 ratten (320 g, 3040, 3 h); groep 7 met 13 ratten (300 g, 3043, 3 h).
- Bestudeer de herstelstatus van de hersenen door TTC-kleuring en gebruik geschikte sensorimotorische functie tests om de lange termijn functionele tekorten aan te geven door de bilaterale asymmetrie test, grid-Walking test, rotarod test en lifting Rope test na 1, 35, 60, 90 dagen MCAO/R.
- Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 300 ± 10 g die 8 − 9 weken oud zijn.
- Gebruik de volgende vijf groeperingen: een controlegroep (Normal) met 20 ratten; een 1-daagse groep met 16 ratten; een 35 daggroep met 16 ratten; een 60 daggroep met 17 ratten; en een 90 daggroep met 19 ratten.
- Na de Score van de Longa in stap 1,1 of sensorimotorische functionele tests in stap 1,2, verdoving en onthooi alle ratten voor TTC-kleuring.
2. oprichting van een eenzijdig MCAO/R-model bij ratten9
Opmerking: gebruik tijdens de werking de microforceps zachtjes om breuk van het bloedvat te voorkomen. Vermijd schade aan de zenuwen en andere bloedvaten in de nek van de rat wanneer het vat wordt geïsoleerd. Er moet voor worden gezorgd dat de juiste aseptische techniek voor alle chirurgische ingrepen in de overleving aanwezig is. De techniek die later in de video wordt geïllustreerd, moet door de hele procedure worden beoefend.
- Gedurende de hele operatie, handhaven van de lichaamstemperatuur van de ratten bij 37,0 ± 0,5 °C in een kleine dierlijke thermostaat. Maak vier 6 cm 5-0 hechtingen.
- Stel de zuurstof stroom in van een kleine dieren anesthesie machine (met een afvalgas behandelings inrichting) bij 0,4 − 0,6 L/min en de concentratie van Isofluraan 5%. Plaats de rat in de anesthesie machine.
- Nadat het dier is flauw, plaats de rat op een chirurgische bevestigings tafel. Verbind de mond van de rat met het masker van de anesthesie machine (het zuurstof debiet blijft ongewijzigd; Stel de concentratie Isofluraan in op 3%). Bevestig dat het dier diepe verdoving heeft ingevoerd door het observeren van een gebrek aan extremiteiten, corneale reflexen en pijn.
- Bevestig de ledematen om op de werktafel te liggen met papieren bandages (of andere gereedschappen).
- Verwijder de nekvacht met een elektrisch scheerapparaat en steriliseer met 75% alcohol (iodophor is beter). Bevestig de mond van de rat met een haak.
- Snijd 2 − 3 cm langs de centrale longitudinale vorm van de nek met oogheelkundige schaar.
- Scheid de gemeenschappelijke carotis slagader. Scheid de subcutane spier met de oogheelkundige Tang. Gebruik zelfgemaakte oprolmechanisme om het gezichtsveld volledig bloot te leggen. Na het scheiden van de voorste spier van de luchtpijp met oogheelkundige Tang, scheiden langs de rechter sternocleidomastoïde pees totdat de gemeenschappelijke carotis slagader zichtbaar is.
- Isoleer de gewone halsslagader, de uitwendige halsslagader en de inwendige halsslagader met oogheelkundige Tang. Ligate de gemeenschappelijke halsslagader (harde knoop), uitwendige halsslagader ver van het hart uiteinde (harde knoop), en inwendige halsslagader (losse knoop) met 5-0 hechtingen. Lijn de uitwendige halsslagader in de buurt van het hart uiteinde met 5-0 hechtingen.
- Plaats een schroefdraad bout. Snijd een kleine opening in de uitwendige halsslagader met behulp van een oftalmische schaar en steek voorzichtig een schroefdraad bout in. Ligate de hechting van de uitwendige halsslagader die in losse knoop is geweest en afgesneden van de uitwendige halsslagader.
- Draai de losse knoop van de inwendige halsslagader los en ga door met het inbrengen van de schroefdraad bout aan het begin van de middelste hersenslagader (hechting gemarkeerd). Knip dan de blootgestelde schroefdraad bout af.
- Nadat de ischemische tijd is bereikt (2-3 h), Fixeer de breuk van de uitwendige halsslagader met één microforceps, en trek voorzichtig de schroefdraad bout met een andere microforceps. Wanneer de voorkant van de schroefdraad bout volledig uit de inwendige halsslagader wordt teruggetrokken, ligate de uitwendige halsslagader die was bekleed met 5-0 hechtingen, en trek vervolgens de schroefdraad bout volledig uit.
- Maak de gemeenschappelijke halsslagader los en Daub ~ 50.000 U van penicillaire natrium poeder op het oppervlak van de wond om infectie te voorkomen. Hechting subcutane spieren en huid met 4 hechtingen.
- Geef ~ 0,2 mL van de steriele zoutoplossing oraal met behulp van een 1 mL spuit (SQ-PEN injectie is beter) om te voorkomen dat postoperatieve watertekort na het plaatsen van de rat terug naar de kooi.
- Kies de dieren na 24 uur reperfusie volgens de Score van de Longa10. Selecteer dieren met de Score van een Longa van 1 − 3 voor de volgende TTC-kleuring in stap 1,1, en dieren met een Score van Longa van 2 − 3 voor de studie 1, 35, 60, 90 dagen in stap 1,2.
Opmerking: Longa score10: 0 score, geen neurologische tekort; 1 Score, niet verlengen van de linkse voorrechten; 2 score, cirkelen naar links; 3 Score, naar links vallen; 4 Score, kan niet spontaan lopen en heeft een depressief bewustzijn. - Analyseer de Score van de Longa met one-way ANOVA. Getoonde waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. P < 0,05 geven verschil aan.
3. TTC-kleuring
Opmerking: de rat brain slice Mold en Blade moeten vóór gebruik vooraf worden gekoeld in een koelkast van een-20 °C om hechting te voorkomen die veroorzaakt wordt door een groot temperatuurverschil. Voorkom tijdens vlekken de hechting tussen de hersen sneden en de kweek plaat, wat kan leiden tot onvoldoende kleuring.
- Anesthetiseer de rat door intraperitoneale injectie van 400 mg/kg Chloraalhydraat na de Score van Longa in stap 1,1 of sensorimotorische functionele tests in stap 1,2.
- Onthoofde rat met een chirurgische schaar of met een rat onthoofding apparaat. Verwijder de hersenen met chirurgische schaar en hemostatische Tang.
- Zet de hersenen gedurende 30 minuten in de koelkast bij-20 °C om slicing te vergemakkelijken.
- Verwijder de hersenen uit de koelkast en plaats deze in pre-gekoelde rat hersenen segment schimmel. Snijd de hersenen in zes 2 mm dikke opeenvolgende secties met een voorgekoeld blad.
- Beits de delen met 2% 5-trifenyl-2H-tetrazoliumchloride (TTC) in een 6-well kweek plaat.
- Kweek de secties 30 − 60 min bij 37 °C in een schud bed. Draai de secties om de 10 min totdat de hersenen ischemie gebied en het normale gebied duidelijk wit en rood zijn.
- Lijn de hersenen segmenten verticaal in volgorde van de rug naar de voorkant van de hersenen. Gebruik een liniaal om ervoor te zorgen dat de totale lengte van elke regel hetzelfde is. Maak Foto's met een digitale camera.
- Analyseer het volume van de infarct.
- Pre-behandeling van de foto met Photoshop software
- Importeer de foto met Photoshop CS6. 00:00-00:14
- Klik op selecteren om de hersen segmenten te selecteren, klik op selecteren | Inverse. 00:15-00:36
- Klik op voor grond om zwart te selecteren en klik op OK. 00:37-00:42
- Druk op Alt + Delete om de achtergrondkleur te vullen en CTRL + D om de selectie te opheffen. 00:43-00:46
- Klik op bestand | Opslaan op bureaublad. 00:47-01:08
- Pre-behandeling van de foto met Image Pro Plus software.
- Open Image Pro plus 6,0-software en importeer de foto. 01:09-01:24
- Voor het wijzigen van defecten past u de helderheid aan met het gereedschap contrast verbetering , zodat de achtergrond zwart is. 01:25-01:37
- Gebruik het gereedschap mediaan in filter om de hooglichten te verwijderen. 01:38-01:46
- Bereken het linker (normale) hersengebied met Image Pro Plus-software
- Selecteer kleur met segmentatie en pas de waarde van H/S/Iaan, zodat de hersen segmenten gescheiden zijn van de zwarte achtergrond. 01:47-02:12
- Terug naar tellen | Grootte. 02:13-02:16
- Klik op Count | Splits objecten in bewerken om de hersenen van de middenlijn te scheiden. De software zal automatisch de linker-en rechter hersengebieden onderscheiden. 02:17-02:49
- Bereken de juiste infarct hersengebied met Image Pro Plus software
- Implementeer stap 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Aantal selecteren | Grootte. 03:15-03:21
- Klik op Draw | Het gereedschap objecten samenvoegen in bewerken. Selecteer handmatig het ischemische gebied en klik op tellen om het ischemische gebied te berekenen. 03:16-05:31
- Bereken de gezondheid hersengebied met Image Pro Plus software
- Implementeer stap 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Selecteer kleur met segmentatie en pas de waarde van H/S/Iaan, zodat het normale deel van hersen segmenten gescheiden is van de zwarte achtergrond. 06:45-07:10
- Terug naar tellen | Grootte en klik op aantal om dit gebied te berekenen. 07:11-07:21
- Klik op objecten splitsen in bewerken om de hersenen van de middenlijn te scheiden. De software zal automatisch de linker-en rechter hersengebieden onderscheiden. 07:22-08:08
- Pre-behandeling van de foto met Photoshop software
- Bereken het infarct volume (%) en infarct en volume krimpen (%):
Infarct volume (%) = [rechter infarct gebied/(2 x linker hersengebied)] x 100.
Infarct en volume krimpen (%) = [(linker hersengebied-rechter gezondheid hersengebied)/(2 x linker hersengebied)] x 100.
Opmerking: de rechter hersenen is het gewonde deel. De gegevens werden geanalyseerd door one-way ANOVA. Getoonde waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. P < 0,05 geven verschil aan.
4. beoordeling van de sensorimotorische functie
Opmerking: ratten (300 g, 3040 schroefdraad bout, 3 uur herseninfarct tijd) met de Score van een Longa van 2 − 3 werden geselecteerd om de sensorimotorische functie experimenten uit te voeren van 1-90 dagen. Houd stil en stoor de dieren niet tijdens deze studieperiode. De gegevens werden geanalyseerd door twee richtings-ANOVA. Getoonde waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. P < 0,05 geven verschil aan.
- Bilaterale asymmetrie test11
- Wikkel papieren rompslomp (5 cm lang, 0,8 cm breed) op het onderhoudende deel van elke voorwet van een rat driemaal met gelijke druk.
- Voor elke rat, noteer het aantal keren dat elke foreclaw wordt gecontacteerd en tape verwijderd in 5 minuten met camera, met inbegrip van onaangetast paw tijden en getroffen paw tijden.
- Herhaal na 30 minuten de stappen 4.1.1 en 4.1.2 opnieuw.
- Bereken de gemiddelde waarde van de sensorimotorische bias (%):
Sensorimotorische bias (%) = (niet-beïnvloed paw tijden-beïnvloed paw tijden)/(onaangetast paw tijden + getroffen paw tijden) x 100
- Grid-Walking test
- Plaats de rat in het midden van een verhoogde grid oppervlak platform (gebied: 1 m2; hoogte: 90 cm) met raster openingen van 2,5 cm2.
- Duw de heupen van de rat lichtjes om de rat aan te moedigen om het raster oppervlak te passeren.
- Noteer het aantal voet fouten gemaakt door de onaangetaste (rechts) en aangetaste (linker) ledematen en het totale stappen nummer in 1 minuut met camera.
- Bereken de fout tijden:
Fout tijden (%) = [niet beïnvloed (rechts) ledemaat-aangetast (links) ledemaat]/totaal stap nummer x 100.
Opmerking: het totale aantal stappen onder de 20-stap gegevens is verwijderd.
- Rotarod test12,13
- Instellen van de rat roterende Bar vermoeiings apparatuur (diameter 90 mm) van ratten met behulp van de ondersteunende software om een snelheid van 13 rpm over een periode van 5 minuten op de computer.
- Start de computerprogramma's en plaats de rat op de rotarod-sporten op hetzelfde moment.
- Beëindig een proef als de rat van de Rung valt of 5 minuten blijft lopen en neem de roterende tijd op.
- Laat de rat 30 minuten rusten.
- Herhaal stap 4.3.2 − 4.3.4 tweemaal meer en kies de maximale waarde als laatste roterende tijd.
- Hijs touw test14
- Plaats het hijs touw instrument (70 cm hoog; het touw is 0,2 cm in diameter en 40 cm lang) op het Bureau.
- Laat de rat het touw met zijn voorpoten grip en de rat ophangen.
- Noteer de tijd van het ophangen en bereken de scores.
Opmerking: een Score van 3:0 − 2 s op het touw; Een Score van 2:3 − 4 s op het touw; Een Score van 1:5 − 6 s op het touw; Een Score van 0: meer dan 7 s op het touw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de bovengenoemde procedure voor een MCAO/R-model met een Score van Longa en TTC-kleuring, verschillende behandelingen van gemiddeld gewicht (275/300/320 g), bout typen (2636/2838/3040/3043; Tabel 1) en ischemische tijden (2-3 h) en 1 dag reperfusie werden gebruikt om het scherm voor de optimale hersenen ischemie model bij ratten. Model parameters van 300 g gewicht, 3040 draadbout, en 3 h herseninfarct tijd waren het meest geschikt voor de grootste herseninfarct, hoogste Longa Score en grootste model succesratio. Dit was aanzienlijk verbeterd op de conventionele behandeling van een 275 g gewicht, 2636 schroefdraad bout, en 2 h herseninfarct tijd (Figuur 1).
Bovendien, ratten met 300 g gewicht, 3040 draadbout, 3 h hersenen infarct tijd en een 2 − 3 Longa Score onderging sensorimotorische functie testen (een bilaterale asymmetrie test, een grid-Walking test, een rotarod-test, en een hijs touw test) en TTC kleuring voor het bestuderen van het herstel status van hersenen ischemie van 1-90 dagen. De infarct en het volume van de krimp waren 23,4%, 19,6%, 16,1% (p < 0,01, vergeleken met de eerste dag) en 15,7% (p < 0,01, vergeleken met de eerste dag) na 1, 35, 60 en 90 dagen post mcao/R, respectievelijk (Figuur 2). Op de eerste dag na MCAO/R was het volume van infarct het grootst. In de tijd werd het volume van de infarct kleiner en werd het volume van de krimp groter. De infarct en het volume van de krimp niet meer veranderd na 60 dagen van MCAO/R.
De sensorimotorische bias in de bilaterale asymmetrie test, de grid-Walking error tijden in de grid-Walking test en de hijs touw Score in de hijs touw test alle aanzienlijk toegenomen, terwijl de rotarod tijd in de rotarod test daalde aanzienlijk na 1 dag van MCAO/R (Figuur 3), wat aangaf dat alle vier de tests betekenisvol waren in het stadium van acute hersen ischemie. Echter, alleen sensorimotorische bias onderhouden grote functionele stoornissen met een tijdafhankelijke manier na 35, 60 en 90 dagen van MCAO/R. Er waren aanzienlijke verschillen van raster-Walking error Times in de grid-Walking test na 35 en 60 dagen van MCAO/R. Deze resultaten gaven aan dat de bilaterale asymmetrie test en de grid-Walking test geschikte sensorimotorische functie tests voor het stadium van herstel en sequela bij ratten kunnen zijn.
Afbeelding 1:300 g gewicht, 3040 schroefdraad bout, 3 h herseninfarct tijd kan de optimale conditie van de hersenen ischemische letsel veroorzaakt door MCAO/R zijn. (a, B) Foto's en Cartogram van infarct volume hersenweefsel (n = 9 − 12). (C) de Score van Longa (n = 9 − 12). D) de statistieken van de succesratio voor modellen van ratten (n = 10 − 15). Model succesratio = (totaal aantal ratten-dood ratten na MCAO/R-falen ratten na MCAO/R)/totaal aantal ratten. Falen ratten zijn de model ratten die niet over een geschikte Longa Score. Foutbalken vertegenwoordigen S.D., *p < 0,05, * *p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Liu et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de infarct en het volume van de krimp daalde geleidelijk van 1 tot 90 dagen na MCAO/R. A) de TTC-kleuring van het hersenweefsel van ratten. B) het Cartogram van de infarct en het volume van de krimp (n = 16 − 19). Foutbalken representeren S.D., * *P < 0,01 VS. de eerste dag na mcao/R. Dit cijfer is gewijzigd van Liu et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bilaterale asymmetrie test en grid-Walking test waren de geschikte sensorimotorische functie tests in de Recovery en sequela stadium van hersenen ischemie. A) het recht om de voorkeur te scheuren in het ontbindings experiment. B) het rooster-loop fouten in de raster test. C) de tijdsduur in de rotarod-test. D) de score in de hijs touw test. Foutbalken vertegenwoordigen S.D., n = 15 − 19, *p < 0,05, * * *P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd van Liu et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Type | De diameter van de schroefdraad bout | De diameter van de schroefdraad bout hoofd | Aanbevolen gewicht rat | Niveau |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | > 400 g | A4 |
| Opmerking: A4-niveau schroefdraad bout is de standaard dat het hoofdeinde is hemisferische, de voorkant is bedekt met poly-lysine, gemarkeerd, gesteriliseerd, en buy-on-gebruik zonder enige behandeling (deze tabel is gewijzigd van Liu et al., 2018). | ||||
Tabel 1: thread Blot-informatie. Deze tabel is gewijzigd van Liu et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel modellen tot vaststelling van methoden en gedragsindicatoren die goed worden gebruikt in acute cerebrale ischemie kunnen geen significante veranderingen in het herstel en sequela stadia van hersenen ischemie16,17. Echter, het aantal patiënten met hersenen ischemische in het herstel en sequela stadia is de grootste. Het is essentieel om te kiezen van een geschikte diermodel voor het herstel en sequela stadia van ischemie beroerte.
We gebruiken het MCAO/R-model bij ratten om het geschikte gewicht van ratten te schermen (260 − 330 g), het type schroefdraad bout (2636/2838/3040/3043) en de tijd van herseninfarct (2-3 h) voor de ernstigste infarct letsel, een hoge model succesratio en zichtbare gedragsindicatoren , die geschikt zal zijn voor het herstel en de gevolgen stadia van hersenen ischemie.
Ratten die 300 g wegen met een 3040 schroefdraad bout en 3 uur herseninfarct tijd hebben grotere infarct volumes, meer ernstige gedrags gebreken, en een grotere model succesratio (Figuur 1). Bovendien hebben we validatiemethoden van dit rat model verstrekt door TTC-kleuring en sensorimotorische functie tests (bilaterale asymmetrie test, grid-Walking test, rotarod test en lifting Rope test) 1-90 dagen na reperfusie. We constateerden dat de bilaterale asymmetrie test en grid-Walking test kunnen worden gebruikt om het herstel en sequela stadia van ischemie te onderzoeken, omdat de aanzienlijke verschillen van deze indicatoren duren 90 dagen en 60 dagen, respectievelijk. Hoe groter de infarct en het volume van de krimp, hoe ernstiger de sensorimotorische tekorten, die kunnen worden gezien in Figuur 2 en Figuur 3.
Deze methode is vooral geschikt voor hersenen ischemie veroorzaakt door MCAO. Het model heeft echter verschillen in hersen anatomieën tussen mensen en ratten, zoals de graad van onderpand circulatie. Een andere beperking is dat het herstel van de witte stof niet kan worden gezien door TTC-kleuring. Verdere studies van onderpand circulatie en terugwinning van witte stoffen met de heer Imaging of andere methoden kunnen de voorspellende waarde van dit model bevestigen.
De meest kritische zaak is dat de vaardigheid van het creëren van een MCAO/R model bij ratten is niet gemakkelijk en vereist praktijk. Bevestig vóór het experiment een acceptabele en parallelle model succesratio. Er zijn meer instrumenten en methoden nodig om de sensorimotorische functie in de herstel-en sequela stadia van een beroerte te testen. Als een moeilijkere taak, zoals het verhogen van de snelheid van 10 naar 30 rpm, werd gebruikt, kan een langere periode van tekort in de rotarod-test verschijnen. Andere gedragstesten kunnen ook geschikt zijn voor dit model, zoals een gang-detectie. Meer precieze detectiemethoden moeten worden gebruikt voor patiënten in de Recovery en sequela stadia van hersenen ischemie, die het effect van drugs of andere therapeutische instrumenten kunnen identificeren.
Als een nieuw diermodel om te studeren van hersenen ischemie in het herstel en sequela stadia, de hier gepresenteerde methode is zinvol en verdient popularisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81603315, 81603316), key R & D plan van de provincie Jiangxi in China (20171ACH80001), industriële en academische samenwerkingsprojecten in hogescholen en universiteiten van de provincie Fujian in China (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
- Kong, L. L., et al. Neutralization of chemokine-like factor 1, a novel C-C chemokine, protects against focal cerebral ischemia by inhibiting neutrophil infiltration via MAPK pathways in rats. Journal of Neuroinflammation. 11, 112 (2014).
- Jiang, M., et al. Neuroprotective effects of bilobalide on cerebral ischemia and reperfusion injury are associated with inhibition of pro-inflammatory mediator production and down-regulation of JNK1/2 and p38 MAPK activation. Journal of Neuroinflammation. 11, 167 (2014).
- Thomas, A., Detilleux, J., Flecknell, P., Sandersen, C. Impact of Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) Guidelines on Peri-Anesthesia Care for Rat Models of Stroke: A Meta-Analysis Comparing the Years 2005 and 2015. PLoS One. 12, e0170243 (2017).
- Kumar, A., Aakriti,, Gupta, V. A review on animal models of stroke: An update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
- Tong, F. C., et al. An enhanced model of middle cerebral artery occlusion in nonhuman primates using an endovascular trapping technique. AJNR Am. Journal of Neuroradiology. 36, 2354-2359 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9, 541-551 (2014).
- Abrahám, H., Somogyvári-Vigh, A., Maderdrut, J. L., Vigh, S., Arimura, A. Filament size influences temperature changes and brain damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Exp. Brain Res. 142, 131-138 (2002).
- Sun, M. N., et al. Coumarin derivatives protect against ischemic brain injury in rats. European Journal of Medicinal Chemistry. 67, 39-53 (2013).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cell. 30, 785-796 (2012).
- Zhang, S., et al. Protective effects of Forsythia suspense extract with antioxidant and anti-inflammatory properties in a model of rotenone induced neurotoxicity. Neurotoxicology. 52, 72-83 (2016).
- Milani, D., et al. Poly-arginine peptides reduce infarct volume in a permanent middle cerebral artery rat stroke model. BMC Neuroscience. 17, 19 (2016).
- DeGraba, T. J., Ostrow, P., Hanson, S., Grotta, J. C. Motor performance, histologic damage, and calcium influx in rats treated with NBQX after focal ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14, 262-268 (1994).
- Liu, P., et al. Validation of a preclinical animal model to assess brain recovery after acute stroke. European Journal of Pharmacology. 835, 75-81 (2018).
- Zuo, W., et al. IMM-H004 prevents toxicity induced by delayed treatment of tPA in a rat model of focal cerebral ischemia involving PKA-and PI3K-dependent Akt activation. European Journal of Neuroscience. 39, 2107-2118 (2014).
- Yang, L., et al. L-3-n-butylphthalide Promotes Neurogenesis and Neuroplasticity in Cerebral Ischemic Rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 21, 733-741 (2015).
