Summary
Der Zweck dieser Studie ist es, ein Tiermodell für die Forschung in der Erholung und Fortsetzung der Gehirn-Ischämie zu etablieren und zu validieren, indem Hirninfarkt und sensorimotorische Funktion nach mittlerer ZerebrierungSverschluss/Reperfusion (MCAO/R) nach 1-90 getestet werden. Tage in Ratten.
Abstract
Der Zweck dieser Studie war es, ein tierisches Gehirn Ischämie-Modell in der Erholung und Fortsetzung Sephase zu etablieren und zu validieren. Es wurde ein Modell der mittleren zerebralen Arterienverschluss/Reperfusion (MCAO/R) bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten gewählt. Durch die Änderung des Gewichts der Ratte (260 bis 330 g), des Gewindeschraubentyps (2636/2838/3040/3043) und der Hirninfarktzeit (2-3 h) wurden eine höhere Longa-Punktzahl, ein größeres Infarktvolumen und ein größeres Modellerfolgsverhältnis anhand der Longa-Punktzahl und der TTC-Färbung abgeschirmt. Die optimale Modellbedingung (300 g, 3040 Gewindebolzen, 3 h Hirninfarktzeit) wurde erfasst und in einer Beobachtungszeit von 1-90 Tagen nach der Reperfusion mittels Beurteilung der sensorimotorischen Funktionen und des Infarktvolumens verwendet. Unter diesen Bedingungen hatte der bilaterale Asymmetrietest einen signifikanten Unterschied von 1 bis 90 Tagen, und der Grid-Walking-Test hatte einen signifikanten Unterschied von 1 bis 60 Tagen; beide Unterschiede könnten ein geeigneter sensorimotorischer Funktionstest sein. So wurde der am besten geeignete Zustand eines neuartigen Rattenmodells in den Erholungs- und Sequela-Stadien der Gehirnischämie gefunden: 300 g Ratten, die MCAO mit einem 3040 Fadenbolzen für einen 3 h Hirninfarkt unterzogen und dann reperfiert wurden. Die entsprechenden sensorimotorischen Funktionstests waren ein bilateraler Asymmetrietest und ein Grid-Walking-Test.
Introduction
Die Hirnischämie ist in drei Stadien mit verschiedenen Post-Stroke-Indikatoren unterteilt: das akute Stadium (innerhalb einer Woche), die Erholungsphase (1 Woche bis 6 Monate) und die Fortsetzungsphase (mehr als 6 Monate). Derzeit konzentrieren sich die meisten Studien auf das akute Stadium der Gehirnischämie wegen seiner signifikanten Wirkung und multi-relative Forschungsmodelle1,2,3. Jedoch, die Erholung und Fortsetzung Sendestadien des Gehirns Ischämie kann nicht ignoriert werden, aufgrund ihrer langfristigen Komplikation von Behinderungen. Daher ist der Zweck dieser Studie, ein stabiles, zuverlässiges und relativ einfaches Tiermodell zu erforschen, um die Erholungs- und Fortsetzungsstadien der Gehirnischämie zu erforschen.
Unter den vielen experimentellen Gehirn-Ischämie-Modellen verwenden wir mittlere Hirnarterienverschluss (MCAO) über Gewindebolzeneinfügung in die rechte mittlere Hirnarterie (MCA). Dieses Modell ähnelt dem menschlichen Schlaganfall, der größere Infarktvolumina erzeugen kann, zu vielen Verhaltensstörungen im Zusammenhang mit Schlaganfall führt und eine Blutreperfusion (R) durch Entfernen der Gewindeschraube4,5,6ermöglichen kann. MCAO/R gilt auch als das Goldstandard-Tiermodell der Gehirnischämie7. Darüber hinaus hängt die Schwere der Hirnverletzung vom Durchmesser und der Einfügelänge des Gewindebolzens, der Dauer der Gehirnischämie und dem Tierischen Gewicht (größere Ratten haben größere Gehirne und dickere Hirngefäße)ab 8. Daher kann durch die Änderung des Gewindeschraubentyps, der Infarktzeit und des Rattengewichts ein geeignetes Modell für die Erholung und Diesina-Stadien der Gehirnischämie bei MCAO/R-Ratten gefunden werden. Um das Rattenmodell zu validieren, führten wir eine 1-Tägige, 35-Tage-, 60-Tage- und 90-Tage-Studie des MCAO/R-Modells mit TTC-Färbungs- und sensorimotorischen Funktionsexperimenten durch (bilateraler Asymmetrietest, Grid-Walking-Test, Rotarod-Test und Hebeseiltest).
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Protocol
Das Verfahren und die Verwendung von Tierkörpern wurden vom Nationalen Institut für Gesundheit für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt. Dieses Protokoll ist speziell für die Tests der mittleren Zerebralen Arterienverschluss/-reperfusion (MCAO/R) und der sensorimotorischen Funktion angepasst.
1. Experimentelles Design und Gruppierung
- Verwenden Sie ein Mratten-MCAO/R-Modell, um eine ischämische Methode des Rattengehirns mit schwereren Hirnverletzungen und einem höheren Modellerfolgsverhältnis mithilfe von Longas Punktzahl und TTC-Färbung zu überprüfen.
- Führen Sie das Experiment an männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 260 bis 330 g durch, die 7 bis 9 Wochen alt sind. Das reale Rattengewicht beträgt 275 x 15 g für 275 g, 300 x 10 g für 300 g und 320 x 10 g für 320 g.
- Verwenden Sie die folgenden sieben Gruppierungen (Gewicht, Gewindeschraubentyp, Infarktzeit): Gruppe 1 mit 15 Ratten (275 g, 2636, 2 h); Gruppe 2 mit 15 Ratten (275 g, 2636, 3 h); Gruppe 3 mit 15 Ratten (275 g, 2838, 2 h); Gruppe 4 mit 15 Ratten (275 g, 2838, 3 h); Gruppe 5 mit 13 Ratten (300 g, 3040, 3 h); Gruppe 6 mit 10 Ratten (320 g, 3040, 3 h); Gruppe 7 mit 13 Ratten (300 g, 3043, 3 h).
- Untersuchen Sie den Erholungsstatus des Gehirns durch TTC-Färbung und verwenden Sie geeignete sensorimotorische Funktionstests, um die langfristigen funktionellen Defizite durch den bilateralen Asymmetrietest, den Grid-Walking-Test, den Rotarod-Test und den Hebeseiltest nach 1, 35, 60, 90 Tagen MCAO/R anzuzeigen.
- Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300 x 10 g, die 8 bis 9 Wochen alt sind.
- Verwenden Sie die folgenden fünf Gruppierungen: eine Kontrollgruppe (normale) Gruppe mit 20 Ratten; eine 1-Tages-Gruppe mit 16 Ratten; eine 35-Tage-Gruppe mit 16 Ratten; eine 60-Tage-Gruppe mit 17 Ratten; und eine 90-Tage-Gruppe mit 19 Ratten.
- Nach der Longa-Punktzahl in Schritt 1.1 oder sensorimotorischen Funktionstests in Schritt 1.2 alle Ratten für die TTC-Färbung zu beanstanden und zu enthaupten.
2. Einführung eines einseitigen MCAO/R-Modells bei Ratten9
HINWEIS: Verwenden Sie während der Operation die Mikrozange vorsichtig, um einen Bruch des Blutgefäßes zu verhindern. Vermeiden Sie Schäden an den Nerven und anderen Blutgefäßen im Hals der Ratte, wenn das Gefäß isoliert ist. Es muss darauf geachtet werden, dass für alle chirurgischen Überlebensoperationen eine geeignete aseptische Technik vorliegt. Die später im Video dargestellte Technik sollte während des gesamten Verfahrens geübt werden.
- Während der gesamten Operation die Körpertemperatur der Ratten in einem Kleintierthermostat bei 37,0 °C bei 0,5 °C halten. Bereiten Sie vier 6 cm 5-0 Nähte.
- Stellen Sie die Sauerstoffdurchflussrate einer Kleintieranästhesiemaschine (mit einer Abgasbehandlungsvorrichtung) auf 0,4,6 l/min und die Konzentration von Isofluran auf 5 % fest. Legen Sie die Ratte in die Anästhesiemaschine.
- Nachdem das Tier ohnmächtig geworden ist, legen Sie die Ratte auf einen chirurgischen Fixiertisch. Verbinden Sie den Mund der Ratte mit der Maske der Anästhesiemaschine (die Sauerstoffdurchflussrate bleibt unverändert; stellen Sie die Konzentration von Isofluran auf 3%) ein. Bestätigen Sie, dass das Tier in tiefe Anästhesie eingetreten ist, indem es einen Mangel an Extremitätsspannung, Hornhautreflexen und Schmerzen beobachtet hat.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen, um mit Papierverbänden (oder anderen Werkzeugen) auf dem Operationstisch zu liegen.
- Entfernen Sie den Nackenmantel mit einem elektrischen Rasierer und sterilisieren Sie mit 75% Alkohol (Iodophor ist besser). Fixieren Sie den Mund der Ratte mit einem Haken.
- Mit einer Augenschere 2 x 3 cm entlang der zentralen Längsform des Halses schneiden.
- Trennen Sie die gemeinsame Halsschlagader. Trennen Sie den subkutanen Muskel mit ophthalmologischen Zangen. Verwenden Sie hausgemachte Retraktor, um das Feld der Vision vollständig zu entlarven. Nach der Trennung des vorderen Muskels der Luftröhre mit ophthalmologischen Zangen, trennen Sie entlang der rechten sternocleidomastoiden Sehne, bis die gemeinsame Karotisarterie sichtbar ist.
- Isolieren Sie die gemeinsame Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die innere Halsschlagader mit ophthalmologischen Zangen. Ligate die gemeinsame Halsschlagader (harter Knoten), externe Halsschlagader weit vom Herzende (harter Knoten) und innere Halsschlagader (lockerer Knoten) mit 5-0 Nähten. Die äußere Halsschlagader in der Nähe des Herzendes mit 5:0 Nähten aussanlassen.
- Legen Sie eine Gewindeschraube ein. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in der äußeren Halsschlagader mit einer Augenschere und legen Sie vorsichtig eine Gewindeschraube ein. Ligate die Naht der äußeren Halsschlagader, die in losem Knoten gewesen ist und schneiden Sie die äußere Halsschlagader.
- Lösen Sie den losen Knoten der inneren Halsschlagader und setzen Sie den Fadenbolzen am Anfang der mittleren Hirnarterie (Nähte markiert) ein. Schneiden Sie dann die freiliegende Gewindeschraube ab.
- Nachdem die ischämische Zeit erreicht ist (2-3 h), fixieren Sie den Bruch der äußeren Halsschlagader mit einem Mikrozange, und ziehen Sie den Fadenbolzen vorsichtig mit einem anderen Mikrozange heraus. Wenn das vordere Ende der Gewindeschraube vollständig aus der inneren Halsschlagader entfernt wird, ligate die externe Halsschlagader, die mit 5-0 Nähten ausgekleidet war, und ziehen Sie dann die Gewindeschraube vollständig heraus.
- Lösen Sie die gemeinsame Halsschlagader, und daub 50.000 U Penicillin Natriumpulver auf der Oberfläche der Wunde, um eine Infektion zu verhindern. Suture subkutane Muskeln und Haut mit 4 Nähten.
- Geben Sie der Ratte mit einer 1 ml Spritze (SQ-PEN-Injektion ist besser) 0,2 ml sterile Salzine, um postoperative Wasserknappheit zu verhindern, nachdem sie die Ratte wieder in den Käfig gebracht hat.
- Wählen Sie die Tiere nach 24 Stunden Reperfusion nach der Longa-Punktzahl10. Wählen Sie Tiere mit einer Longa-Punktzahl von 1-3 für die nächste TTC-Färbung in Schritt 1.1 und Tiere mit einer Longa-Punktzahl von 2 x 3 für die 1, 35, 60, 90-Tage-Studie in Schritt 1.2 aus.
HINWEIS: Longas Punktzahl10: 0 Punktzahl, kein neurologisches Defizit; 1 Punktzahl, Nichtverlängerung links foreclaw; 2 Partitur, kreist nach links; 3 Punktzahl, fallen deiner seite, nach links; 4 Punktzahl, kann nicht spontan gehen und hat ein deprimiertes Bewusstsein. - Analysieren Sie die Longa-Punktzahl per one-way ANOVA. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
3. TTC Färbung
HINWEIS: Die Mratten-Gehirnscheibe Form und Klinge muss in einem -20 °C Kühlschrank vor dem Gebrauch vorgekühlt werden, um Haftung durch einen großen Temperaturunterschied verursacht zu verhindern. Während der Färbung, verhindern Haftung zwischen den Gehirnscheiben und der Kulturplatte, die zu unzureichender Färbung führen kann.
- Anästhesisieren Sie die Ratte durch intraperitoneale Injektion von 400 mg/kg Chlorhydrat nach dem Longa-Score in Schritt 1.1 oder sensorimotorischen Funktionstests in Schritt 1.2.
- Enthaupten Sie die Ratte mit einer chirurgischen Schere oder mit einem Rattenenthauptungsapparat. Entfernen Sie das Gehirn mit chirurgischer Schere und hämostatischen Zangen.
- Legen Sie das Gehirn bei -20 °C für 30 min in den Kühlschrank, um das Schneiden zu erleichtern.
- Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kühlschrank und legen Sie es in vorgekühlte Ratte Gehirn Scheibe Schimmel. Schneiden Sie das Gehirn in sechs 2-mm-dicke aufeinanderfolgende Abschnitte mit einer vorgekühlten Klinge.
- Die Abschnitte mit 2% 5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchlorid (TTC) in einer 6-Well-Kulturplatte färben.
- Die Abschnitte für 30 bis 60 min bei 37 °C in einem Schüttelbett beskulturen. Drehen Sie die Abschnitte alle 10 min, bis der Gehirn Ischämiebereich und der normale Bereich sind deutlich weiß und rot.
- Line das Gehirn schneidet vertikal in der Reihenfolge von hinten nach vorne des Gehirns. Verwenden Sie ein Lineal, um sicherzustellen, dass die Gesamtlänge jeder Zeile gleich ist. Nehmen Sie Bilder mit Digitalkamera.
- Analysieren Sie das Infarktvolumen.
- Vorbehandlung des Fotos mit Photoshop-Software
- Importieren Sie das Foto mit Photoshop CS6. 00:00-00:14
- Klicken Sie auf Auswählen, um die Gehirn-Slices auszuwählen, klicken Sie auf Auswählen | Inverse. 00:15-00:36
- Klicken Sie auf Vordergrund, um Schwarz auszuwählen, und klicken Sie auf OK. 00:37-00:42
- Drücken Sie Alt +Löschen, um die Hintergrundfarbe auszufüllen, und STRG +D, um die Auswahl aufzuheben. 00:43-00:46
- Klicken Sie auf Datei | Auf dem Desktop speichern. 00:47-01:08
- Vorbehandlung des Fotos mit DerImage Pro Plus Software.
- Öffnen Sie die Image Pro Plus 6.0-Software und importieren Sie das Foto. 01:09-01:24
- Passen Sie die Helligkeit für die Änderung von Fehlern mit dem Werkzeug Kontrastverbesserung an, sodass der Hintergrund schwarz ist. 01:25-01:37
- Verwenden Sie das Werkzeug Median im Filter, um die Hervorhebungen zu entfernen. 01:38-01:46
- Berechnen Sie den linken (normalen) Hirnbereich mit der Image Pro Plus Software
- Wählen Sie Farbe mit Segmentierung aus, und passen Sie den Wert von H/S/Ian, sodass die Gehirnscheiben vom schwarzen Hintergrund getrennt werden. 01:47-02:12
- Zurück zur Anzahl | Größe. 02:13-02:16
- Klicken Sie auf Zählen | Teilen Sie Objekte in Bearbeiten, um das Gehirn von der Mittellinie zu trennen. Die Software unterscheidet automatisch den linken und rechten Hirnbereich. 02:17-02:49
- Berechnen Sie den richtigen Infarkt-Hirnbereich mit der Image Pro Plus-Software
- Implementieren Sie Schritt 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Wählen Sie Anzahl | Größe. 03:15-03:21
- Klicken Sie auf Zeichnen | Werkzeug "Objekte zusammenführen" in Bearbeiten. Wählen Sie manuell den ischämischen Bereich aus und klicken Sie auf Zählen, um das ischämische Gebiet zu berechnen. 03:16-05:31
- Berechnen Sie den Gesundheits-Gehirnbereich mit Image Pro Plus Software
- Implementieren Sie Schritt 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Wählen Sie Farbe mit Segmentierung aus, und passen Sie den Wert von H/S/Ian, sodass der normale Teil der Gehirnscheiben vom schwarzen Hintergrund getrennt wird. 06:45-07:10
- Zurück zur Anzahl | Größe und klicken Sie auf Zählen, um diesen Bereich zu berechnen. 07:11-07:21
- Klicken Sie in Bearbeiten auf Objekte teilen, um das Gehirn von der Mittellinie zu trennen. Die Software unterscheidet automatisch den linken und rechten Hirnbereich. 07:22-08:08
- Vorbehandlung des Fotos mit Photoshop-Software
- Berechnen des Infarktvolumens (%) infarkt und verkleinert Volumen (%):
Infarktvolumen (%) = [rechter Infarktbereich/(2 x linker Hirnbereich)] x 100.
Infarkt- und Schrumpfvolumen (%) = [(linker Hirnbereich - rechter Gesundheitshirnbereich) / (2 x linker Hirnbereich)] x 100.
HINWEIS: Das rechte Gehirn ist der verletzte Teil. Die Daten wurden von der einwegigen ANOVA analysiert. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
4. Bewertung der sensorimotorischen Funktion
HINWEIS: Ratten (300 g, 3040 Gewindebolzen, 3 h Hirninfarktzeit) mit einem Longa-Score von 2 bis 3 wurden ausgewählt, um die sensorimotorischen Funktionsexperimente von 1-90 Tagen durchzuführen. Schweigen und die Tiere während dieser Studienzeit nicht stören. Die Daten wurden von zweiseitigen ANOVA analysiert. Die dargestellten Werte sind mittelwert s.D. P < 0,05 geben die Differenz an.
- Bilateraler Asymmetrietest11
- Papierband (5 cm lang, 0,8 cm breit) dreimal mit gleichem Druck auf den saftigen Teil jedes Foreclaw einer Ratte wickeln.
- Zeichnen Sie für jede Ratte auf, wie oft jeder Foreclaw kontaktiert und das Band in 5 min mit der Kamera entfernt wird, einschließlich nicht beeinflusster Pfotenzeiten und betroffener Pfotenzeiten.
- Nach 30 min wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 erneut.
- Berechnen Sie den Durchschnittswert der sensorimotorischen Verzerrung (%):
Sensorimotorische Verzerrung (%) = (unbeeinflusste Pfotenzeiten - betroffene Pfotenzeiten)/(unbeeinflusste Pfotenzeiten + betroffene Pfotenzeiten) x 100
- Grid-Walking-Test
- Legen Sie die Ratte in der Mitte einer erhöhten Gitterfläche (Fläche: 1 m2; Höhe: 90 cm) mit Gitteröffnungen von 2,5 cm2.
- Drücken Sie die Hüften der Ratte leicht, um die Ratte zu ermutigen, die Gitteroberfläche zu durchqueren.
- Zeichnen Sie die Anzahl der Fußfehler auf, die von den nicht betroffenen (rechts) und betroffenen (linken) Gliedmaßen und der Gesamtzahl der Schrittzahlen in 1 min mit der Kamera gemacht wurden.
- Berechnen Sie die Fehlerzeiten:
Fehlerzeiten (%) = [unbeeinflusste (rechte) Gliedmaße - betroffene (linke) Gliedmaße]/Gesamtschrittnummer x 100.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Schritte unter 20-Schritte-Daten wurde entfernt.
- Rotarod-Test12,13
- Richten Sie das Rattendrehstab-Ermüdungsgerät (Durchmesser 90 mm) von Ratten mit der unterstützenden Software auf eine Geschwindigkeit von 13 Umdrehungen pro Minute über einen Zeitraum von 5 min am Computer ein.
- Starten Sie die Computerprogramme und legen Sie die Ratte gleichzeitig auf die Rotarod-Sprossen.
- Beenden Sie eine Studie, wenn die Ratte von der Sprosse fällt oder 5 min weiterläuft und die rotierende Zeit aufzeichnet.
- Lassen Sie die Ratte 30 min ruhen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3.2-4.3.4 zweimal und wählen Sie den maximalwert aus, der die letzte Drehzeit sein soll.
- Hebeseilprüfung14
- Legen Sie das Hebeseilinstrument (70 cm hoch; das Seil hat einen Durchmesser von 0,2 cm und 40 cm lang) auf den Schreibtisch.
- Lassen Sie die Ratte das Seil mit ihren Vorderbeinen greifen und hängen Sie die Ratte auf.
- Zeichnen Sie die Zeit des Aufhängens auf und berechnen Sie die Partituren.
ANMERKUNG: Eine Punktzahl von 3: 0 x 2 s am Seil; Eine Punktzahl von 2: 3 x 4 s am Seil; Eine Punktzahl von 1: 5-6 s am Seil; Eine Punktzahl von 0: mehr als 7 s am Seil.
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Representative Results
Verwendung des oben genannten Verfahrens für ein MCAO/R-Modell mit Longa-Punktzahl und TTC-Färbung, verschiedene Behandlungen mit mittlerem Gewicht (275/300/320 g), Schraubentypen (2636/2838/3040/3043; Tabelle 1) und ischämische Zeiten (2-3 h) und 1 Tag Reperfusion wurden verwendet, um für das optimale Gehirn Ischämie-Modell bei Ratten zu überprüfen. Modellparameter mit 300 g Gewicht, 3040 Gewindebolzen und 3 h Hirninfarktzeit waren am besten geeignet für den größten Hirninfarkt, die höchste Longa-Punktzahl und das größte Modellerfolgsverhältnis. Dies wurde bei der konventionellen Behandlung eines 275 g Gewichts, 2636 Gewindebolzens und 2 h Hirninfarktzeit(Abbildung 1) deutlich verbessert.
Darüber hinaus wurden Ratten mit 300 g Gewicht, 3040 Gewindebolzen, 3 h Hirninfarktzeit und einem Longa-Score von 2 bis 3 sensorimotorischen Funktionstests (bilateraler Asymmetrietest, Gitter-Walking-Test, Rotarod-Test und Hebeseiltest) und TTC-Färbung unterzogen, um die Erholung zu untersuchen. Status der Gehirn-Ischämie von 1-90 Tagen. Das Infarkt- und Schrumpfvolumen betrug 23,4 %, 19,6 %, 16,1 %(P < 0,01, verglichen mit dem ersten Tag) und 15,7 %(P < 0,01, verglichen mit dem ersten Tag) nach 1, 35, 60 und 90 Tagen nach MCAO/R(Abbildung 2). Am ersten Tag nach MCAO/R war das Infarktvolumen am größten. Mit der Zeit wurde das Infarktvolumen kleiner und das Schrumpfvolumen größer. Das Infarkt- und Schrumpfvolumen ändert sich nach 60 Tagen MCAO/R nicht mehr.
Die sensorimotorische Verzerrung im bilateralen Asymmetrietest, die Grid-Walking-Fehlerzeiten im Grid-Walking-Test und der Hubseil-Score im Hebeseiltest haben sich deutlich erhöht, während die Rotarod-Zeit im Rotarod-Test nach 1 signifikant abnahm. MCAO/R (Abbildung 3), der darauf hindeutete, dass alle vier Tests im Stadium der akuten Hirnischämie sinnvoll waren. Allerdings hielten nur die sensorimotorische Voreingenommenheit große Funktionsstörungen mit einer zeitabhängigen Art und Weise nach 35, 60 und 90 Tagen MCAO/R aufrecht. Es gab signifikante Unterschiede bei den Grid-Walking-Fehlerzeiten im Grid-Walking-Test nach 35 und 60 Tagen MCAO/R. Diese Ergebnisse zeigten, dass der bilaterale Asymmetrietest und der Grid-Walking-Test geeignete sensorimotorische Funktionstests für das Stadium der Erholung und Fortsetzungen bei Ratten sein könnten.
Abbildung 1: 300 g Gewicht, 3040 Gewindebolzen, 3 h Hirninfarktzeit kann der optimale Zustand der durch MCAO/R induzierten ischämischen Hirnverletzung sein. (A,B) Bilder und Kartogramm des Infarktvolumens des Hirngewebes (n = 9-12). (C) Longas Punktzahl (n = 9-12). (D) Die Statistiken über das Modellerfolgsverhältnis von Ratten (n = 10-15). Modellerfolgsverhältnis = (Gesamtzahl der Ratten - Todesratten nach MCAO/R - Ausfallratten nach MCAO/R)/Gesamtanzahl der Ratten. Ausfallratten sind die Modellratten, die keine geeignete Longa-Punktzahl haben. Fehlerbalken stellen S.D., *P < 0.05, **P < 0.01. Diese Zahl wurde von Liu et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das Infarkt- und Schrumpfvolumen verringerte sich schrittweise von 1 auf 90 Tage nach MCAO/R. (A) Die TTC-Färbung von Rattenhirngewebe. (B) Das Kartogramm des Infarkts und des Schrumpfvolumens (n = 16-19). Fehlerbalken stellen S.D., **P < 0,01 gegenüber dem ersten Tag nach MCAO/R dar. Diese Zahl wurde von Liu et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bilateraler Asymmetrietest und Grid-Walking-Test waren die geeigneten sensorimotorischen Funktionstests in der Erholungs- und Fortsetzungsphase der Gehirnischämie. (A) Die rechte Gliedmaße reißt Günstigkeit in Debonding-Experiment. (B) Die Fehlerzeiten beim Grid-Walking-Test. (C) Die Dauer im Rotarod-Test. (D) Die Punktzahl im Hebeseiltest. Fehlerbalken stellen S.D., n = 15-19, *P < 0,05, ***P < 0,001 dar. Diese Zahl wurde von Liu et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Typ | Der Durchmesser der Gewindeschraube | Der Durchmesser des Gewindeschraubenkopfes | Empfohlenes Gewicht der Ratte | Ebene |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | >400 g | A4 |
| Hinweis: A4-Gewindebolzen sind der Standard, dass das Kopfende halbkugelförmig ist, das Frontend mit Polylysin bedeckt ist, markiert, sterilisiert und Buy-on-Use ohne Behandlung (Diese Tabelle wurde von Liu et al., 2018 geändert). | ||||
Tabelle 1: Thread-Blot-Informationen. Diese Tabelle wurde von Liu et al.15geändert.
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Discussion
Viele Modelle, die Methoden und Verhaltensindikatoren, die gut in akuten zerebralen Ischämie verwendet werden möglicherweise keine signifikanten Veränderungen in der Erholung und Fortsetzung Sephase der GehirnIschämie16,17. Jedoch, die Zahl der Patienten mit Gehirn ischämische in der Genesung und Sequela-Stadien ist die größte. Es ist wichtig, ein geeignetes Tiermodell für die Erholung und Fortsetzung von Ischämie-Schlag zu wählen.
Wir verwenden das MCAO/R-Modell bei Ratten, um das geeignete Gewicht von Ratten (260-330 g), die Art der Gewindeschraube (2636/2838/3040/3043) und die Zeit des Hirninfarkts (2-3 h) auf die schwerste Infarktverletzung, ein hohes Modellerfolgsverhältnis und sichtbare Verhaltensindikatoren zu überprüfen. , die für die Erholung und Fortsetzung se Stadien der Gehirn-Ischämie geeignet sein wird.
Ratten, die 300 g mit einem 3040 Gewindebolzen und 3 h Hirninfarktzeit wiegen, haben größere Infarktvolumina, schwerere Verhaltensstörungen und ein größeres Modellerfolgsverhältnis (Abbildung 1). Darüber hinaus haben wir Validierungsmethoden dieses Rattenmodells durch TTC-Färbungs- und sensorimotorische Funktionstests (bilateraler Asymmetrietest, Grid-Walking-Test, Rotarod-Test und Hebeseiltest) 1-90 Tage nach der Reperfusion bereitgestellt. Wir fanden heraus, dass der bilaterale Asymmetrietest und der Grid-Walking-Test verwendet werden könnten, um die Erholungs- und Fortsetzungsstadien der Ischämie zu erforschen, da die signifikanten Unterschiede dieser Indikatoren 90 Tage bzw. 60 Tage dauern. Je größer der Infarkt und das Schrumpfvolumen ist, desto gravierender sind die sensorimotorischen Defizite, die in Abbildung 2 und Abbildung 3zu sehen sind.
Diese Methode ist vor allem für Gehirn Ischämie durch MCAO verursacht geeignet. Das Modell weist jedoch Unterschiede in den Hirnanatomen zwischen Menschen und Ratten auf, wie z. B. den Grad der Kollateralzirkulation. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Wiederherstellung weißer Stoffe nicht durch TTC-Färbung gesehen werden kann. Weitere Untersuchungen der Kollateralzirkulation und der Wiederherstellung von Weißmaterie mit MR-Bildgebung oder anderen Methoden können den Vorhersagewert dieses Modells bestätigen.
Die wichtigste Sache ist, dass die Fähigkeit, ein MCAO/R-Modell bei Ratten zu erstellen, nicht einfach ist und Übung erfordert. Bestätigen Sie vor dem Experiment ein akzeptables und paralleles Modellerfolgsverhältnis. Weitere Instrumente und Methoden werden benötigt, um die sensorimotorische Funktion in den Erholungs- und Sequela-Stadien des Schlaganfalls zu testen. Wenn eine schwierigere Aufgabe, wie die Erhöhung der Geschwindigkeit von 10 auf 30 Rpm verwendet wurde, kann eine längere Zeit des Defizits in der Rotarod-Test auftreten. Andere Verhaltenstests können auch für dieses Modell geeignet sein, z. B. Gangerkennung. Genauere Detektionsmethoden sollten für Patienten in den Phasen der Erholung und DerFolge der Gehirn-Ischämie verwendet werden, die die Wirkung von Medikamenten oder anderen therapeutischen Werkzeugen identifizieren kann.
Als neues Tiermodell zur Erforschung der Gehirnischämie in den Phasen der Genesung und Der Fortsetzung ist die hier vorgestellte Methode sinnvoll und verdient Popularisierung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81603315, 81603316), Schlüssel F & E-Plan der Provinz Jiangxi in China (20171ACH80001), industrielle und akademische Kooperationsprojekte in Hochschulen und Universitäten der Provinz Fujian in China (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
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