Summary
Lo scopo di questo studio è quello di stabilire e convalidare un modello animale per la ricerca nelle fasi di recupero e sequela dell'ischemia cerebrale testando l'infarto cerebrale e la funzione motoria sensoriale dopo l'occlusione/reperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) dopo 1-90 giorni in ratti.
Abstract
Lo scopo di questo studio era quello di stabilire e convalidare un modello di ischemia del cervello animale nelle fasi di recupero e sequela. È stato scelto un modello di occlusione/reperfusione cerebrale centrale (MCAO/R) nei ratti Maschi Sprague-Dawley. Cambiando il peso del ratto (260-330 g), il tipo di bullone del filo (2636/2838/3040/3043) e il tempo infarto del cervello (2-3 h), un punteggio di Longa più alto, un volume infarto più grande e un maggiore rapporto di successo del modello sono stati sottoposti a screening utilizzando il punteggio di Longa e la colorazione TTC. La condizione ottimale del modello (300 g, 3040 bulloni di filo, tempo infarto cerebrale 3 h) è stata acquisita e utilizzata in un periodo di osservazione di 1-90 giorni dopo la riperfusione attraverso la valutazione delle funzioni motorie e del volume infarto. A queste condizioni, il test di asimmetria bilaterale ha avuto una differenza significativa da 1 a 90 giorni e il test di camminata alla griglia ha avuto una differenza significativa da 1 a 60 giorni; entrambe le differenze potrebbero essere un adeguato test funzionale del sensomotorio. Così, è stata trovata la condizione più appropriata di un nuovo modello di ratto nelle fasi di recupero e sequela dell'ischemia cerebrale: 300 g di ratti che hanno subito MCAO con un bullone a filo 3040 per un infarto cerebrale 3 h e poi riperfusi. I test funzionali sensomotori appropriati sono stati un test di asimmetria bilaterale e un test di grid-walking.
Introduction
L'ischemia cerebrale è divisa in tre fasi con diversi indicatori post-ictus: la fase acuta (entro 1 settimana), la fase di recupero (da 1 settimana a 6 mesi) e la fase di sequelae (più di 6 mesi). Attualmente, la maggior parte degli studi si concentrano sullo stadio acuto dell'ischemia cerebrale a causa del suo effetto significativo e dei modelli di ricerca multi-relativi1,2,3. Tuttavia, le fasi di recupero e sequele dell'ischemia cerebrale non possono essere ignorate a causa della loro complicazione a lungo termine delle disabilità. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di esplorare un modello animale stabile, affidabile e relativamente semplice per ricercare il recupero e le fasi sequela dell'ischemia cerebrale.
Tra i molti modelli sperimentali di ischemia cerebrale, usiamo l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) tramite l'inserimento del bullone filo nell'arteria cerebrale centrale destra (MCA). Questo modello è simile all'ictus umano, che può produrre volumi infarto più grandi, provocare molti disturbi comportamentali legati all'ictus e può consentire la riperfusione di sangue (R) rimuovendo il bullone del filo4,5,6. MCAO/R è anche considerato il modello animale oro standard di ischemia del cervello7. Inoltre, la gravità della lesione cerebrale dipende dal diametro e dalla lunghezza di inserimento del bullone del filo, dalla durata dell'ischemia cerebrale e dal peso animale (i ratti più grandi hanno cervelli più grandi e vasi cerebrali più spessi)8. Pertanto, cambiando il tipo di bullone filo, il tempo infarto, e il peso del ratto, un modello adatto può essere trovato per il recupero e le fasi sequela di ischemia cerebrale nei ratti MCAO / R. Per convalidare il modello di ratto, abbiamo eseguito uno studio di 1 giorno, 35 giorni, 60 giorni e 90 giorni del modello MCAO/R utilizzando esperimenti di colorazione ETC e funzione sensoriale (un test di asimmetria bilaterale, un test di camminata alla griglia, un test di rotazione e un test di sollevamento).
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Protocol
La procedura e l'uso di soggetti animali sono stati approvati dall'Istituto Nazionale della Salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Questo protocollo è specificamente regolato per i test di occlusione/reperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) e della funzione sensomotoria.
1. Progettazione sperimentale e raggruppamento
- Utilizzare un modello di ratto MCAO/R per vagliare un metodo del modello ischemico del cervello del ratto con lesioni cerebrali più gravi e un maggiore rapporto di successo del modello utilizzando il punteggio di Longa e la colorazione TTC.
- Esegui l'esperimento sui ratti Maschi Sprague-Dawley del peso di 260-330 g che hanno 7-9 settimane di età. Il peso reale del ratto è di 275 x 15 g per 275 g, 300 x 10 g per 300 g, e 320 x 10 g per 320 g.
- Utilizzare i seguenti sette raggruppamenti (peso, tipo di bullone filo, tempo di infarto): gruppo 1 con 15 ratti (275 g, 2636, 2 h); gruppo 2 con 15 ratti (275 g, 2636, 3 h); gruppo 3 con 15 ratti (275 g, 2838, 2 h); gruppo 4 con 15 ratti (275 g, 2838, 3 h); gruppo 5 con 13 ratti (300 g, 3040, 3 h); gruppo 6 con 10 ratti (320 g, 3040, 3 h); gruppo 7 con 13 ratti (300 g, 3043, 3 h).
- Studiare lo stato di recupero del cervello mediante colorazione TTC e utilizzare adeguati test di funzione sensomotoria per indicare i deficit funzionali a lungo termine dal test di asimmetria bilaterale, test di marcia a griglia, test di rotazione e test di corda di sollevamento dopo 1, 35, 60, 90 giorni di MCAO/R.
- Usa i ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 300 x 10 g che hanno 8-9 settimane di età.
- Utilizzare i seguenti cinque raggruppamenti: un gruppo di controllo (normale) con 20 ratti; un gruppo di 1 giorno con 16 ratti; un gruppo di 35 giorni con 16 ratti; un gruppo di 60 giorni con 17 ratti; e un gruppo di 90 giorni con 19 ratti.
- Dopo il punteggio del Longa nei test funzionali step 1.1 o sensorimotori al passaggio 1.2, anasizzare e decapitare tutti i ratti per la colorazione TTC.
2. Istituzione di un modello MCAO/R unilaterale nei ratti9
NOTA: Durante l'operazione, utilizzare delicatamente le micropinze per evitare la rottura del vaso sanguigno. Evitare danni ai nervi e altri vasi sanguigni nel collo del ratto quando il vaso è isolato. Occorre prestare attenzione a presentare un'adeguata tecnica asettica per tutte le procedure chirurgiche di sopravvivenza. La tecnica illustrata più avanti nel video dovrebbe essere praticata attraverso l'intera procedura.
- Durante l'intervento, mantenere la temperatura corporea dei ratti a 37,0 e 0,5 gradi centigradi in un piccolo termostato animale. Preparare quattro suture 6 cm 5-0.
- Impostare la portata dell'ossigeno di una piccola macchina per l'anestesia animale (con un dispositivo di trattamento dei gas di scarico) a 0,4,6 L/min e la concentrazione di isoflurane è del 5%. Posizionare il ratto nella macchina per l'anestesia.
- Dopo che l'animale è svenuto, posiziona il topo su un tavolo di fissaggio chirurgico. Collegare la bocca del ratto alla maschera della macchina per l'anestesia (la portata dell'ossigeno rimane invariata; regolare la concentrazione di isoflurane in modo che sia 3%). Confermare che l'animale è entrato in anestesia profonda osservando una mancanza di tensione dell'estremità, riflessi corneali e dolore.
- Fissare gli arti per sdraiarsi sul tavolo operatorio con bende di carta (o altri strumenti).
- Rimuovere il collo con un rasoio elettrico e sterilizzare con 75% alcol (iodophor è meglio). Fissare la bocca del topo con un gancio.
- Tagliare 2/3 cm lungo la forma longitudinale centrale del collo con forbici oftalmiche.
- Separare l'arteria carotide comune. Separare il muscolo sottocutaneo con pinze oftalmiche. Utilizzare retrattore fatto in casa per esporre completamente il campo visivo. Dopo aver separato il muscolo anteriore della trachea con le pinze oftalmiche, separare lungo il tendine sternocleidomastoide destro fino a quando non è visibile l'arteria carotide comune.
- Isolare l'arteria carotide comune, l'arteria carotide esterna e l'arteria carotide interna con pinze oftalmiche. Ligate l'arteria carotide comune (nodo duro), l'arteria carotide esterna lontana dall'estremità del cuore (nodo duro) e l'arteria carotide interna (nodo sciolto) con suture 5-0. Foderare l'arteria carotide esterna vicino all'estremità del cuore con 5-0 suture.
- Inserire un bullone di filettatura. Tagliare una piccola apertura nell'arteria carotide esterna utilizzando forbici oftalmiche e inserire delicatamente un bullone filo. Legate la sutura dell'arteria carotide esterna che è stata in nodo sciolto e tagliare l'arteria carotide esterna.
- Allenta il nodo sciolto dell'arteria carotide interna e continua a inserire il bullone del filo all'inizio dell'arteria cerebrale centrale (sutura marcata). Quindi tagliare il bullone filo esposto.
- Una volta raggiunto il tempo ischemico (2-3 h), fissare la frattura dell'arteria carotide esterna con una microforza, e tirare delicatamente il bullone del filo con un'altra microforza. Quando l'estremità anteriore del bullone filo è completamente ritirato dall'arteria carotide interna, si legano l'arteria carotide esterna che era rivestita con suture 5-0, e quindi estrarre completamente il bullone del filo.
- Allenta l'arteria carotide comune, e daub 50.000 U di polvere di sodio penicillina sulla superficie della ferita per prevenire l'infezione. Sutura muscoli sottocutanei e pelle con 4 suture.
- Dare a 0,2 mL di salina sterile al ratto per via orale utilizzando una siringa da 1 mL (l'iniezione SQ-PEN è meglio) per evitare la carenza di acqua postoperatoria dopo aver rimesso il ratto nella gabbia.
- Scegli gli animali dopo 24 ore di reperfusione in base al punteggio del Longa10. Seleziona gli animali con il punteggio di un Longa di 1/3 per la prossima colorazione TTC nel passaggio 1.1 e gli animali con un punteggio di 2x3 per lo studio di 1, 35, 60, 90 giorni nel passaggio 1.2.
NOTA: Punteggio di Longa10: 0 punteggio, nessun deficit neurologico; 1 punteggio, mancata estensione del foreclaw sinistro; 2 punteggio, girando a sinistra; 3 punteggio, cadendo a sinistra; 4 punteggio, non può camminare spontaneamente e ha una coscienza depressa. - Analizza il punteggio del Longa con ANOVA a senso unico. I valori visualizzati rappresentano la media: S.D. P < 0,05 indicano la differenza.
3. Colorazione TTC
NOTA: La muffa e la lama della fetta di cervello del ratto devono essere pre-raffreddati in un frigorifero -20 gradi centigradi prima dell'uso per evitare l'adesione causata da una grande differenza di temperatura. Durante la colorazione, prevenire l'adesione tra le fette del cervello e la piastra di coltura, che può provocare una colorazione insufficiente.
- Anestesizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale di 400 mg/kg di idrato clorale dopo il punteggio del Longa nel passaggio 1.1 o i test funzionali sensomotori al punto 1.2.
- Decapitare il ratto con forbici chirurgiche o con un apparato di decapitazione del ratto. Rimuovere il cervello con forbici chirurgiche e pinze emostatiche.
- Mettere il cervello in frigorifero a -20 gradi centigradi per 30 min per facilitare il taglio.
- Rimuovere il cervello dal frigorifero e metterlo in stampo fetta di cervello ratto pre-raffreddato. Tagliare il cervello in sei sezioni consecutive spesse 2 mm con una lama pre-raffreddata.
- Macchia le sezioni con 2% di cloruro 5-trenyl-2H-tetrazolium (TTC) in una piastra di coltura a 6 pozzetti.
- Coltivano le sezioni per 30-60 min a 37 gradi centigradi in un letto agitato. Capovolgere le sezioni ogni 10 min fino a quando l'area ischemia del cervello e l'area normale sono chiaramente bianco e rosso.
- Linea il cervello fette verticalmente in ordine dalla parte posteriore alla parte anteriore del cervello. Utilizzare un righello per assicurarsi che la lunghezza totale di ogni riga sia la stessa. Scattare foto con la fotocamera digitale.
- Analizzare il volume infarto.
- Pre-trattamento della foto con il software photoshop
- Importare la foto utilizzando photoshop CS6. 00:00-00:14
- Fare clic su Seleziona per selezionare le sezioni del cervello, fare clic su Seleziona Inverso. 00:15-00:36
- Fare clic su Primo piano per selezionare nero e fare clic su OK. 00:37-00:42
- Premete Alt e Canc per riempire il colore di sfondo e PREmete ctrl e D per deselezionare. 00:43-00:46
- Fare clic su File . Salva sul desktop. 00:47-01:08
- Pre-trattamento della foto con il software Image Pro Plus.
- Apri il software Image Pro Plus 6.0 e importa la foto. 01:09-01:24
- Per la modifica dei difetti, regolare la luminosità con lo strumento Miglioramento contrasto, in modo che lo sfondo sia nero. 01:25-01:37
- Utilizzare lo strumento Mediana in Filtro per rimuovere le evidenziazioni. 01:38-01:46
- Calcola l'area sinistra (normale) del cervello con il software Image Pro Plus
- Selezionare il colore utilizzando Segmentazione e regolare il valore di H/S/I, in modo che le sezioni del cervello siano separate dallo sfondo nero. 01:47-02:12
- Ritorno al conteggio Dimensioni. 02:13-02:16
- Fare clic su Conteggio . Dividi oggetti in Modifica per separare il cervello dalla linea mediana. Il software distinguerà automaticamente le aree del cervello sinistro e destro. 02:17-02:49
- Calcola l'area destra del cervello infarto con il software Image Pro Plus
- Implementare il passaggio 3.8.1-3.8.2.Implement step 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
- Proprietà Select Count . Dimensioni. 03:15-03:21
- Fare clic su Disegna . Strumento Unisci oggetti in Modifica. Selezionare manualmente l'area ischemica e fare clic su Conta per calcolare l'area ischemica. 03:16-05:31
- Calcola l'area del cervello per la salute con il software Image Pro Plus
- Implementare il passaggio 3.8.1-3.8.2.Implement step 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
- Selezionare il colore utilizzando Segmentazione e regolare il valore di H/S/I, in modo che la parte normale delle sezioni del cervello sia separata dallo sfondo nero. 06:45-07:10
- Ritorno al conteggio Dimensione e fare clic su Conteggio per calcolare quest'area. 07:11-07:21
- Fare clic su Dividi oggetti in Modifica per separare il cervello dalla linea mediana. Il software distinguerà automaticamente le aree del cervello sinistro e destro. 07:22-08:08
- Pre-trattamento della foto con il software photoshop
- Calcolare il volume infarto (%) e infarto e ridurre il volume (%):
Volume infarto (%) : [area infarto destro/(2 x area cerebrale sinistra)] x 100.
Infarto e ridurre il volume (%) - [(area sinistra del cervello - zona del cervello di salute destra) / (2 x area sinistra del cervello)] x 100.
NOTA: Il cervello destro è la parte ferita. I dati sono stati analizzati da ANOVA unidirezionale. I valori visualizzati rappresentano la media: S.D. P < 0,05 indicano la differenza.
4. Valutazione della funzione sensomotoria
NOTA: Sono stati selezionati ratti (300 g, 3040 bulloni filo, tempo infarto cerebrale 3 h) con un punteggio Longa di 2/3 per eseguire gli esperimenti sulla funzione sensomotoria da 1 a 90 giorni. Stai zitto e non disturbare gli animali durante questo periodo di studio. I dati sono stati analizzati da ANOVA bidirezionale. I valori visualizzati rappresentano la media: S.D. P < 0,05 indicano la differenza.
- Test di asimmetria bilaterale11
- Avvolgere il nastro di carta (5 cm di lunghezza, 0,8 cm di larghezza) sulla parte saphenous di ogni pannidelo di un ratto tre volte con uguale pressione.
- Per ogni ratto, registrare il numero di volte in cui ogni foreclaw viene contattato e il nastro rimosso in 5 min con la fotocamera, inclusi i tempi delle zampe non interessate e i tempi delle zampe interessati.
- Dopo 30 min, ripetere nuovamente i passaggi 4.1.1 e 4.1.2.
- Calcolare il valore medio della distorsione sensomotoria (%):
Distorsione sensoriale (%) - (tempi delle zampe non influenzati - tempi delle zampe interessati)/(tempi delle zampe non interessati , paz time interessati) x 100
- Test di camminata alla griglia
- Posizionare il ratto al centro di una piattaforma di superficie griglia elevata (area: 1 m2; altezza: 90 cm) con aperture della griglia di 2,5 cm2.
- Spingere leggermente i fianchi del ratto per incoraggiare il ratto ad attraversare la superficie della griglia.
- Registrare il numero di guasti ai piedi causati dagli arti non interessati (a destra) e dagli arti colpiti (a sinistra) e il numero totale di passi in 1 min con fotocamera.
- Calcolare i tempi di errore:
Tempi di errore (%) - [arto non interessato (a destra) - arto (sinistro)]/numero di passo totale x 100.
NOTA: il numero totale di passaggi al di sotto dei dati di 20 fasi è stato rimosso.
- Test di Rotarod12,13
- Impostare l'apparato di fatica della barra rotante del ratto (diametro 90 mm) dei ratti utilizzando il software di supporto ad una velocità di 13 rpm per un periodo di 5 min sul computer.
- Avviare i programmi per computer e posizionare il ratto sui gradini rotarod allo stesso tempo.
- Terminare una prova se il ratto cade dal podio o continua a camminare per 5 min e registrare il tempo di rotazione.
- Fai riposare il topo per 30 min.
- Ripetete i passaggi da 4,3,2 a 4,3,4 per due volte e scegliete il valore massimo come ultimo tempo rotante.
- Test di corda di sollevamento14
- Posizionare lo strumento a fune di sollevamento (70 cm di altezza; la corda ha un diametro di 0,2 cm e 40 cm di lunghezza) sulla scrivania.
- Chiedi al topo di afferrare la corda con gli arti anteriori e appendere il ratto.
- Registrare il tempo di sospensione e calcolare i punteggi.
NOTA: Un punteggio di 3: 0 s 2 sulla corda; Un punteggio di 2: 3 o 4 s sulla corda; Un punteggio di 1: 5-6 s sulla corda; Un punteggio di 0: più di 7 s sulla corda.
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Representative Results
Utilizzando la procedura di cui sopra per un modello MCAO/R con il punteggio di un Longa e la colorazione TTC, diversi trattamenti di peso medio (275/300/320 g), tipi di bulloni (2636/2838/3040/3043; Tabella 1) e i tempi ischemici (2-3 h) e 1 giorno di riperfusione sono stati utilizzati per lo screening per il modello di ischemia cerebrale ottimale nei ratti. I parametri del modello di 300 g di peso, 3040 bulloni filo, e 3 h tempo infarto cervello erano i più adatti per il più grande infarto cerebrale, più alto punteggio di Longa e il più grande rapporto di successo del modello. Questo è stato notevolmente migliorato sul trattamento convenzionale di un peso 275 g, 2636 bullone filo, e 2 h tempo infarto cervello (Figura 1).
Inoltre, i ratti con peso 300 g, 3040 bulloni del filo, 3 h tempo infarto del cervello e un punteggio di Longa di 2/3 hanno subito test di funzione motoria sensoriale (un test di asimmetria bilaterale, un test di marcia a griglia, un test di rotazione e un test della corda di sollevamento) e una colorazione TTC per studiare il recupero stato di ischemia cerebrale da 1-90 giorni. L'infarto e il volume ridotto sono stati del 23,4%, del 19,6%, del 16,1% (P < 0,01 rispetto al primo giorno) e del 15,7% (P < 0,01, rispetto al primo giorno) rispettivamente dopo 1, 35, 60 e 90 giorni dopo MCAO/R (Figura 2). Il primo giorno dopo MCAO/R, il volume infarto era il più grande. Nel tempo, il volume infarto è diventato più piccolo e il volume ridotto è diventato più grande. L'infarto e il volume ridotto non vengono più modificati dopo 60 giorni di MCAO/R.
La distorsione sensoriale nel test di asimmetria bilaterale, i tempi di errore di marcia nella griglia nel test di marcia in griglia e il punteggio della corda di sollevamento nel test della corda di sollevamento sono aumentati significativamente, mentre il tempo di rotazione nel test di rotazione è diminuito significativamente dopo 1 giorno di MCAO/R(Figura 3), che ha indicato che tutti e quattro i test erano significativi nella fase di ischemia cerebrale acuta. Tuttavia, solo la distorsione sensomotoria ha mantenuto grandi disturbi funzionali con un modo dipendente dal tempo dopo 35, 60 e 90 giorni di MCAO/R. Ci sono state differenze significative di tempi di errore di grid-walking nel test di grid-walking dopo 35 e 60 giorni di MCAO / R. Questi risultati hanno indicato che il test di asimmetria bilaterale e il test di marcia a griglia potrebbero essere adeguati test di funzione sensomotoria per lo stadio di recupero e sequela nei ratti.
Figura 1: 300 g di peso, 3040 bulloni filo, 3 h tempo infarto cerebrale può essere la condizione ottimale della lesione ischemica cerebrale indotta da MCAO / R. (A,B) Immagini e cartogramma del volume infarto del tessuto cerebrale (n. 9-12). (C) Punteggio di Longa (n - 9/12). (D) Le statistiche del rapporto di successo del modello dei ratti (n - 10/15). Rapporto di successo del modello (numero totale di ratti - ratti mortali dopo MCAO/R - ratti guasti dopo MCAO/R)/numero totale di ratti. I ratti guasto sono i ratti modello che non hanno un punteggio di Longa adatto. Le barre di errore rappresentano S.D.,P < 0.05,. Questa cifra è stata modificata da Liu etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'infarto e il ridurre il volume sono diminuiti gradualmente da 1 a 90 giorni dopo MCAO/R. (A) La colorazione TTC del tessuto cerebrale del ratto. (B) Il cartogramma dell'infarto e del volume ridotto (n - 16-19). Le barre di errore rappresentano S.D.,P < 0.01 rispetto al primo giorno successivo a MCAO/R. Questa cifra è stata modificata da Liu etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Test bilaterale di asimmetria e test di marcia a griglia sono stati i test di funzione sensomotoria adatti nella fase di recupero e ripresa dell'ischemia cerebrale. (A) L'arto destro strappare favoribilità nell'esperimento di debonding. (B) I tempi di errore di marcia a griglia nel test di grid-walking. (C) Il periodo di tempo nella prova di rotazione. (D) Il punteggio nel sollevamento della fune. Le barre di errore rappresentano S.D., n : 15/19,P < 0,05, . Questa cifra è stata modificata da Liu etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| digitare | Il diametro del bullone del filo | Il diametro della testa del bullone del filo | Peso raccomandato di ratto | Livello |
| 2636 | 0,26 mm | 0,36 mm | 250-280 g | A4 |
| 2838 | 0,28 mm | 0,38 mm | 280-350 g | A4 |
| 3040 | 0,30 mm | 0,40 mm | 360-400 g | A4 |
| 3043 | 0,30 mm | 0,43 mm | >400 g | A4 |
| Nota: Bullone filo a4 livello è lo standard che l'estremità della testa è emisferica, l'estremità anteriore è coperto con poli-lisina, marcato, sterilizzato, e buy-on-use senza alcun trattamento (Questa tabella è stata modificata da Liu et al., 2018). | ||||
Tabella 1: informazioni sulla macchia del filetto. Questa tabella è stata modificata da Liu etal.
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Discussion
Molti modelli che stabiliscono metodi e indicatori comportamentali che sono ben utilizzati in ischemia cerebrale acuta non possono avere cambiamenti significativi nelle fasi di recupero e sequela di ischemia cerebrale16,17. Tuttavia, il numero di pazienti con ipomia cerebrale nelle fasi di recupero e sequela è il più grande. È essenziale selezionare un modello animale adatto per le fasi di recupero e sequela di ictus ischemia.
Usiamo il modello MCAO/R nei ratti per vagliare il peso adatto dei ratti (260-330 g), il tipo di bullone del filo (2636/2838/3040/3043) e il tempo di infarto cerebrale (2-3 h) per le lesioni infarto più gravi, un alto rapporto di successo del modello, e indicatori comportamentali , che sarà adatto per il recupero e le fasi sequelae di ischemia cerebrale.
I ratti che pesano 300 g con un bullone di 3040 fili e il tempo infarto del cervello di 3 h hanno volumi infarto maggiori, difetti comportamentali più gravi e un maggiore rapporto di successo del modello (Figura 1). Inoltre, abbiamo fornito metodi di convalida di questo modello di ratto mediante test di colorazione e funzione sensomotoria TTC (test di asimmetria bilaterale, test di marcia a griglia, test di rotazione e test della fune di sollevamento) 1-90 giorni dopo la riperfusione. Abbiamo scoperto che il test bilaterale di asimmetria e il test di marcia a griglia potrebbero essere utilizzati per ricercare le fasi di recupero e sequela dell'ischemia, perché le differenze significative di questi indicatori durano rispettivamente 90 e 60 giorni. Più grande è l'infarto e il volume ridotto, più gravi sono i deficit sensomotori, che possono essere visti in Figura 2 e Figura 3.
Questo metodo è adatto principalmente per l'ischemia cerebrale causata da MCAO. Tuttavia, il modello ha differenze nelle anatomie cerebrali tra gli esseri umani e i ratti, come il grado di circolazione collaterale. Un'altra limitazione è che il recupero della materia bianca non può essere visto dalla colorazione TTC. Ulteriori studi sulla circolazione collaterale e il recupero della materia bianca con imaging MR o altri metodi possono confermare il valore predittivo di questo modello.
La cosa più critica è che l'abilità di creare un modello MCAO / R nei ratti non è facile e richiede pratica. Prima dell'esperimento, confermare un rapporto di successo del modello accettabile e parallelo. Sono necessari più strumenti e metodi per testare la funzione sensomotoria nelle fasi di recupero e sequela della corsa. Se è stato utilizzato un compito più difficile, come aumentare la velocità da 10 a 30 giri/min, nella prova di rotazione può comparire un periodo di deficit più lungo. Altri test comportamentali possono essere adatti anche per questo modello, come il rilevamento dell'andatura. Metodi di rilevamento più precisi dovrebbero essere utilizzati per i pazienti nelle fasi di recupero e sequela di ischemia cerebrale, che può identificare l'effetto di farmaci o altri strumenti terapeutici.
Come nuovo modello animale per studiare l'ischemia cerebrale nelle fasi di recupero e sequela, il metodo qui presentato è significativo e merita la divulgazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81603315, 81603316), dal piano Key R & D della provincia di Jiangxi in Cina (20171ACH80001), progetti di cooperazione industriale e accademica in college e università della provincia di Fujian in Cina (2018Y41010011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical Microscope | Leica (Germany) | S8 | Microscopic operating instrument |
| Blade | Gellette | / | Cutting brain sections |
| Constant Temperature Shaking Bed | Taicang Experimental Equipment Factory | THZ-C | To keep the brain sections stained evenly and at a constant temperature |
| Digital Camera | Canon | 700D | For taking pictures of TTC staining |
| Electric Shaver | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 3000# | Removal of hair from the neck of rats |
| Forceps Hamostatic | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 14 cm | Using for brain removing |
| Image Pro Plus Software | Media Cybernetics Inc. | 6.0 | Analyze the infarct volume |
| Isoflurane | RWD Life Science | 217170702 | Anesthetic gas |
| Microforceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Microshear | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Vascular micromanipulation |
| Ophthalmic Forceps | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Auxiliary skin and muscle anatomy |
| Pphthalmic Scissors | Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd. | 10 cm | Using for cutting the skin of neck |
| Rat Brain Slice Mold | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | 400 g | For standard, uniform cutting of brain tissue |
| Rat Rotating Bar Fatigue Apparatus | Anhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd. | ZH-300B | To test the sensorimotor function |
| Small Animal Anaesthesia Machine | Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd. | ABM3000 | A gas anesthetic machine |
| Small Animal Thermostat | Beijing Damida Technology Co., Ltd. | DM.7-YLS-20A | To maintain animal body temperature constant during operation |
| Surgical Scissors | Shanghai Medical device Co., Ltd. | 16 cm | Using for decapitate and brain removing |
| Suture | Shanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd. | 4-0 / 5-0 | Using for skin and muscle sutures / Using for vascular ligations |
| Thread Bolt | Beijing Cinontech Co. Ltd. | 2636/2838/3040/3043-A4 | Blockage of the middle cerebral artery in rats |
| 5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride (TTC) | Sigma | LOT#BCBP3272V | Brain section staining reagent |
References
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