Summary
Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón para estudiar malassezia-host interacciones en la piel. Describe el cultivo de Malassezia in vitro, la infección de la piel murina con Malassezia,y el análisis posterior de la inflamación y la carga fúngica en el tejido de la piel.
Abstract
Los modelos animales son cruciales para la investigación de enfermedades infecciosas. Proporcionan una base importante para analizar todo el espectro de interacciones que se producen entre los microbios y su huésped in vivo de una manera específica del tejido. Los hongos patógenos son cada vez más reconocidos como una seria amenaza para los seres humanos y la explotación de estos modelos de infección ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de la patogenicidad fúngica. Las especies del género Malassezia son los hongos más abundantes de la microbiota de la piel humana y también se asocian con el desarrollo de trastornos inflamatorios graves de la piel como la dermatitis seborreica y la dermatitis atópica. Sin embargo, se desconoce un vínculo causal entre Malassezia y la patogénesis de la enfermedad, un hecho que puede atribuirse al mal conocimiento de la compleja conversación cruzada de Malassezia con el sistema inmunitario de la piel. Este protocolo describe el establecimiento de un modelo experimental de ratón que permite estudiar la interacción de Malassezia con la piel de mamífero in vivo. Describe el método para el cultivo de Malassezia spp. en condiciones de laboratorio, cómo infectar la piel murina con Malassezia spp. y cómo evaluar el resultado de la infección mediante la inflamación de la piel y los análisis de carga de hongos. El modelo descrito aquí funciona en animales totalmente inmunocompetentes y no se basa en el pretratamiento inmunosupresor o antibiótico de los animales. Además, es adaptable a prácticamente todas las cepas de ratón modificadas genéticamente y se puede combinar con otros modelos de enfermedades de la piel. Estas características hacen de este modelo de infección una herramienta muy poderosa para estudiar en detalle la respuesta inmune innata y adaptativa del huésped contra Malassezia en la piel in vivo.
Introduction
La piel está poblada por muchos microbios diferentes. La exposición constante de la piel a la microbiota contribuye a dar forma y educar el sistema inmunológico del huésped. Los hongos son cada vez más reconocidos como una parte vital de la microbiota y cumplen un papel importante para la fisiología e inmunidad del huésped, similar a las bacterias y los virus1. Las especies del género Malassezia son con diferencia los hongos más abundantes colonizando la piel de los vertebrados de sangre caliente y conforman más del 90% del micobioma de la piel humana2,3. Dieciocho especies diferentes de Malassezia han sido identificadas hasta ahora a partir de la piel humana y animal4.
Se cree que surgen varias patologías de la piel, al menos parcialmente, como resultado de una composición de microbiota desequilibrada. La disbiosis puede conducir al crecimiento excesivo de especies con potencial patógeno que resulta en infecciones oportunistas y enfermedad5. Consistentemente, hay una creciente evidencia de que Malassezia,además de su estilo de vida commensal, contribuye al desarrollo de diversas patologías de la piel, que van desde la caspa y la pityriarsis versicolor a trastornos inflamatorios más graves como como dermatitis seborreica y dermatitis atópica4,6. Si bien se ha establecido un vínculo causal entre Malassezia y pityriarsis versicolor, el papel fisiopatológico del hongo en patologías cutáneas más severas sigue siendo en gran medida desconocido.
Determinar el papel de Malassezia en la homeostasis de la piel y la enfermedad requiere un conocimiento más profundo sobre la interacción del hongo con la piel y el sistema inmunológico cutáneo. Cabe destacar que la investigación sobre Malassezia es, en comparación con otros patógenos fúngicos humanos (por ejemplo, Candida albicans o Aspergillus fumigatus),todavía en la etapa incipiente. Esto se puede atribuir a la dificultad en el cultivo de Malassezia en condiciones de laboratorio y a la falta de modelos experimentales adecuados para el estudio del hongo en contacto con el huésped in vivo. Experimentos anteriores con células aisladas en cultivo indicaron una amplia gama de interacciones directas e indirectas entre Malassezia y varias células inmunes y no inmunes7. Sin embargo, estos experimentos in vitro sólo recapitulan parcialmente la situación del entorno cutáneo complejo in vivo donde se producen numerosos eventos celulares y moleculares de forma concomitante entre el hongo y varios tipos celulares.
Aquí, delineamos el protocolo para un modelo experimental de infección cutánea de Malassezia en ratones, que establecimos recientemente, para estudiar la interacción hongo-huésped in vivo7. Esto incluye procedimientos para (1) el cultivo exitoso de Malassezia in vitro, (2) la aplicación epicutánea de Malassezia sobre la piel del oído murino, y (3) los detalles técnicos de cómo analizar la piel inducida por Malassezia inflamación y la carga fúngica de la piel infectada. Es importante destacar que este modelo no se basa en la inmunosupresión (por ejemplo, mediante corticoesteroides) o el tratamiento antibiótico de ratones antes de la infección, como se practica en otros modelos de ratón de infección fúngica8,9. A su vez, permite estudiar todo el espectro de la respuesta inmune innata y adaptativa contra Malassezia en la piel normal. Cabe destacar que los ratones de tipo salvaje endogámico mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) no se colonizan naturalmente con Malassezia y, por lo tanto, su exposición al hongo no da lugar a la colonización persistente, sino que se elimina del huésped aproximadamente 1,5 semanas. Sin embargo, el modelo permite estudiar los mecanismos de iniciación y regulación de la respuesta del huésped antifúngico que, a su vez, es la base de cómo se genera la memoria inmune. El modelo es versátil ya que se puede aplicar fácilmente a una amplia variedad de cepas de ratón modificadas genéticamente y se puede combinar con otros modelos existentes de enfermedad de la piel, como modelos de deficiencia de barrera, para estudiar el impacto de Malassezia condiciones patológicas e inflamatorias de la piel7. Por lo tanto, el modelo descrito de infección cutánea experimental de Malassezia en ratones proporciona un alto grado de flexibilidad para investigar la interacción del hongo con el sistema inmunitario de la piel en el contexto de la homeostasis y la enfermedad.
Este protocolo describe la infección cutánea experimental de ratones con Malassezia spp. Debido a su potencial patógeno, Malassezia spp. se clasifican como patógenos BSL2 en algunos países, incluyendo Suiza. Consulte las directrices locales y siga las normas de las autoridades locales. Los organismos clasificados por BSL2 deben ser manejados por personal capacitado bajo un gabinete de bioseguridad (BSC) certificado por BSL2. Los residuos biológicos contaminados con organismos clasificados por BSL2, así como las canales de ratones infectados con dichos organismos, deben autoclaverse antes de su eliminación. Para los experimentos con ratones, se deben hacer todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento y asegurar los más altos estándares éticos y humanos de acuerdo con los principios 3R (reemplazar, refinar, reducir)10. Los experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo con M. pachydermatis (ATCC 14522), M. furfur (ATCC 14521) y M. sympodialis (ATCC 42132)7.
Protocol
Todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo de conformidad con la ordenanza sobre el manejo de organismos en sistemas contenidos de la Oficina Federal de Medio Ambiente, Suiza (www.bafu.admin.ch). Los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Ley Suiza de Protección de los Animales y se llevaron a cabo en virtud de los protocolos aprobados por la Oficina Veterinaria del Cantón de Zúrich, Suiza (número de licencia 168/2018).
1. Cultivo de Malassezia en condiciones de laboratorio
NOTA: Almacene todos los reactivos y medios utilizados para este protocolo a temperatura ambiente (RT, 20 – 25 oC) a menos que se indique lo contrario, ya que la temperatura más baja puede inhibir el crecimiento de hongos.
- Preparar el medio DeDixon modificado líquido (mDixon) para el crecimiento de Malassezia. Para preparar 500 mL de medio líquido mDixon, disolver 18 g de extracto de malta, 10 g desmetidos Ox-bile, 5 mL Tween-40, 3 g Peptono, 1 mL de glicerol y 1 ml de ácido oleico en 500 ml de ácido destilado H2O (dH2O). Ajuste el medio a pH 6 con HCl y autoclave. Almacene el medio en RT.
- Prepare las placas de agar mDixon añadiendo agar de 7,5 g a un medio mDixon de 500 ml antes del autoclave. Enfríe lentamente el agar mDixon después de autoclave con una barra de dirección y una placa de calentamiento magnético para evitar la solidificación parcial del medio mientras se enfría.
- Una vez que el agar se haya enfriado a 50 – 60 oC, dispensar el líquido en platos Petri en una campana de flujo laminar y dejar que se sequen a RT durante la noche.
NOTA: Las placas de agar se pueden almacenar a 4 oC durante varias semanas cuando se envuelven y se mantienen boca abajo para evitar la evaporación. - Obtener Malassezia aísla y revivir las poblaciones liofilizadas de Malassezia de acuerdo con las instrucciones obtenidas por el proveedor.
- Inocular 10 ml de medio líquido mDixon en un matraz Erlenmeyer estéril de 100 ml con la suspensión Malassezia revivida de acuerdo con las instrucciones obtenidas por el proveedor. Incubar el cultivo en una incubadora de temblores a 30oC y 180 rpm.
- Inspeccionar el crecimiento de la cultura Malassezia regularmente comprobando la apariencia de color crema y turbidez. La cinética de crecimiento depende de la especie y la cepa de Malassezia y puede ser particularmente lenta cuando Malassezia se reanima recién de un stock liofilizado. (Figura 1A).
- Prepare las existencias de glicerol mezclando 3 partes del cultivo Malassezia densamente cultivado en medio mDixon con 1 parte de glicerol estéril 99%. Aliquot la mezcla Demalassezia/ glicerol en tubos estériles de tornillo-tapa y almacenar a -80 oC.
- Para la propagación in vitro, placa Malassezia del cultivo líquido en mDixon o de la culata de glicerol congelado en una placa de agar mDixon (traída a RT a partir de 4oC) utilizando un bucle de inoculación.
NOTA: Transfiera las placas de agar mDixon a RT desde 4 oC antes del uso, ya que el agar mDixon frío inhibe el crecimiento de hongos. - Incubar la(s) placa(s) de agar con Malassezia al revés en una incubadora (sin temblores) a 30oC. Inspeccione regularmente el crecimiento de las colonias de Malassezia.
NOTA: Las colonias de Malassezia en placas de agar mDixon aparecen dentro de 3 - 5 días y son de color crema opaco, suave con elevación convexa(Figura 1B). - Almacene las colonias de Malassezia en placas de agar mDixon en RT durante 2 semanas. A partir de entonces, prepare una nueva placa de agar mDixon saqueando Malassezia de la población de glicerol congelado como se describe en 1.7.
2. Preparación del inóculo para la infección experimental de Malassezia en ratones
- Inocular 10 ml de medio líquido mDixon en un matraz Erlenmeyer estéril de 100 ml con 3 - 5 colonias individuales de Malassezia de una placa de agar mDixon (ver paso 1, Figura 1B).
- Incubar el cultivo de Malassezia de 48 a 96 h a 30 oC y 180 rpm hasta que el cultivo sea de color crema y turbio(Figura 1A).
NOTA: El tiempo necesario para el crecimiento de Malassezia depende de la especie y cepa de Malassezia y de la cantidad de hongos utilizados para la inoculación. - Transfiera 2 ml del cultivo de Malassezia en un tubo estéril de microcentrífuga de 2 ml y centrífuga durante 1 min a 10.000 x g.
- Deseche el sobrenadante y lave el pellet suspendiéndolo en 1 ml de solución de sal tamponada de fosfato (PBS). Centrífuga de nuevo durante 1 min a 10.000 x g.
- Después del lavado, suspenda el pellet en 1 ml de PBS pipeteando vigorosamente y mida la densidad óptica de la solución a 600 nm (ODA600) utilizando un espectrómetro. Diluir la suspensión de Malassezia 20 – 50 x con PBS para la medición de OD para asegurar que la lectura está entre 0.1 y 1.
NOTA: La densidad de un cultivo de 3 días de Malassezia generalmente varía entre 15 y 30 ODA600, dependiendo de la especie y cepa de Malassezia y del número de células de levadura utilizadas para la inoculación del cultivo (paso 2.1). Malassezia tiende a formar agregados, por lo tanto, es necesario un pipeteo vigoroso para garantizar la homogeneidad de la suspensión. - Aliquot un volumen de la suspensión Malassezia en PBS que corresponde a una densidad de 4 ODA600 en un tubo estéril de 2 ml. Prepare 1 tubo por animal para ser infectado.
- Centrifugar los tubos que contienen Malassezia durante 1 min a 10.000 x g.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet de Malassezia en 200 ml de aceite de oliva nativo (correspondiente a 2 células de levadura ODA600/100 l de aceite deoliva).
NOTA: Se encontró que el aceite de oliva era un buen vehículo para la infección epicutánea con Malassezia,ya que Malassezia es una levadura lipofílica y dependiente de los lípidos. El aceite de oliva es mejor absorbido por la piel que el PBS. Sin embargo, ten en cuenta que no es fácil suspender Malassezia en aceite de oliva. Mejorar la suspensión de Aceite de Oliva Malasseziapor vórtice. Mantenga la suspensión en RT hasta que se utilice para la infección. - Preparar tubos con aceite de oliva solo para la infección simulada de los animales de control.
3. Infectar ratones con Malassezia
- Pida ratones hembra C57BL/6 a una edad de 6 - 8 semanas y permítales aclimatarse en las instalaciones animales experimentales durante al menos una semana. Calcule entre 3 y 5 ratones por grupo, incluido un grupo de control no infectado.
- Preparar un cóctel anestésico estéril que contenga 1,3 mg/ml de xilazina y 6,5 mg/ml de ketamina en PBS. 5 ml del cóctel anestésico es suficiente para anestesiar a 20 animales. Ajuste el volumen del cóctel según el número de animales a anestesiar.
- Anestetizar a los animales inyectando 10 l/g de peso corporal de cóctel anestésico por vía intraperitoneal (correspondiente a 65 mg de ketamina y 13 mg de xilazina por kg de peso corporal) y colocar los animales anestesiados en una almohadilla de calentamiento a 37 oC.
NOTA: A la dosis indicada, los animales suelen permanecer anestesiados durante 30 - 60 min.
- Anestetizar a los animales inyectando 10 l/g de peso corporal de cóctel anestésico por vía intraperitoneal (correspondiente a 65 mg de ketamina y 13 mg de xilazina por kg de peso corporal) y colocar los animales anestesiados en una almohadilla de calentamiento a 37 oC.
- Compruebe los reflejos pellizcando el pie trasero con fórceps para asegurarse de que los animales están completamente anestesiados.
- Aplica una crema para los ojos sobre los ojos para prevenir la deshidratación durante la anestesia.
- Opcionalmente, mida el grosor del oído de ambas orejas usando una pinza (rango de 0 - 5 mm). Mida dos áreas diferentes de cada oreja y calcule el grosor medio del oído por oreja.
NOTA: La medición del grosor del oído es opcional y depende de la pregunta de investigación. Sin embargo, si el grosor del oído se utiliza como una lectura para la inflamación de la piel, es necesario medir el espesor basal del oído antes de la infección. (véase el paso 4). - Opcionalmente, interrumpa la barrera epidérmica de la piel dorsal del oído mediante la desmontaje leve de cintas: aplique manualmente un pequeño trozo de cinta adhesiva en la piel y retírela de nuevo. Repita durante 5 rondas consecutivas utilizando un trozo de cinta nueva para cada ronda.
NOTA: Malassezia induce una inflamación de la piel más pronunciada en la piel perturbada por barreras en comparación con la piel no perturbada(Figura 2A)7. - Aplicar tópicamente 100 l (2 ODA600) de la suspensión de Aceite de oliva Malassezia/aceite de oliva en el lado dorsal de cada oreja utilizando una pipeta estéril. Incluir un grupo de control de animales que se tratan únicamente con aceite de oliva (grupo de control tratado con vehículo).
NOTA: Vortex la Suspensión de Aceite de Oliva Malasseziavigorosamente para asegurar una suspensión homogénea de Malassezia inmediatamente antes de la aplicación. - Deje a los animales anestesiados en la almohadilla de calentamiento para evitar la hipotermia hasta que muestren signos de recuperación (movimiento de agitación, aumento de la frecuencia respiratoria, etc.).
- Inyectar 200 s de solución de glucosa estéril y precalentada del 2% por vía subcutánea en el pliegue nucal para apoyar su metabolismo y rehidratación.
NOTA: Para preparar una solución estéril de glucosa al 2%, disuelva 1 mg de glucosa en PBS de 50 ml y filtre con un filtro de 0,2 m. La solución se puede almacenar a 4 oC. - Transfiera a los animales de vuelta a su jaula.
4. Análisis de la inflamación de la piel inducida por Malassezia
NOTA: Este procedimiento describe el análisis de la hinchazón del oído inducida por Malasseziadurante la infección que sirve como parámetro de la inflamación de la piel. Un requisito previo para analizar la hinchazón del oído inducida por hongos es medir el grosor basal del oído antes de la extracción de cinta y/o infección (Paso 3.5).
- Preparar la cámara de isoflurano para la anestesia a corto plazo de Malassezia-infectados y controlar animales.
- Transfiera un animal a la vez a la cámara y espere a que el animal sea completamente anestesiado.
NOTA: Los signos de anestesia adecuada incluyen relajación corporal completa, así como respiración lenta y pesada (flanco). Controlar cuidadosamente la anestesia, ya que la exposición prolongada al isoflurano puede ser mortal. - Retire el animal de la cámara y colóquelo sobre un pañuelo.
- Mida el grosor de la(s) oreja(s) usando una pinza (rango 0 - 5 mm). Mida dos áreas diferentes de cada oreja y calcule el grosor medio por oreja (ver paso 3.5).
- Transfiera el animal de vuelta a la jaula.
NOTA: La anestesia con isoflurano es de muy corta duración, y los animales se recuperan dentro de los 30 s después de retirarlos de la cámara de isoflurano. - Calcule el aumento en el grosor del oído restando el espesor basal promedio del oído, medido antes de la extracción de cinta y/o infección, del espesor medio del oído medido en cada punto de tiempo después de la infección.
- Trazar los valores calculados como el aumento en el grosor del oído o, alternativamente, como el espesor total del oído a lo largo del tiempo para cada animal o grupo de animales(Figura 2B).
5. Análisis de la carga de hongos en la piel infectada
- Preparar un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml para cada oreja a cosechar, que contenga 0,5 ml de 0,05% NP40 estéril en dH2O y una bola de acero autoclave (5 mm de diámetro).
- Pesar los tubos con una balanza de precisión y anotar el peso preciso.
- Eutanasia a los ratones por asfixia porCO2.
- Retire la oreja en la base y transfiera al tubo que contenga 0,5 ml de 0,05% NP40 estéril en dH2O, como se describe en los pasos 5.1 - 5.2.
- Pesar el tubo que contiene el tejido auditivo y calcular el peso real de cada muestra restando el peso del tubo sin el órgano del peso del tubo con el órgano.
- Homogeneizar el tejido auditivo durante 6 min a 25 Hz utilizando un homogeneizador de tejido. Asegúrese de que el tejido esté bien homogeneizado.
- Placa 100 l de cada muestra (correspondiente a 1/5 de cada homogeneización, factor de dilución no 5) en placas de agar mDixon e incubar las placas boca abajo en una incubadora de 30oC.
NOTA: La cantidad de homogeneato chapado debe ajustarse de acuerdo con la carga de hongos que se espera. Asegúrese de enchapar suficiente homogeneidad para obtener al menos 10 y no más de 250 colonias por placa para permitir una fácil enumeración. Opcionalmente, placa múltipleplacas por muestra con diferentes diluciones de homogeneato. - Inspeccione regularmente el crecimiento de las colonias de Malassezia.
NOTA: Las colonias generalmente se vuelven visibles después de 2 - 3 días. El tiempo necesario para que las colonias de Malassezia crezcan depende de la especie y cepa de Malassezia. - Cuenta las colonias por plato.
- Calcule el número de tejido CFU/g utilizando la siguiente fórmula:
CFU/g tejido (número de colonias/placa) x (factor de dilución) / (peso de la muestra de piel en g).
NOTA: El límite de detección mínimo aproximado se puede evaluar utilizando la siguiente fórmula: límite mínimo de detección (1 colonia/placa) x (factor de dilución) / (peso medio de todas las muestras de piel en g). - Las cargas fúngicas generalmente se trazan en una escala logarítmica(Figura 2C).
Representative Results
Cultivo in vitro de Malassezia
En comparación con otros patógenos del modelo de hongos más comúnmente utilizados como C. albicans o A. fumigatus, Malassezia es más difícil de cultivar in vitro. Esto se puede atribuir al hecho de que Malassezia se basa en fuentes de lípidos exógenos para sus requisitos nutritivos, debido a su incapacidad para sintetizar ácidos grasos11. El medio mDixon es adecuado para el cultivo de varias especies de Malassezia incluyendo M. pachydermatis, M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa y M. yamatoensis in vitro7 ,12. La Figura 1 muestra imágenes representativas para el crecimiento de M. sympodialis en medio mDixon líquido y en agar mDixon como se describe en los pasos 1 y 2.
Análisis de la inflamación de la piel y la carga fúngica de la inflamación de la piel de Malassezia
La exposición de Malassezia a la piel del oído del ratón que fue una barrera interrumpida por la extracción de cintas antes de la infección da lugar a una inflamación exacerbada de la piel, caracterizada por hiperplasia epidérmica y dérmica y el desarrollo de edema7. Los pasos 4 y 5 describen los métodos para analizar la hinchazón del oído inducida por Malasseziay la carga fúngica de la piel. Ambos parámetros representan lecturas clave para monitorear el curso de la infección. La Figura 2A ilustra el aumento en el grosor del oído que se puede observar después de la exposición de M. furfur a la piel que fue interrumpida por barrera en comparación con la piel no perturbada de los ratones WT C57BL/6. La Figura 2B muestra un gráfico resumido representativo del aumento del grosor del oído con el tiempo. La Figura 2C muestra la carga de hongos en la piel del oído el día 2 después de la infección con M. pachydermatis.
Figura 1: Cultivo in vitro de Malassezia.
(A) Cepa M. sympodialis ATCC 42132 cultivada durante 3 días a 30oC y 180 rpm en medio líquido mDixon (izquierda) junto a un matraz Erlenmeyer de control que contiene mDixon medio que no fue inoculado (derecha). (B) Colonias de cepa M. sympodialis ATCC 42132 en agar mDixon después de 5 días de incubación a 30oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de la infección cutánea de Malassezia sobre la base del grosor del oído y la carga de hongos.
(A) Histología de las secciones del oído obtenidas de ratones C57BL/6 tratados con aceite de oliva (vehículo, izquierda) o infectados con la cepa M. furfur JPLK23 durante 5 días (medio y derecho). A la derecha, la piel de la oreja se despojó de cinta adhesiva antes de la infección. Las secciones se tiñieron con hematoxilina y eosina (H&E). (B) Gráficos de resumen que muestran el aumento del grosor del oído a lo largo del tiempo para ratones C57BL/6 que fueron expuestos a Malassezia o que no estaban infectados como controles. El grosor absoluto de la cepa M. pachydermatis ATCC 14522-expuesto o tratado por vehículo piel de la oreja en cada punto de tiempo se muestra a la izquierda; el aumento en el grosor del oído en los puntos de tiempo indicados en relación con la línea de base en el día 0 se muestra a la derecha. (C) Carga fúngica en la piel de ratones C57BL/6 infectados con cepa M. pachydermatis ATCC 14522 o tratados con aceite de oliva como control (vehículo). En ambos casos, la piel fue despojada con cinta adhesiva. Cada símbolo de los gráficos de resumen B y C representa un animal. La significancia estadística de las diferencias entre grupos se calculó utilizando ANOVA unidireccional (B) o la prueba t del estudiante (C). p <0.001, ****p <0.0001, D.L.: Límite de detección Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe la infección de la piel de la cepa de ratón endogámica comúnmente utilizada C57BL/6 por Malassezia spp. Adaptación de este protocolo a otras cepas de ratón con un fondo genético diferente (por ejemplo, Balb/c) o a ratón modificado genéticamente las cepas pueden necesitar un ajuste de la dosis de la infección, el punto de tiempo del análisis, etc. Para garantizar la reproducibilidad, los grupos de ratones deben ser siempre de la misma edad y sexo. La fuente de ratones debe mantenerse estable, ya que incluso ligeros cambios en los antecedentes genéticos y diferencias en la microbiota, que existen entre los proveedores y pueden existir incluso entre diferentes unidades de una sola instalación de cría, pueden tener un impacto impredecible en el curso de infección. Al configurar el modelo de infección de Malassezia descrito en este protocolo, se recomienda realizar un estudio piloto para monitorear cuidadosamente el curso de la infección, incluyendo el grado de colonización, la cinética del aclaramiento de hongos y el grado de inflamación y patología que podrían inducirse (por ejemplo, si la piel del oído está interrumpida por barrera antes de la infección) para determinar las condiciones óptimas del ensayo.
Para garantizar la reproducibilidad y detectar de forma fiable las diferencias entre los grupos experimentales, el número de animales utilizados por grupo debe calcularse en función del análisis estadístico. El tamaño de la muestra se calcula en función del tamaño del efecto, la tasa de error y la potencia, que tienen en cuenta las variaciones biológicas y experimentales (por ejemplo, debido a la variación en el sistema inmunitario). Por razones éticas evite el uso innecesariamente alto de animales. En cuanto a la infección cutánea de Malassezia, no se recomienda tratar un solo oído con el hongo y usar el otro oído como control dentro del mismo ratón, ya que los ratones pueden propagar el hongo a ambos oídos al acicalarse. Sin embargo, el uso de 1/2 oído para diferentes lecturas metodológicas tales como la determinación de la carga de hongos, el aislamiento de las células inmunitarias o el análisis histológico es a menudo suficiente y resulta en una reducción significativa en el número de animales utilizados para los experimentos.
18 especies diferentes de Malassezia han sido descritas hasta la fecha. Las variaciones entre especies e intraespecies dentro del género Malassezia pueden afectar la interacción con el huésped, como también hemos aprendido de estudios sobre otros hongos patógenos humanos13. Diferentes especies y cepas de Malassezia difieren en su origen (por ejemplo, M. pachydermatis es la especie más frecuente aislada de los animales, mientras que M. restricta, M. globosa y M. sympodialis son las más miembros prominentes del microbioma de la piel de los hongos en los seres humanos con distribución variable de estas especies entre diferentes áreas de la piel). Algunas especies se han asociado con el commensalismo, mientras que otras se cree que son más patógenas, aunque la evidencia detallada sigue siendo relativamente débil. Es importante destacar que algunas especies y cepas son intrínsecamente más difíciles de cultivar que otras. Por lo tanto, la decisión de qué especies/cepas utilizar para la infección debe basarse en la cuestión de la investigación.
La infección experimental de la piel murina con algunos organismos microbianos como Candida albicans o Staphylococcus aureus requiere la interrupción de la barrera epidérmica antes de la infección, por ejemplo, con papel de lija14, 15,16. Por el contrario, el modelo de infección de Malassezia descrito aquí es igualmente eficiente con y sin interrupción de barrera7. El grado de inflamación inducido por el hongo se mejora masivamente si la piel se despoja antes de la infección7. Por lo tanto, si la piel debe ser manipulada antes de la aplicación de Malassezia depende de la cuestión de investigación. Existen varios modelos de inflamación crónica y aguda de la piel (por ejemplo, modelos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) e hipersensibilidad de contacto (CHS)) y modelos de deficiencia de barrera que pueden ser de interés para investigar la contribución de la levadura commensal a las patologías de la piel.
Los ratones endogámicos mantenidos bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) no son (a nuestro conocimiento) colonizados naturalmente con Malassezia. Por lo tanto, la aplicación experimental de Malassezia a la piel del oído del ratón representa una exposición primaria al hongo que induce una respuesta aguda en el huésped, lo que a su vez conduce al aclaramiento de hongos dentro de 1 - 2 semanas7. Mientras que el modelo descrito en este protocolo, por lo tanto, sólo refleja parcialmente la situación en los seres humanos inmunocompetentes u otros organismos huéspedes que están colonizados permanentemente con Malassezia,la infección experimental permite una amplia ventana de oportunidad de estudiar la inmunidad antifúngica y los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a esta respuesta. También permite investigar variaciones en la respuesta a diferentes especies y cepas de Malassezia bajo diferentes condiciones experimentales (por ejemplo, con y sin interrupción de barrera de la piel).
El estudio de Malassezia - las interacciones del huésped se han limitado en el pasado a experimentos in vitro con tipos de células aisladas en cultivos (por ejemplo, líneas celulares de queratinocitos, PBMCs). Aunque estos estudios han arrojado algo de luz sobre los determinantes de los hongos y el huésped que dan forma a la interacción entre Malassezia y el huésped17,no permiten obtener una comprensión completa del hongo - interacción del huésped en el complejo ambiente de la piel, que implica múltiples tipos de células que están en comunicación constante, tales como queratinocitos, fibroblastos y células inmunitarias residentes en tejidos, pero también poblaciones de leucocitos que se infiltran en el tejido sólo tras el encuentro microbiano de la Piel. Esta red multicelular no se puede reproducir completamente en los modelos in vitro, incluso con los sistemas organoides más avanzados. Por lo tanto, la infección experimental de ratones todavía representa el estándar de oro en inmunología y investigación de enfermedades infecciosas, y la disponibilidad del modelo descrito aquí representa un avance en el campo de la investigación de Malassezia. Es importante destacar que este modelo se basa en la aplicación epicutánea de Malassezia en la piel del oído del ratón, y no implica la inoculación del hongo por inyección en el tejido, por ejemplo, por vía subcutánea o intraperitoneal, como estudios previos reportaron18,los cuales están más distantes de la situación en los huéspedes colonizados naturalmente.
La posibilidad de combinar el modelo de infección de Malassezia descrito en este protocolo con otros modelos de ratón disponibles aumenta en gran medida el alcance y la flexibilidad de la aplicación. Estos últimos incluyen varios modelos de trastornos específicos de la piel, como el modelo de deficiencia de barrera que imita características importantes de la dermatitis atópica, una enfermedad asociada con Malassezia tanto en humanos como en perros. Además, la infección epicutánea de la piel con Malassezia se puede aplicar fácilmente a ratones con defectos genéticos en genes huésped de interés, o ratones en los que un tipo de interés celular se elimina genéticamente o puede agotarse farmacológicamente (por ejemplo, por medios administración de toxinas difteria en ratones que expresan los receptores de toxinas difteria). Estos modelos representan una herramienta inevitable para disuadar la respuesta del huésped a microbios comensales y patógenos, incluyendo Malassezia,y para evaluar el papel de estos genes y el tipo de célula en la interacción hongo-huésped. Los análisis de la interacción de la piel Malassezia-host se pueden ampliar mucho más allá de lo que se describe en este protocolo. Estos incluyen análisis por histología (por ejemplo, para determinar el grado de patología de la piel o el engrosamiento epidente epidente inducido por el hongo), por inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente de secciones de tejido utilizando anticuerpos dirigidos contra el tipo celular marcadores específicos u otras moléculas de interés. También puede implicar el aislamiento de células (por ejemplo, subconjuntos de leucocitos residentes en tejidos o infiltrantes de tejido) del tejido cutáneo infectado para estudiar la polarización, regulación y dinámica de la respuesta inmune a Malassezia en gran profundidad.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta obra fue apoyada por la Universidad de Zúrich, Suiza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
| Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | - | |
| Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
| Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
| Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
| Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
| Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
| Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
| Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
| Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
| Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
| Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
| Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
| Native olive oil | - | - | commerc. available |
| Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
| Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
| Peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
| Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
| Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
| Shaking incubator Infors Minitron | Infors | - | BSL2 certified |
| Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
| Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
| Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
| Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
| Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
| Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
| Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |
References
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