Summary
Hier presenteren we een protocol om een specifieke celpopulatie te ontkoppelen en te sorteren op de mannelijke accessoireklieren Drosophila (secundaire cellen) voor RNA-SEQUENCING en Rt-qPCR. Celisolatie wordt bereikt door middel van FACS zuivering van GFP-uitdrukken van secundaire cellen na een multistep dissociatie proces waarbij dissectie, proteasen spijsvertering en mechanische dispersie.
Abstract
Om de functie van een orgaan te begrijpen, is het vaak nuttig om de rol van de samenstellende celpopulaties te begrijpen. Helaas maakt de zeldzaamheid van individuele celpopulaties het vaak moeilijk om genoeg materiaal te verkrijgen voor moleculaire studies. De accessoireklier van het mannelijke voortplantingssysteem Drosophila bevat bijvoorbeeld twee verschillende secretoire celtypen. De belangrijkste cellen vormen 96% van de secretoire cellen van de klier, terwijl de secundaire cellen (SC) make-up van de resterende 4% van cellen (over 80 cellen per man). Hoewel beide celtypen belangrijke componenten van de zaadvloeistof produceren, is het bekend dat slechts een paar genen specifiek zijn voor de SCs. De zeldzaamheid van SCs heeft, tot nu toe, de Transcriptomic Analysis studie van dit belangrijke celtype belemmerd. Hier wordt een methode gepresenteerd die de zuivering van SCs voor RNA-extractie en-sequencing mogelijk maakt. Het protocol bestaat uit eerste dissectie klieren uit vliegen uitdrukken van een SC-specifieke GFP reporter en vervolgens het onderwerpen van deze klieren aan protease spijsvertering en mechanische dissociatie om individuele cellen te verkrijgen. Na deze stappen worden individuele, levende, GFP-gemarkeerde cellen gesorteerd met behulp van een fluorescerende geactiveerde celsorteerder (FACS) voor RNA-zuivering. Deze procedure levert SC-specifieke Rna's van ~ 40 mannetjes per aandoening voor downstream RT-qPCR en/of RNA-sequencing in de loop van één dag. De snelheid en eenvoud van de procedure maakt het mogelijk voor de transcriptomes van veel verschillende vliegen, van verschillende genotypen of omgevingscondities, te bepalen in een korte periode van tijd.
Introduction
Organen bestaan uit meerdere celtypen, elk met discrete functies en soms sterk verschillende sets van genen uitdrukken. Om een precies inzicht te krijgen in hoe een orgaan functioneert, is het vaak essentieel om elk afzonderlijk celtype dat dit orgel vormt te bestuderen. Een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt om de mogelijke functie te verkennen is transcriptome analyse. Deze krachtige methode biedt een momentopname van de genexpressie in een cel, om actieve processen en trajecten te onthullen. Echter, dit soort analyse is vaak moeilijk voor zeldzame celpopulaties die moeten worden gezuiverd van veel meer-overvloedige naburige cellen. De mannelijke accessoireklier Drosophila is bijvoorbeeld een orgaan dat voornamelijk uit twee secretoire celtypen bestaat. Aangezien de zeldzamer van de twee celtypen slechts 4% van de cellen van deze klier omvat, was het gebruik van een cel-type specifieke transcriptome-analyse niet gebruikt om de functie van deze cellen te helpen bepalen.
Accessoireklieren (AGs) zijn organen van het mannelijke voortplantingsstelsel bij insecten. Ze zijn verantwoordelijk voor de productie van de meeste eiwitten van de zaadvloeistof (zaadvloeistof eiwitten (Sfp's) en accessoireklier proteïnen (Acp's)). Sommige van deze Sfp's zijn bekend voor het opwekken van de fysiologische en gedragsmatige reacties in gemuleerde vrouwtjes, vaak genoemd de post-paring reactie (PMR). Sommige van de PMRS omvatten: een verhoogde ovulatie en ei-leggen tarief, de opslag en afgifte van sperma, een verandering in het vrouwelijk dieet, en een afname van de ontvankelijkheid van de vrouwelijke aan secundaire hofmakerij mannetjes1,2. Omdat insecten veel belangrijke maatschappelijke kwesties van de menselijke gezondheid (als vectoren voor dodelijke ziekten) aan de landbouw beïnvloeden (insecten kunnen ongedierte zijn, maar toch kritisch zijn voor bestuiving en bodemkwaliteit), is het begrijpen van de reproductie van insecten een belangrijk onderzoeksgebied. De studie van AGs en ACPs is sterk gevorderd met het modelorganisme Drosophila melanogaster. Deze studies hebben de rol van AGs en enkele van de individuele eiwitten die zij produceren in het creëren van de PMR, beïnvloed het werk in andere soorten zoals de ziekte vector Aedes aegypti3,4, en andere insecten1 ,5. Bovendien, zoals AGs de bestanddelen van dezaadvloeistof scheiden,worden ze vaak gezien als de functionele analogon van de prostaat klier van zoogdieren en het zaadblaasje. Deze functie gelijkenis gecombineerd met moleculaire gelijkenissen tussen de twee weefsel-types, hebben de AGs een model voor de prostaat klier gemaakt in vliegen7.
Binnen het Drosophila mannetje zijn er twee lobben van accessoireklieren. Elke LOB kan worden gezien als een SAC-achtige structuur opgebouwd uit een monolaag van secretoire cellen rond een centraal lumen, en verpakt door gladde spieren. Zoals hierboven vermeld, zijn er twee morfologisch, ontwikkelmentaal en functioneel verschillende secretoire celtypen die deze klier vormen: de veelhoekige hoofd cellen (die ~ 96% van de cellen maken) en de grotere, ronde secundaire cellen (SC) (waaruit de resterende 4% van de cellen, of ongeveer 40 cellen per LOB). Het is aangetoond dat beide celtypen produceren verschillende sets van ACPs voor het opwekken en onderhouden van de PMR. De meeste van de tot nu toe verkregen gegevens wijzen op de rol van één enkel eiwit dat het grootste deel van het karakteristieke gedrag van de PMR activeert. Dit eiwit, de geslachts peptide, is een klein, 36 aminozuur peptide dat wordt uitgescheiden door de belangrijkste cellen8,9,10. Hoewel de geslachts peptide een belangrijke rol lijkt te spelen in de PMR, zijn andere acp's, geproduceerd door zowel de hoofd-als de secundaire cellen, ook aangetoond dat ze invloed hebben op verschillende aspecten van de PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Op basis van onze huidige kennis lijken de SCs, via de eiwitten die ze produceren, bijvoorbeeld nodig te zijn voor de bestending van de SP-signalering na de eerste dag18.
Gezien de zeldzaamheid van de SCs (slechts 80 cellen per man), al onze kennis over deze cellen en de eiwitten die zij produceren komt uit genetica en kandidaatbenaderingen. Tot nu toe is slechts een relatief kleine lijst van genen aangetoond dat SC-specifiek is. Deze lijst bevat de homeodomain proteïne defecte proventriculus (DVE)19, de lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 en 1921, CG1656 en CG1757511, 15,21 en de Homeobox transcriptiefactor abdominaal-b (Abd-b)18. Eerder hebben we aangetoond dat een mutant tekort voor zowel de uitdrukking van Abd-B als de lncRNA MSA in secundaire cellen (IAB-6cocuD1 Mutant) de lengte van de PMR verkort van ~ 10 dagen tot slechts één dag12 , 18 , 20. dit fenotype lijkt te zijn veroorzaakt door de onjuiste opslag van SP in het vrouwelijke voortplantingsstelsel12,18,20. Op cellulair niveau, de secundaire cellen van deze Mutant vertonen abnormale morfologie, het verliezen van hun karakteristieke vacuole-achtige structuren18,20,21. Met behulp van deze Mutant lijn hebben we eerder geprobeerd om genen te identificeren die betrokken zijn bij de SC functie door de transcriptionele profielen van Whole AGs te vergelijken van wild type of Mutant accessoireklieren12. Ook, andere Labs toonde aan dat SC nummer, morfologie en vacuole inhoud afhankelijk van mannelijke dieet, parings status en leeftijd21,25,26.
Hoewel er positieve vooruitgang werd geboekt met behulp van deze benaderingen, was een volledig SC transcriptome verre van gerealiseerd. De zeldzaamheid van deze cellen in dit orgel maakte het moeilijk om verder te vorderen, zelfs van wilde type cellen. Voor het testen van genexpressie zouden veranderingen in deze cellen na bepaalde milieu stimuli nog moeilijker zijn. Zo was er een methode nodig voor het isoleren en zuiveren van SC RNA dat snel en eenvoudig genoeg was om onder verschillende genetische achtergronden en omgevingsomstandigheden te presteren.
Zowel de Abd-B- als de MSA -genen vereisen een specifieke 1,1 KB Enhancer van het Drosophila bithorax complex (de D1 Enhancer genoemd) voor hun expressie in SCs18,20. Deze versterker is eerder gebruikt voor het maken van een GAL4 driver die, wanneer gekoppeld aan een UAS-GFP, is in staat om sterke GFP expressie specifiek in SCs rijden. Zo gebruikten we deze lijn als basis voor een FACS-protocol om deze cellen te isoleren van zowel wild type als IAB-6cocuD1 AGs). Omdat IAB-6CocuD1 Mutant SCs een andere cellulaire morfologie weergeeft, tonen we aan dat dit protocol kan worden gebruikt om cellen te isoleren voor de bepaling van hun transcriptome uit dit zeldzame celtype onder sterk verschillende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila lijnen gebruikt en verzameling van mannetjes
- Gebruik voor dit protocol mannetjes die GFP uitdrukken in de SCs en niet de hoofd cellen. Hier wordt een Abdb-GAL4- driver (beschreven in referentie18) gebruikt, opnieuw gecombineerd met UAS-GFP (op chromosoom 2). Andere geschikte Stuurprogramma's kunnen ook worden gebruikt. Voor isolatie van SCs onder verschillende Mutante omstandigheden, steek de mutatie over in lijnen die de SC-specifieke GFP-lijn bevatten.
- Verzamel twee batches van ongeveer 25 gezonde, maagdelijke mannetjes voor elk genotype en leeftijd ze bij 25 °C gedurende 3-4 dagen in flesjes met vers gemaakt Drosophila voedsel.
Opmerking: Naarmate leeftijd, parings status, voeding en sociale omgeving elk invloed hebben op de reproductieve biologie, moeten strikte protocollen worden gevolgd om te controleren op deze parameters. Virgin mannetjes worden 3-4 dagen na het exuviae-Eclosion op 25 °c gerijpt met een licht/donkere cyclus van 12 uur/12 uur, op standaard maïsmeel-agar-gist voedsel, in groepen van 20-25 mannetjes per injectieflacon.
2. oplossingen en materiaal voorbereiding
-
Bereid de volgende oplossingen voor.
- Bereid serum aangevuld medium (SSM): het Drosophila medium van Schneider aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicileen-streptomycine.
- Bereid aliquots van 1x trypsine-enzym (bijv. TrypLE-Express-enzym) en bewaar bij kamertemperatuur.
- Bereid de aliquots van papaïne [50 U/ml] (bewaard bij-20 °c en slechts eenmaal ontdooid).
- Maak 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, opgeslagen bij kamertemperatuur).
-
Bereid meerdere vlam afgeronde pipettips voor de fysieke dissociatie van de accessoireklieren.
Opmerking: gebruik lage retentie tips voor het hanteren van accessoireklieren omdat ze de neiging hebben om te voldoen aan onbehandeld plastic. Het proces van vlam afronding vermindert de opening van de tip en verzacht de randen van de tip. Dit zorgt voor een efficiënte dissociatie na de spijsvertering van dipeptidylpeptidase zonder de celmembranen te scheren.- Snijd het uiteinde van 1 200 μL met een scherp mes en geef het zachtjes over een vlam om de punt af te ronden, zodat de opening breder maar soepel is voor gebruik tijdens stap 3,7.
- Beperk de opening van meerdere 1.000 μL-uiteinden door de punt opening bij een vlam minder dan een seconde te passeren. Draai de tip iets om overmatige smelting of verstopping te voorkomen. Sorteer de tips die zijn gemaakt van smaller tot breder. Dit kan worden gedaan door de snelheid van aspiratie te timing. Probeer een klein schaal monster van AGs te ontkoppelen om de efficiëntie van de smalste tips te testen.
Opmerking: Deze tips zijn essentieel voor mechanische opwinding (stappen 5,2 en 5,3). Kwaliteit vlam afgeronde pipetpunten zorgen voor volledige dissociatie met behoud van de levensvatbaarheid van de cel. Als zodanig worden deze tips grondig gewassen met water aan het einde van de procedure voor hergebruik. Dit zorgt voor een reproduceerbare dissociatie van dag tot dag.
3. dissectie van de Accessoireklieren
- Zet 20 tot 25 man Drosophila in een glazen schaaltje op ijs.
- Dissect 1 man in SSM. Verwijder het voortplantingskanaal en wis het accessoirewartel paar uit alle andere weefsels, afgezien van het ejaculatory kanaal.
Opmerking: Verwijder de teelballen omdat het vrijgekomen sperma klonters kan maken en het dissociatie proces verstoort. Verwijder de ejaculatory bulb, die het hanteren moeilijk maakt wanneer het zweeft. - Met een tang, breng de accessoirewartels over op een glasplaat gevuld met SSM bij kamertemperatuur. Herhaal stap 3.2-3.3 20 keer om een batch van 20 paren klieren in het SSM te verkrijgen.
Opmerking: Deze stappen zullen worden bereikt in 15 aan 20 min. AGs moet er gezond uitzien, en de peristaltische bewegingen van de spierlaag rond de klieren moeten zichtbaar zijn. GFP kan worden bewaakt met behulp van een fluorescerende Microscoop. - Breng de accessoireklieren over naar 1x PBS voor een 1-2 minuten wassen bij kamertemperatuur.
Opmerking: Voor een betere dissociatie is het noodzakelijk om de klieren met PBS te spoelen. De duur van deze stap moet echter worden beperkt omdat de cellen tekenen van stress vertonen in PBS; gezien secundaire cellen in PBS snel zwellen en sterven. - Verdun 20 μL papaïne [50 U/mL] in 180 μL 1x trypsine-enzym om de dissociatie oplossing te verkrijgen (om omhoog of omlaag te schalen, Houd 9 μL trypsine-enzym en 1 μL papaïne voor elk mannetje). Met een tang, breng de accessoireklieren over naar deze oplossing.
- Isoleer de punt van de accessoireklieren (met secundaire cellen) uit het proximale deel. Gebruik Fine pincet om het midden van een klier kwallen vast te knijpen en snijd met de scherpe punt van een tweede Tang. Verwijder het proximale deel van de accessoireklieren en het ejaculatory kanaal om dissociatie te verbeteren en de sorteer tijd van cellen te verminderen.
Opmerking: Ontleden van het distale deel van 20 paar klieren zal 15 tot 20 minuten duren en de spijsvertering door Peptidases zal dus bij kamertemperatuur beginnen. - Nadat alle wartel uiteinden zijn ontleed, breng je ze over in een tube van 1,5 mL met een speciale pipetpunt van 200 μL, bereid bij stap 2.2.1. Het moet breed, afgerond en nat zijn voordat de klieren worden gehanteerd.
Opmerking: Om het weefsel van de accessoireklier te pipet geven, moeten de tips altijd vooraf nat zijn met de juiste oplossing (trypsine-enzym of SSM, één buis van elk voor dit doel bewaren). Spoel de uiteinden zorgvuldig af tussen de monsters om verontreiniging te voorkomen.
4. weefsel spijsvertering
- Plaats de micro tube in een 37 °C Shaker voor 60 min, schommelen bij 1.000 rpm.
Opmerking: Zowel de opwinding als de digestie tijd zijn cruciaal voor een succesvolle dissociatie. Kortere of beweeglijke spijsvertering zal slechte dissociatie geven, waarschijnlijk omdat de buitenste spierlaag en binnenste visceuze zaadvloeistof de accessoireklier cellen beschermen tegen Peptidases. - Voeg 1 mL SSM bij kamertemperatuur toe om de spijsvertering te stoppen en ga onmiddellijk naar stap 5.
5. mechanische dissociatie van de cellen
- Gebruik een breed afgeronde 1.000 μL tip, pre-wet met SSM, breng het monster over naar een 24-put plaat. Monitor GFP fluorescentie onder de Microscoop: de meeste klier uiteinden moeten er intact uitzien en een paar SC moet worden losgemaakt.
- Met behulp van een afgeronde smalle pipetpunt gegenereerd bij stap 2.2.2, pipet op en neer 3 tot 5 keer om het weefsel van de accessoireklier te verstoren.
Opmerking: Bewaak fluorescentie om ervoor te zorgen dat grote weefsel patches zijn afgebroken. Herhaal stap 5,2 als dit niet het geval is. - Gebruik een zeer smalle afgeronde pipetpunt (gegenereerd bij stap 2.2.2), pipet op en neer 1-2 keer.
Opmerking: Alleen individuele cellen moeten zichtbaar zijn na stap 5,3. Het gebruik van 24-put platen wordt aanbevolen omdat ze een eenvoudige bewaking van het proces mogelijk maken. Wanneer een paar monsters werden verwerkt en gaf bevredigend resultaat (gezond uitziende secundaire cellen perfect losgekoppeld), de Pipetteer stappen zullen worden uitgevoerd in de micro tube. - Wacht minstens 15 min om de cellen aan de onderkant van de put te laten vestigen en verwijder het overtollige SSM om de sorteer tijd te verminderen.
Opmerking: Het laten vestigen van cellen bleek superieur aan alternatieve methoden zoals centrifugeren, en maakt een laatste visuele inspectie van cellen net voor FACS mogelijk. - Pipet de cellen in een schone 1,5 mL Tube en pool identieke monsters (twee batches van 20 mannetjes voor elke aandoening). Spoel putten met SSM om de laatste cellen te herstellen en pipet ze in de buis (gebruik een klein volume).
- Voeg in 1,5 mL microtubes 300 μL Cellysisoplossing en 1 μL proteinase K [50 μg/μL] (oplossingen in de RNA-reinigingsset, zie stap 7). Bereid twee buizen voor elk monster (één voor MCs en één voor SCs).
6. FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering)
- Voeg een levensvatbaarheid marker aan elk monster te worden gesorteerd een paar minuten voor het sorteren (0,3 mM Draq7).
Let op: Draq7 moet met voorzichtigheid worden behandeld. -
Sorteer een homogene populatie van levende secundaire cellen (GFP-positieve, Draq7-negatieve cellen). In een andere micro tube, Sorteer een populatie van hoofd cellen (kleinere, GFP-negatieve, Draq7-negatieve cellen). Gebruik de volgende FACS gating-strategie:
Opmerking: Stel de celsorteerdruk in op 25 psi en geef cellen door een nozzle van 100 μm. De sorteersnelheid is ongeveer 2.000 cellen/s.- Sluit vuil uit en selecteer totaal cellen op basis van FSC-SSC (Figuur 2E) om vuil uit te sluiten.
- Dode cellen uitsluiten. Excite Draq7 met een 640 nm laser en verzamelen uitgezonden fluorescentie met een 795/70 band-pass filter. Poort Draq7-positieve cellen uit (Figuur 2F).
- Verwijder wambuizen met een dubbele gating op SSC-h VS SSC-W en FSC-a VS FSC-h (Figuur 2h).
Opmerking: Sluit celdubbeltjes streng af met dubbel gating, om de besmetting van de hoofd cellen te verminderen. - Sorteer ~ 550 GFP-positieve cellen in een 1,5 mL micro tube met lysis buffer en proteinase K. Deze populatie wordt beschouwd als secundaire cellen (SC, Figuur 2G). Excite GFP bij 488 nm en verzamelen uitgezonden fluorescentie met een 526/52 band-pass filter.
- Sorteer ~ 1.000 GFP-negatieve cellen, homogeen en klein van formaat, in een 1,5 mL micro tube met lysis buffer en proteinase K. Deze populatie wordt beschouwd als hoofd cellen (MC, Figuur 2G).
- Vortex alle monsters.
Opmerking: Van 40 mannetjes (~ 40 x 80 SC = 3.200 secundaire cellen), 600 tot 800 levende singlet secundaire cellen worden verkregen (ongeveer 20-25% ophalen). Stop met sorteren rond 550 SC en 1.000 MC om samples te normaliseren.
7. RNA-extractie
Opmerking: We gebruikten Epicentre MasterPure RNA zuiverings pakket voor RNA-extractie, met de volgende aanpassingen. Andere kits kunnen worden gebruikt zolang de opbrengst hoog genoeg is om een bibliotheek voor te bereiden voor sequencing van ~ 500-cellen (2 ng Rna's werd hier gebruikt).
- Warmte monsters bij 65 °C gedurende 15 minuten en Vortex elke 5 min om cellyse te voltooien.
- Plaats monsters op ijs voor 5 min. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor nucleïnezuren neerslag (delen "precipitatie van totale nucleïnezuren" en "verwijdering van Contaminerend DNA van totale nucleïnezuur preparaten").
- Onderbreek RNA-pellet in 10 μL RNase-vrije TE buffer.
- Voeg RNase-remmer toe (optioneel).
- Bewaar samples bij-80 °C.
8. kwaliteitscontroles van RNA kwantiteit, kwaliteit en specificiteit
- Schatting van de kwaliteit en concentratie van RNA. Als gevolg van het kleine volume en de concentratie, gebruik RNA 6000 Pico chips hier. RNA van goede kwaliteit wordt gedefinieerd als niet-gedegradeerd, zichtbaar als een lage Baseline met scherpe pieken overeenkomend met rRNAs.
-
RT-qPCR om de identiteit van gesorteerde cellen te bepalen
- Voer reverse transcriptie uit met 2 ng totaal rna's met behulp van willekeurige afgescheiden als primers. Voer RT uit op secundair cellen RNA en hoofdcel RNA.
Opmerking: Cdna's kunnen worden verdund, aligeciteerd en bevroren blijven voor later gebruik. - Voer real-time kwantitatieve PCR uit met behulp van geschikte primer paren om huishoudelijke genen (alpha-tubuline, 18S rRNA), secundaire cel-specifieke genen (MSA, Rab19, Abd-B) en Hoofdcel specifiek gen (geslachts peptide) te kwantificeren.
- Voer reverse transcriptie uit met 2 ng totaal rna's met behulp van willekeurige afgescheiden als primers. Voer RT uit op secundair cellen RNA en hoofdcel RNA.
9. sequencing (cDNA Library Preparation, sequencing en Data Analysis)
- Gebruik 2 ng van totale Rna's voor het synthetiseren van Cdna's met polydT primers. Gebruik slimmere technologie om ze te versterken voor versterking.
- Gebruik een Nextera XT kit om de bibliotheek voor te bereiden.
- Sequentie met behulp van Multiplexed, 100 nucleotiden single leest sequencing (hoewel 50 nucleotiden leest zijn geschikt voor de meeste doeleinden) om te leveren rond 30.000.000 leesbewerkingen voor elk monster.
10. gegevensanalyse
- Voer FastQC uit.
- Gebruik de STAR aligner om de leesbewerkingen op de UCSC dm6 Drosophila referentie genoom in kaart te brengen en. BAM bestanden te genereren. Gebruik Integrative Genomics Viewer (IGV) om leesbewerkingen op de genoom browser te visualiseren.
- Gebruik HTSeq om gentellingen uit te voeren.
- Gebruik de methode bijgesneden gemiddelde van M-Values (TMM) om gentellingen te normaliseren22. Gebruik edgeR om statistische analyses uit te voeren van differentiële expressie, MA-plots en PCA.
- Gebruik voor genexpressie analyse en statistieken een algemeen lineair model, quasi-waarschijnlijkheid F-test met vals Detectiepercentage (FDR) en benjamini & Hochberg Correction (BH).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk dat één experimenteur secundaire cellen van de mannelijke accessoireklieren van Drosophila isoleert en hun RNA in de loop van één dag extraheert (Figuur 1).
We gebruiken de Abd-B-GAL4 construct18 om secundaire cellen (SC) te labelen, maar niet hoofd cellen (MC) met GFP (Figuur 2A). Een doel van deze procedure is het verkrijgen van het wild type transcriptome van SCs (wild type is geschreven met omgekeerde komma's, omdat ze worden verkregen van transgene vliegen uitdrukken GFP en GAL4). Een ander doel is om SC RNA te verkrijgen door middel van een snelle en eenvoudige procedure die het mogelijk maakt om hun genexpressie onder verschillende omstandigheden te bestuderen. Dus, we voerden deze procedure met behulp van wild type en "IAB-6cocuD1" mutanten die een 1,1 KB verwijderen verwijdering van de Enhancer van Abd-B verantwoordelijk voor SC expressie. Deze verwijdering verwijdert ook de promotor van MSA, een belangrijke transcriptie voor de ontwikkeling van secundaire cellen, morfologie en functie18,20 (Figuur 2B, C). Dit protocol werd herhaald driemaal met 2 genotypen telkens om biologische triplicaten te verkrijgen (hierna aangeduid als WT-1,-2,-3 voor het wild type en D1-1,-2 en-3 voor de IAB-6cocuD1).
Dit protocol maakt het mogelijk MC en SC dissociatie van Drosophila accessoireklieren in een paar uur (Figuur 2D). Beide celpopulaties worden vervolgens in twee verschillende buisjes gesorteerd om MCs en SCs te isoleren. De gating strategie voor FACS wordt weergegeven in Figuur 2E-2g. Draq7 maakt het inschatten van de levensvatbaarheid van de cellen rond 70% voor het hele monster mogelijk (Figuur 2F). De onderhemden vertegenwoordigen meer dan 90% van de SC populatie, en meer dan 80% van de MC-populatie, zoals geraamd door FSC-A vs. FSC-h en SSC-h VS SSC-W. (Zie afbeelding 2H). Dit weerspiegelt een efficiënte dissociatie. Ongeveer 10% van de Sorteer gebeurtenissen werd afgebroken omdat er een andere cel of puin in dezelfde FACS droplet aanwezig was. Van 40 mannetjes verzamelen we meestal 550 SCs en 1.000 MCs en onderbreken vervolgens de sortering. Uit 1 monster (uit 6), konden we niet bereiken 550 secundaire cellen. De WT-1 sample werd dus verkregen uit slechts 427 SC maar voorzag RNA van soortgelijke kwaliteit en kwantiteit als anderen.
Cellen worden gesorteerd in lysisbuffer (met proteïinase K). Zodra alle monsters klaar zijn, worden Rna's uit elk celmonster geëxtraheerd om aan het eind van de dag RNA-pellets te hebben. Kwaliteit en kwantiteit van Rna's worden geschat met behulp van een Bioanalyzer met een geschikte chip om te gaan met lage concentraties en kleine volumes. Omdat de geschatte concentraties variabel waren tussen de monsters (variërend van meer dan 1.300 PG/μL tot 344 PG/μL, Zie Figuur 3A), hebben we het uitgangsmateriaal voor zowel de Rt-qPCR-als de cDNA-Bibliotheek synthese aangepast tot ongeveer 2 ng (gemeten de concentraties zijn niet zeer nauwkeurig). We hebben de expressie van specifieke genen gekwantificeerd door real-time qPCR op wild type MC-en SC-extracten om te controleren op de identiteit van de celpopulaties die we hebben gesorteerd. Figuur 3 B toont genexpressie als relatieve kwantificaties genormaliseerd naar Alfa-tubuline expressie. Huishoudelijke genen zoals 18s rRNA en alpha-tubuline worden in alle monsters gedetecteerd, zoals verwacht. Integendeel, de SC Gene Rab19 wordt alleen gedetecteerd uit SC-extracten en de MC Gene Sex peptide wordt alleen van MC gedetecteerd. We merken op dat Rab19 expressie in IAB-6cocuD1 Mutant SC laag is ten opzichte van wild type SC, wat suggereert dat de uitdrukking van dit gen wordt beïnvloed door het verlies van Abd-B en MSA (consistent, de grote Rab19-gelabelde vacuolen gaan verloren in de IAB-6cocuD1 Mutant21). De secundaire cel-specifieke transcript MSA wordt alleen gedetecteerd van wild type SC en niet van MC, noch van IAB-6cocuD1 SCS, die werd verwacht omdat MSA promotor wordt verwijderd in deze mutant. In totaal tonen de in Figuur 3 getoonde qc's aan dat rna's verkregen via dit protocol niet worden afgebroken en dat beide celpopulaties (SC en MC) met succes worden gesorteerd van accessoireklieren, zowel in wild type als in Mutante omstandigheden. Alleen de Rna's van de secundaire cellen zijn hier gesequentieerd, maar merk op dat deze procedure gelijktijdige transcriptome profilering van zowel SCs als MCs mogelijk maakt.
RNA-sequencing werd gerealiseerd met behulp van standaardprocedures. Hier bespreken we alleen de kwaliteitscontrole analyses die relevant zijn voor het doel van deze methode. Wanneer sequenties worden verkregen, worden de leesbewerkingen toegewezen aan het referentie- Drosophila genoom, toegeschreven aan genen, en genormaliseerd. PCA (Principal component Analysis) werd uitgevoerd op de 6 monsters (3 wild type en 3 IAB-6cocuD1 replicaten). Zo veel van de variabiliteit in de gegevens mogelijk wordt verantwoord in PC1, en zo veel van de resterende variabiliteit wordt verantwoord in PC2. Zoals weergegeven in Figuur 4A, repliceert het wild type cluster dicht bij elkaar en ver van IAB-6cocuD1 samples. Dit toont aan dat WT monsters meer vergelijkbaar met elkaar zijn dan ze zijn van mutant degenen. Dit illustreert de reproduceerbaarheid van de methode en het vermogen om abnormaal genetisch programma van Mutante secundaire cellen te detecteren. Terwijl D1-2 en D1-3 monsters samen cluster, we constateren dat het D1-1-monster is vrij verschillend. Omdat alle Qc's voor deze replicatie goed zijn en vergelijkbaar met alle andere replicaten, kunnen we een monster voorbereidings probleem uitsluiten (29.000.000 leest in totaal, > 76% van die uniek op het referentie genoom uitlijnen. Onder deze, > 77% worden toegeschreven aan een gen, > 90% zijn Mrna's, en < 3% zijn rRNA). Deze divergentie zou kunnen weerspiegelen dat genexpressie in SC instabiel is in IAB-6Cocud, hoewel het testen van deze hypothese meer replicaties zou vergen.
Het visualiseren van leesbewerkingen die zijn uitgelijnd met bepaalde genen op het genoom, maakt een visuele inschatting van de gegevenskwaliteit mogelijk. Figuur 4 toont een selectie van genen, met leesbewerkingen van 1 representatieve replicatie voor elk genotype. Het is niet verrassend dat huishoudelijke genen zoals Act5C worden uitgedrukt in beide genotypen(figuur 4B), evenals de SC-specifieke genen Rab19 en DVE (Figuur 4C, D). Het ontbreken van intronic-leesbewerkingen bevestigt dat polydT selectief omgekeerde transcriptie van volwassen spliced Mrna's voor het voorbereiden van cDNA-bibliotheken heeft geprimeerd. Met name kunnen we belangrijke en significante variaties zien in de uitdrukking van specifieke genen tussen wild type en IAB-6cocuD1 SC. Dit wordt geïllustreerd in Figuur 4E door het MSA -gen waarvan de sterke expressie in wild type verloren gaat in IAB-6cocuD1. MSA wordt gepresenteerd als een bewijs van principe dat deze methode het identificeren van genen die verkeerd zijn gereguleerd in Mutante omstandigheden mogelijk maakt. Dit zal helpen bij het begrijpen van de fenotypes waargenomen in deze Mutant, en kan nieuwe inzichten geven in normale secundaire cellen functies.
Figuur 1: overzicht van het protocol. De belangrijkste stappen van het protocol worden weergegeven, met de tijdlijn aan de rechterkant. Deze procedure maakt het mogelijk om te beginnen met live Drosophila in de ochtend te hebben losgekoppeld accessoire kliercellen 's middags, sorteren ze op basis van GFP expressie, en krijgen hun RNAS geëxtraheerd tegen het einde van de werkdag. RNA-sequencing en data-analyse duurt meestal een paar weken. Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: isoleren en sorteren van GFP-uitdrukken van secundaire cellen. A) confocale afbeelding van Abd-B:GAL4 UAS-GFP ACCESSOIREKLIER die GFP in secundaire cellen (SC) uitdrukt, maar niet in hoofd cellen (MC). Nuclei zijn gekleurd met DAPI (blauw). Gestippelde witte lijn begrens de AG lobben. ED is ejaculatory duct. Witte balken in de linkerbovenhoek zijn 50 μm schalen. (B,C) Vergrote views van accessoireklier distale deel met SC uitdrukken GFP, in wild type (B) en IAB-6cocuD1 (C) achtergrond. D) dissociated cellen bij lage vergroting onder de GFP-verrekijker. (E-H) FACS gating strategie te zuiveren SC en MC. rode stippen op alle panelen weergegeven SCs zoals gedefinieerd in panel (G). Eerst wordt het puin uitgesloten (E, stap 6.2.1) en de draq-7-positieve dode cellen (F, stap 6.2.2). GFP-positieve cellen worden geselecteerd (SC) en een homogene populatie van GFP-negatieve cellen (MC) (G, stappen 6.2.4 en 6.2.5). Doublets zijn uitgesloten van zowel MC en SC populatie (stap 6.2.3, alleen de SSC-H vs SSC-W gating voor SC wordt weergegeven op 2H als voorbeeld). Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: QC op Rna's: kwaliteit, kwantiteit en specificiteit van het celtype. A) controle van de RNA-kwaliteit en concentratie schatting op PicoChip. De 25 NT piek is de controle voor kwantificering. Lage Baseline duidt op een geringe afbraak en de 2 belangrijkste pieken zijn de ribosomale Rna's. De 3 monsters die worden gebruikt voor RT-qPCR worden getoond, hun kwaliteit is representatief voor alle RNA-monsters die in deze studie worden gebruikt, en de geschatte concentraties weerspiegelen de variatie in totaal RNA dat we tussen monsters hebben verkregen. B) Rt-qPCR toont de specificiteit van het sorteren van secundaire cellen (SC) en hoofd cellen (MC). Genexpressie kwantificering wordt gedaan met behulp van de formule q = 2(40-CQ) . Elke drievat van elk gen in elke aandoening wordt genormaliseerd naar de gemiddelde hoeveelheid Alfa-tubuline RNA om de totale RNA-variatie te compenseren. Foutbalken tonen standaarddeviatie. WT betekent wild type en D1 verwijst naar de IAB-6cocuD1 mutant. Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: QC op RNA-sequentie gegevens. (A) belangrijkste componenten analyse (PCA) op WT-1,-2,-3 (groene stippen) en D1-1,-2,-3 (blauwe STIPPEN) RNA sequencing datasets. (B-E) Sequentiëren leest toegewezen aan het referentie genoom van Drosophila met behulp van de IGV-software. Er wordt slechts één representatief monster van elk genotype ter verduidelijking getoond (WT-1 en D1-2), en slechts een paar specifieke loci worden getoond. Gennamen worden boven op elk paneel geschreven, > en < symbolen verwijzen naar hun oriëntatie. Getallen tussen haakjes vertegenwoordigen voor elk spoor de schaal voor het aantal leesbewerkingen per DNA-basis paar. Deze schaal is hetzelfde voor beide voorwaarden voor een bepaald gen, maar varieert tussen genen voor een betere visualisatie. Blauwe balken aan de onderkant van elk paneel tonen de Intron van genen (dunne lijn), exonen (brede lijn) en ORF (rechthoeken met > >). Merk op dat Rab19 en Arl5 elkaar overlappen, convergente genen (C). Dit cijfer is gewijzigd van verwijzing27. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Primers gebruikt voor RT-qPCR in deze studie: | ||
| Doel gen | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| alpha-tubuline | EEN van de meest... | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | CTGAGAAACGGCTACCACATC | ACCAGACTTGCCCTCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC | Een van de meest GEAAGDE |
| Geslacht peptide | GGAATGGCCGTGGAATAGGA | TAACATCTTCCACCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTTCGCGTG | CAGCTCCGTTTGTAATCTCTCGAGC |
Tabel 1: primers sequentie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methoden voor celdissociatie van Drosophila weefsel zoals imaginale schijven zijn al beschreven23. Onze pogingen om deze procedures op de accessoireklieren gewoon te gebruiken, hebben gefaald en moedigen ons aan om dit nieuwe protocol te ontwikkelen. Protease spijsvertering en mechanische trituratie waren kritische stappen die we lastig voor het succes van de procedure, en we dus geplaatst veel aantekeningen in de paragrafen 2 tot en met 5 om te helpen onderzoekers om bevredigende resultaten te verkrijgen. Om dissociatie succesvol te maken, moeten Peptidases de accessoireklier cellen bereiken, die worden beschermd door de visceuze zaadvloeistof in het lumen en de spierlaag rond de klier. Ontleden van het distale deel van de klieren was dus kritisch (stap 3,6). Ook, verteerd voor 60 min ten minste met krachtig schudden (stap 4,1) was noodzakelijk. Zachte dissociatie met trypsine-oplossing (bijv. TrypLE) verduurzaamde de klier integriteit en de levensvatbaarheid van de cellen tot mechanische dissociatie. De toevoeging van papaïne of Collagenase in samenwerking met trypsine-oplossing verbeterde de dissociatie (perfecte dissociatie werd verkregen met minder pipetteren, resulterend in een betere overleving van de cel). Echter, geen van deze enzymen waren voldoende om de cellen op hun eigen dissociëren. Pipetteren met afgeronde smalle uiteinden die in deel 2.2.2 worden gegenereerd, is een belangrijke stap voor deze methode. Vandaar dat deze trituratie (stappen 5.2-5.3) moet worden geoptimaliseerd in kleinschalige experimenten om de beste combinatie van tips te kiezen (zie opmerking in stap 5,3).
Met behulp van dit protocol, zal men in staat zijn om te isoleren 500 aan 800 levende secundaire cellen van 40 mannetjes. Dit vertegenwoordigt ~ 20% (± 5%) herstel gezien 3.200 SC als uitgangsmateriaal (40 mannetjes x 80 SC). 20% efficiëntie was hoog genoeg voor RNA-sequencing omdat we meerdere samples op een dag konden verwerken. Dit kan echter worden verbeterd door verschillende methoden, waaronder: werken in grotere batches; het doen van trituratie in de spijsvertering buis en overslaan stap 5,4 om overdrachten te verminderen; triturating zeer zachtjes (sommige gezien GFP + cellen sterven kort na stap 5,3); verkorting van de periode tussen dissociatie en FACS; het verminderen van de spijsvertering tijd met behulp van trypsine-oplossing bij hogere concentratie; met minder strenge parameters voor singlet Selection (stap 6.2.3) en afgebroken sortering. Een beperking van dit protocol is dat het enkele uren duurt om cellen te isoleren; Daarom is het niet geschikt om zeer voorbijgaande veranderingen in de genexpressie te bestuderen. Met dit protocol, 4 x 20 mannetjes kunnen worden verwerkt door een enkele persoon (met training) in één ochtend, waardoor RNA extractie van SC van twee verschillende omstandigheden in 1 dag (Figuur 1). Met name, meer experimenteurs kunnen deelnemen aan accessoireklieren collectie (stappen 3.1-3.3) om meerdere monsters te verwerken op dezelfde dag. Stappen 3,4 wordt echter bij voorkeur door dezelfde persoon uitgevoerd om de reproduceerbaarheid te maximaliseren.
Secundaire cellen verrichten essentiële functies voor mannelijke vruchtbaarheid12,20,24, maar het volledige beeld van de genen die ze uitdrukken om deze rol te vervullen, ontbreekt nog steeds. Hier beschrijven we hoe u de transcriptome van deze cellen verkrijgen van een relatief klein aantal vliegen, waardoor de vergelijking van genexpressie in SC in verschillende omstandigheden mogelijk is. Hier is één mutant die de SC functie en morfologie beïnvloedt, gebruikt en belangrijke veranderingen in de transcriptome zijn zichtbaar. Deze methode kan dus helpen bij het identificeren van nieuwe SC-genen die nodig zijn voor hun functie. Voor onze kennis werd de enige alternatieve methode voor het verkrijgen van SC transcriptome uitgevoerd in ons lab door handmatige picking van SCs. goede kwaliteit RNA sequencing gegevens werden verkregen, maar de procedure was te arbeidsintensief om te worden uitgevoerd in meerdere omstandigheden. We zullen onze SC RNAseq datasets vergelijken en hun biologische betekenis analyseren over SC biologie in een duidelijk papier (ter voorbereiding).
In de toekomst zal deze techniek niet alleen licht werpen op wild type SC transcriptome, maar ook in staat zijn om de impact van milieu-of genverandering op accessoireklier cellen transcriptome te bestuderen. SC nummer, morfologie en vacuole gehalte is aangetoond te afhangen van de mannelijke voeding, parings status en leeftijd21,25,26. We hebben nog steeds een beperkt begrip van de genetische trajecten die betrokken zijn en het vergelijken van SC transcriptomes in verschillende omstandigheden zou inzichtelijke zijn. Dit snelle en relatief eenvoudige protocol zal dergelijke studies mogelijk maken. Belangrijk is dat deze methode het isoleren van hoofd cellen van dezelfde individuen mogelijk maakt en dus kan worden gebruikt als het is om te bepalen of genetische en milieuparameters beide accessoireceltypen tegelijkertijd beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen openbaarmaking.
Acknowledgments
We zijn de leden van het Karch Lab, de iGE3 Genomics plateform, dankbaar voor de flow Cytometry kern faciliteit van de Universiteit van Genève, en voor Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye die het protocol voor FACS heeft ingesteld. We bedanken Luca Stickley voor zijn hulp bij het visualiseren van de leesbewerkingen op IGV. We danken onszelf voor de voorzichtige toestemming om cijfers te hergebruiken, en de redacteuren om ons te vragen creatief te zijn met schrijven.
Dit onderzoek werd gefinancierd door de staat Genève (CI, RKM, FK), het Zwitsers nationaal fonds voor onderzoek (www.snf.ch) (FK en RKM) en donaties van de Claraz Foundation (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
