Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60234

⸱

9 ноября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) переходят от состояния покоя к состоянию дифференциации из-за их метаболической пластичности во время формирования крови. Здесь мы представляем оптимизированный метод измерения митохондриального дыхания и гликолиза ГСПК.

Аннотация

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) имеют различные метаболические пластичности, что позволяет им перейти от их тихих состояние дифференциации государства для поддержания требований формирования крови. Тем не менее, было трудно проанализировать метаболический статус (митохондриальное дыхание и гликолиз) HSPCs из-за их ограниченного числа и отсутствие оптимизированных протоколов для неприсоединения, хрупкие HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций по измерению метаболического дыхания (коэффициент потребления кислорода; OCR) и гликолиз (внеклеточный уровень подкисления; ECAR) из морин костного мозга-ЛинияnegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs. Этот протокол обеспечивает большее количество LSK HSPCs из морин костного мозга, улучшает жизнеспособность HSPCs во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока неприсоединения HSPCs, и обеспечивает оптимизированные протоколы инъекций (концентрация и время) для препаратов, направленных на окислительный фосфорилирование и гликолитические пути. Этот метод позволяет прогнозировать метаболическое состояние и здоровье ГСпК при развитии крови и заболеваниях.

Введение

Так как продолжительность жизни большинства зрелых кровяных клеток коротка, гомеостаз крови опирается на самообновление и дифференциацию долгоживущей, но редкой популяции гематопоиетических стволовых клеток (HSPCs)1. HSPCs тихие, но они быстро размножаются и проходят дифференциацию при стимуляции для поддержания требований системы крови. Поскольку каждое клеточное состояние HSPC требует уникального биоэнергетического спроса, метаболические изменения являются ключевыми факторами решений судьбы HSPC. Таким образом, потеря метаболической пластичности, изменяя равновесие между quiescence, самообновления, и дифференциации HSPCs, часто приводит к миело- или лимфо-пролиферативных расстройств. Вместе понимание метаболической регуляции развития HSPC имеет решающее значение для выявления механизмов, лежащих в основе гематологических злокачественных новообразований2,3,4,5.

Митохондриальное дыхание и гликолиз генерируют АТФ для выработки внутриклеточных реакций и создания строительных блоков, необходимых для синтеза макромолекул. Так как HSPCs имеют низкую митохондриальную массу по сравнению с дифференцированными клетками6, и они поддерживают quiescence в гипоксических нишах костного мозга, HSPCs в первую очередь полагаются на гликолиза. Активация HSPCs повышает их митохондриальный метаболизм, что приводит к потере покоя и их последующего вступления в клеточный цикл. Такая метаболическая пластичность HSPCs позволяет обслуживание бассейна HSPC на протяжениивсейвзрослой жизни6,7,8,9,10,11,12. Поэтому крайне важно исследовать их метаболическую активность, такую как уровень потребления кислорода (OCR; индекс окислительного фосфорилирования) и внеклеточный уровень подкисления (ECAR; индекс гликолиза) для анализа активации HSPC и состояния здоровья. И OCR, и ECAR могут быть измерены одновременно, в режиме реального времени, с помощью внеклеточного анализатора потока. Тем не менее, текущий метод требует большого количества клеток и оптимизирован для клеток адептов13. Так как HSPCs не могут быть изолированы в больших количествах от мышей14, требуют сортировки для получения чистой популяции, являются неприсоединения клетки15, и не могут быть культивированы в одночасье, избегая дифференциации16, было трудно измерить OCR и ECAR HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций для сопровождения видео-уроки о том, как измерить метаболическое дыхание и гликолиз несколько тысяч морин костного мозга-LineagenegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Общенациональным комитетом по уходу за животными и использованию детей (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан в хронологическом порядке, который охватывает в течение двух дней. Используйте свежие реагенты, как описано в протоколе ниже.

1. Подготовка реагентов в день до асссея

  1. Гидратация датчика картриджа.
    1. Инкубировать 5 мл калибранта(Таблица материалов) в инкубаторе без CO2 37 градусов по Цельсию на ночь.
    2. Откройте набор ассеа требет(Таблица материалов)и отделите картридж датчика (зеленый; сверху) от пластины полезности (прозрачной; внизу). Затем поместите картридж датчика вверх дном и примыкающий к утилите пластины.
    3. Используя стерильную воду, заполните колодцы утилиты пластины (200 л) и камеры вокруг колодцев (400 л).
    4. Погрузите картридж датчика в утилиту пластины убедившись, что датчики полностью покрыты водой. Нажмите 3x, чтобы избежать образования пузырьков.
    5. Поместите картридж, погруженный в утилиту пластины в не-CO2 37 C инкубатор на ночь. Чтобы предотвратить испарение воды, убедитесь, что инкубатор правильно увлажняется. Поместите открытый стакан, содержащий H2O в качестве дополнительной меры предосторожности рядом с картриджом-полезной пластины, особенно при использовании обычной печи.
  2. Приготовьте тарелку асссея.
    1. Стерилизовать поверхность биобезопасности шкаф класса 2 с использованием 70% этанола. Откройте пластину для ассеа под капотом.
    2. Добавьте 40 qL коммерчески доступных 0,01% (w/v) поли-L-лизин (PLL) раствор для каждой скважины из асссе пластины под капотом.
    3. Обложка асссе пластины с крышкой, представленной в комплекте. Инкубировать закрытую пластину ассеа при комнатной температуре (RT) под капотом на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель инкубации заключается в том, чтобы PLL пальто поверхности ассеа пластины для облегчения сцепления подвесных клеток на поверхность пластины ассеа.
    4. После 1 ч инкубации пластины асссея удалите лишний раствор с помощью стерильного вакуумного аспиратора и просушите хорошо под капотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется 30-60 мин, чтобы просушить скважины пластины асссея после чрезмерного удаления PLL с помощью аспиратора.

2. День ассеа

  1. Приготовьте картридж.
    1. Поднимите картридж датчика. Поместите его вверх дном в капюшоне культуры тканей и отбросить воду из утилиты пластины.
    2. Заполните полезные скважины с 200 зл и золотом предварительно подогретого калибранта.
    3. Заполните камеры вокруг колодцев 400 зл калибранта.
    4. Погрузите картридж датчика в утилиту пластины, убедившись, что датчики полностью покрыты калибровкой. Нажмите 3x, чтобы избежать образования пузырьков.
    5. Равновесие картриджа датчика, погруженного в утилиту пластины в инкубаторе без CO2 37 градусов по Цельсию в течение 45–60 мин.
  2. Урожай морин костного мозга полученных LSK HSPCs.
    1. Для размещения достаточного количества биологических репликаций, планируйте использовать HSPCs, полученные из одной мыши на скважину пластины асссея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод сбора костного мозга обеспечивает 50 000-80 000 LSK HSPCs от каждой мыши. Этот протокол для измерения внеклеточного потока оптимизирован для 70 000 LSK HSPCs на скважину из 96 хорошо пластины.
    2. Эвтаназия мышей с использованием передозировки CO2 и вывихшей шейки матки, следуя местным методам IACUC утвержденных.
    3. Стерилизовать поверхность рассекающих инструментов и скамейки с помощью 70% этанола.
    4. Для каждой мыши предварительно заполнить одну чашку Петри с 1x фосфат-буферный солен (PBS), содержащий 2% тепла инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте предварительно охлажденный PBS, так как он создаст комки в следующих шагах.
    5. Спрей 70% этанола (v/v) на всю эвтаназию мышь. Изолировать все кости, в том числе верхние и нижние конечности, тазобедренные кости, грудину, грудную клетку и позвоночник, от мыши17,18. Вытяните белое вещество из спинного мозга мыши, поскольку оно может загрязнять клетки LSK. Поместите все кости в 1x PBS (2% FBS), как они собираются, в чашку Петри до дальнейшего использования.
    6. Переворачивать 50 мл конической трубки (новый каждый раз) и использовать его для тритурации костей погруженв в 1x PBS (2% FBS) в чашке Петри.
    7. Использование серологического пипетки 10 мл, пипетки вверх и вниз (10x) для равномерного вымотать клетки из костей, после дробления костей.
    8. Поместите 40 мкм ячейки ситечко на 50 мл конической трубки. Предварительно промокните поверхность ситечко, пройдя 1 мл 1x PBS (2% FBS).
    9. Урожай костного мозга полученных клеточной суспензии от шага 2.2.7 и передать его через предварительно мокрой поверхности клеточного ситечко для удаления костного мусора.
    10. Повторите шаги 2.2.6 до 2.2.9 до тех пор, пока все костные материалы не побелеют в качестве маркера, который большинство клеток костного мозга собирается в конической трубке 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто занимает два 50 мл конических труб на мышь, чтобы собрать все клетки костного мозга полученных.
    11. Центрифуга 50 мл конических труб, содержащих клетки костного мозга, полученные в течение 5 мин при 500 х г и RT.
    12. Удалите супернатант. Resuspend костного мозга полученных клеток (комбинат содержание обоих 50 мл труб) в 5 мл 1x PBS (2% FBS) в качестве окончательного объема и держать клетки на RT.
  3. Урожай мононуклиновых клеток костного мозга.
    1. Добавьте 5 мл среды градиента плотности (т.е. Ficoll) в коническую трубку 15 мл. Затем медленно добавьте 5 мл суспензии клеток костного мозга. Убедитесь, что клетки остаются в виде слоя выше среды градиента плотности.
    2. Центрифуга в течение 30 мин при 500 х г и RT. Не используйте тормоз в центрифуге. Убедитесь, что центрифуга находится на самом низком возможном ускорении (например, 1 ускорение и 0 замедление).
    3. Урожай средний интерфейс мононуклиновых клеток (белый цвет) после центрифугирования в свежий 15 мл конической трубки.
    4. Вымойте клетки, собранные из среды градиента плотности, с 5 мл 1x PBS (2% FBS). Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. c. Удалите супернатант.
    5. Повторите шаг 2.3.4.
    6. Приостановить содержание клеток трубки в 300 л 1x PBS (2% FBS). Aliquot 10 зл клеточной подвески для неокрашенного или одноцветного управления в трубке FACS.
  4. Урожай LSK HSPCs из мононуклиновых клеток костного мозга мокровина.
    1. Сделать коктейль из биотино-антител, смешивая 3 Зл на образец следующих антител: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Добавьте 15 кл/л биотино-антитела к 300 л мононуклиированных клеток костного мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело используется при 1:100 разбавления.
    2. Инкубировать клетки с биотином антитела коктейль в течение 30 минут при 4 кВ с волнением, чтобы избежать клеток слипаются в нижней части трубки.
    3. Добавьте 10 мл предварительно охлажденных 1x PBS (2% FBS) в клетки, смешанные с коктейлем из биотина-антитела.
    4. Центрифуге трубки в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. C. Откажитесь от супернатанта и приостановите действие клеточной гранулы в 400 л 1x PBS (2% FBS). Aliquot 10 зл для стрептавидина-однократного контроля цвета.
    5. Кратко вихрь анти-биотина микробусы (Таблица материалов) перед использованием. Добавьте 80 qL микробусов к каждому образцу клетки (из 400 л). Хорошо перемешайте и инкубировать еще 20 мин при 4 градусах По Цельсию, с возбуждением.
    6. Добавьте в клетки 10 мл предварительно охлажденных 1x PBS (2% FBS). Центрифуге трубки в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. C.
    7. Откажитесь от супернатанта и отразите клеточные гранулы в 1 мл 1x PBS (2% FBS). Храните при 4-c при настройке магнитного разделительного устройства.
    8. Поместите столбец(Таблица материалов) в магнитное поле сортировки магнитных клеток (MACS) при 4 градусах Цельсия. Подготовьте столбец для магнитного разделения, промыв его с 3 мл 1x PBS (2% FBS) под гравитационным потоком при 4 c.
    9. Добавьте суспензию ячейки со ступени 2.4.7 к предварительно мокрой колонке при 4 градусах Цельсия. Разрешить клеткам пройти через столбец при 4 градусах Цельсия и собирать сточные воды в конической трубке 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фракция с немаркированными клетками в таких сточных вод представляет обогащенную линию отрицательных клеток.
    10. Колонка мытья с 3 мл 1x PBS (2% FBS) при 4 градусах Цельсия. Повторите 3x. Соберите поток через и держать его на 4 градуса Цельсия. Подсчитайте eluted жизнеспособных клеток trypan синий исключение с помощью гемоситометра.
    11. Centrifuge коническая трубка 15 мл, содержащая протока в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. м. Отбросьте супернатант. Оттачивайте клетки в 0,5 мл 1x PBS (2% FBS) и перенесите содержимое в трубку FACS.
    12. Добавьте 24 злитровых коктейля с антителами LSK к каждому 10 7-клеток. Коктейль из антител содержит равную концентрацию антител 450 стрептавидинов, антител PE-CY7-Sca1 и антитела APC-c-Kit.
    13. Инкубировать в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия с возбуждением в темное время суток (покрыто фольгой).
    14. Добавьте 3 мл 1x PBS (2% FBS) в трубку FACS. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. c. Отбросьте супернатант.
    15. Приостановить действие клеток, маркированных антителами, в 1 мл 1x PBS (2% FBS). Добавьте 1 кВ 1 мг/мл пропидий йодида к клеточной подвеске непосредственно перед сортировкой.
    16. Содержимое фильтра трубки FACS с помощью 40 мкм ситечко прямо перед сортировкой клеток LSK.
    17. Сбор LSK клеток, с помощью сортировки FACS, в 1,5 мл трубки, содержащей 0,5 мл полного носителя дополнены 2 мм глутамина, 3 мг/мл глюкозы, 1 мм pyruvate, 1x тромбопоэтин (TPO), 1x фактор стволовых клеток (SCF), 0,5x пенициллин / streptomycin (P/S),1/

3. Митохондриальное дыхание и гликолиз анализы LSK HSPCs

  1. LSK посева в ассе пластины
    1. Центрифуги LSK клетки от шага 2.4.17 в течение 5 мин на 500 х г и RT. Отбросьте супернатант.
    2. Пристойная концентрация клеток в полных носителях до конечной концентрации не менее 70 000 ячеек/40 л.
    3. Содержимое семян 40 множеству (содержащего 70 000 клеток) в 8-колодской пластине с 8-ступенчатой пластиной 1.2.4. Оставьте все угловые колодцы пустыми.
    4. Центрифуга в течение 1 мин при 450 х г и RT. Не нанося тормоза. Убедитесь, что клетки прикрепляются к дну колодца с помощью перевернутого микроскопа.
    5. Добавьте 135 кЛ полных носителей в клетки в каждой скважине для окончательного объема 175 Л. Добавьте 175 л полных носителей в 2 угла пластины в виде заготовок.
    6. Инкубировать клетки в инкубаторе non-CO2 в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    7. Настройка программы для добавления лекарств к каждой скважине пластины в анализаторе с помощью метрики, описанной в таблице 2 (митохондриальный стресс-тест) и таблицы 3 (гликолиз стресс-тест).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как клетки инкубируют, включите инструмент и убедитесь, что он находится на 37 градусов по Цельсию.
  2. Митохондриальный стресс-тест
    1. Подготовьте 45 хм фондовых растворов олигомицина, 50 мкм карбонилового цианида 4-(трифлурометокси)фенилгидразон (FCCP) и 25 мкм фондовых растворов ротенона/антимицина А. Чтобы подготовить 45 мкм олигомицина, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 280 л из полных носителей. Чтобы подготовить решение по запасам 50 мКМ FCCP, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 288 л из полного носителя. Чтобы подготовить 25 мкм rotenone/antimycin A биржевого раствора, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 216 зл.
    2. Возьмите картридж датчика в утилите пластины из инкубатора и загрузить его порты (A, B, и C), так что каждая скважина будет иметь окончательную концентрацию 2 ММ олигомицина, 1,5 ММ FCCP, и 0,5 мкм ротенона / антимицина По мере необходимости, после разбавления метрик, описанных в таблице 4 (для коэффициента потребления кислорода).
    3. Снимите крышку с картриджа датчика, собранного в пластине утилиты, и поместите ее на поднос инструмента. Начните калибровку, которая займет 20 минут.
    4. После калибровки снимите пластину и замените ее пластиной, содержащей LSK-клетки, которые теперь прилипают к нижней части колодца.
    5. Пресс Продолжить, чтобы начать программу, описанную в таблице 2. После завершения программы, получить данные и проанализировать их с помощью программного обеспечения Wave Desktop.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, генерируемые из внеклеточных анализов потока, могут быть построены с помощью точечного участка из программного обеспечения Wave Desktop или экспортируются в веб-программу статистики.
  3. Гликолиз стресс-тест
    1. Восстановите глюкозу в 300 кл (100 мМ), олигомицин в 288 л (50 мкм), 2-D глюкозы (2-DG) в 300 Л (500 мм) полного носителя из коммерчески доступной сумки.
    2. Аккуратно пипетка вверх и вниз (10x), чтобы утолить соединений. Vortex 2-DG в течение примерно 1 мин для обеспечения надлежащего растворения в средствах массовой информации.
    3. Удалите картридж датчика из инкубатора. Загрузка портов A через C следующие показатели разбавления, описанные в таблице 5, чтобы получить окончательную концентрацию глюкозы 10 мМ, 2 мкм олигомицина и 50 мМ 2-DG.
    4. Повторите шаги 3.2.3 и 3.2.4.
    5. Пресс Продолжить, чтобы начать программу, описанную в таблице 3. После завершения программы, получить данные и проанализировать их с помощью программного обеспечения Wave Desktop.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наш метод извлечения позволил нам собрать до 80 000 LSK HSPCs на мышь. Жизнеспособность и количество lSK клеток были улучшены с нашим методом, потому что мы: (1) комбинированный костный мозг из верхних и нижних конечностей, тазобедренных костей, грудины, грудной клетки и позвоночника, (2) избежать использования красноклеточного лизиса буфера, что бы увеличить клеточной смерти и слипание, (3) использовали градиентплотное среднее разделение мононуклеадных клеток и (4) избегали использования предварительно охлажденного буфе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем изоляцию максимального количества чистого и жизнеспособного мурина популяции LSK HSPCs, а также измерение их гликолиза и митохондриального дыхания с помощью внеклеточного анализатора потока. В частности, протокол преодолевает следующие технические вопросы для использования LSK HSPCs : i) низкая частота LSK HSPCs в murine костного мозга14,ii) низкая базальная метаболическая активность LSK HSPCs26, iii) хрупкость LSK HSPCs27,и iv...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа частично поддерживается при финансовой поддержке Национальных институтов здравоохранения (HL131645, CA016058), Фонда Святого Болдрика и Фонда Пелотонии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,01% (w/v) раствор поли-L-лизинаSigmaP8920Используется для насадки LSK
40 и микро; m клеточное ситечкоFisher Scientific22-363-547Используется для фильтрации клеток после дробления костей
Антибиотиновые микрогранулыMiltenyi130-090-485Используется для лин- разделения
биотина крысы против мыши CD45R/B220 клон RA3-6B2BD Biosciences553086используется для лин- разделения
биотина крысы против мыши CD5 клон 53-7.3BD Biosciences553019используется для лин- сепарация
биотина крысы антимышиный клон CD8a 53-6.7BD Biosciences553029используется для лин- разделения
биотина крысы антимышиный клон Ly-6G и Ly-6C RB6-8C5BD Biosciences553125используется для лин- разделения
биотина крысы антимышиный TER-119/эритроидные клетки клон TER-119BD Biosciences553672используется для лин- разделения
CD117 (c-kit) моноклональное антитело (2B8), APCeBioscience17-1171-83Используется для сортировки LSK
Falcon 15 мл Конические центрифужные пробиркиFalcon-Fischer Scientific14-959-53AИспользуются в клеточной изоляции
Falcon 50 мл Конические центрифужные пробиркиFalcon-Fischer Scientific14-432-22Используются в изоляции клеток
Falcon Круглодонные полипропиленовые пробиркиFalcon-Fischer Scientific14-959-11AИспользуются для Сортировка LSK
Фетальная бычья сывороткаNeuromicsFBS001-HIИспользуется в буфере FACS
Histopaque-1083Sigma10831Используется для разделения градиента фиколла
L-глутамин 100xFisher Scientific25-030-081Используется для пробирной среды
LS КолонкаMiltenyi130-042-401Используется для лин- разделения
Ly-6A/E (Sca-1) Моноклональный Антитело (D7), PE-Cyanine7eBioscience25-5981-82Используется для сортировки LSK
Фактор стволовых клеток мыши (SCF)PeproTech250-03-100UGИспользуется для среды для анализа
Мышиный тромбопоэтин (TPO)PeproTech315-14-100UGИспользуется для среды для анализа
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802Используется для буфера FACS
Пенициллин-стрептомицин ( 10 000 Ед/мл)Fisher Scientific15140122Используется для анализа пробирных сред
Propidium IodideFisher ScientificP1304MPИспользуется для сортировки LSK
Seahorse XFp Cell Culture MiniplateAgilent Technologies103025-100Используется для посева LSK
пируват натрия (100 мМ)ThermoFisher11360070Используется для анализа среды
для анализа стрептавидина eFluor 450 КонъюгатeBioscience48-4317-82Используется для сортировки LSK
XF CalibrantAgilent Technologies100840-000Используется для балансировки картриджей
XF Медиа AgilentTechnologies103575-100Используется для анализа сред
XFp Гликолиз Набор для стресс-тестовAgilent Technologies103017100Препараты для гликолиза Стресс-тест
XFp Mitochondrial Набор для стресс-тестовAgilent Technologies103010100Препараты для митохондриального стресс-теста
Картридж датчика XFpAgilent Technologies103022-100Используется для гликолиза и митохондриального стресс-теста

Ссылки

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125(2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901(2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гемопоэтические стволовые клетки-предшественникианализ метаболического дыханияизмерение гликолизаанализ внеклеточного потокавыделение костного мозгамагнитная сепарация клетокпроточная цитометрияскорость потребления кислородаскорость внеклеточного закислениялунки с поли-L-лизиновым покрытием
Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.