Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) переходят от состояния покоя к состоянию дифференциации из-за их метаболической пластичности во время формирования крови. Здесь мы представляем оптимизированный метод измерения митохондриального дыхания и гликолиза ГСПК.

Abstract

Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) имеют различные метаболические пластичности, что позволяет им перейти от их тихих состояние дифференциации государства для поддержания требований формирования крови. Тем не менее, было трудно проанализировать метаболический статус (митохондриальное дыхание и гликолиз) HSPCs из-за их ограниченного числа и отсутствие оптимизированных протоколов для неприсоединения, хрупкие HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций по измерению метаболического дыхания (коэффициент потребления кислорода; OCR) и гликолиз (внеклеточный уровень подкисления; ECAR) из морин костного мозга-ЛинияnegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs. Этот протокол обеспечивает большее количество LSK HSPCs из морин костного мозга, улучшает жизнеспособность HSPCs во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока неприсоединения HSPCs, и обеспечивает оптимизированные протоколы инъекций (концентрация и время) для препаратов, направленных на окислительный фосфорилирование и гликолитические пути. Этот метод позволяет прогнозировать метаболическое состояние и здоровье ГСпК при развитии крови и заболеваниях.

Introduction

Так как продолжительность жизни большинства зрелых кровяных клеток коротка, гомеостаз крови опирается на самообновление и дифференциацию долгоживущей, но редкой популяции гематопоиетических стволовых клеток (HSPCs)1. HSPCs тихие, но они быстро размножаются и проходят дифференциацию при стимуляции для поддержания требований системы крови. Поскольку каждое клеточное состояние HSPC требует уникального биоэнергетического спроса, метаболические изменения являются ключевыми факторами решений судьбы HSPC. Таким образом, потеря метаболической пластичности, изменяя равновесие между quiescence, самообновления, и дифференциации HSPCs, часто приводит к миело- или лимфо-пролиферативных расстройств. Вместе понимание метаболической регуляции развития HSPC имеет решающее значение для выявления механизмов, лежащих в основе гематологических злокачественных новообразований2,3,4,5.

Митохондриальное дыхание и гликолиз генерируют АТФ для выработки внутриклеточных реакций и создания строительных блоков, необходимых для синтеза макромолекул. Так как HSPCs имеют низкую митохондриальную массу по сравнению с дифференцированными клетками6, и они поддерживают quiescence в гипоксических нишах костного мозга, HSPCs в первую очередь полагаются на гликолиза. Активация HSPCs повышает их митохондриальный метаболизм, что приводит к потере покоя и их последующего вступления в клеточный цикл. Такая метаболическая пластичность HSPCs позволяет обслуживание бассейна HSPC на протяжениивсейвзрослой жизни6,7,8,9,10,11,12. Поэтому крайне важно исследовать их метаболическую активность, такую как уровень потребления кислорода (OCR; индекс окислительного фосфорилирования) и внеклеточный уровень подкисления (ECAR; индекс гликолиза) для анализа активации HSPC и состояния здоровья. И OCR, и ECAR могут быть измерены одновременно, в режиме реального времени, с помощью внеклеточного анализатора потока. Тем не менее, текущий метод требует большого количества клеток и оптимизирован для клеток адептов13. Так как HSPCs не могут быть изолированы в больших количествах от мышей14, требуют сортировки для получения чистой популяции, являются неприсоединения клетки15, и не могут быть культивированы в одночасье, избегая дифференциации16, было трудно измерить OCR и ECAR HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций для сопровождения видео-уроки о том, как измерить метаболическое дыхание и гликолиз несколько тысяч морин костного мозга-LineagenegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол был одобрен Общенациональным комитетом по уходу за животными и использованию детей (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан в хронологическом порядке, который охватывает в течение двух дней. Используйте свежие реагенты, как описано в протоколе ниже.

1. Подготовка реагентов в день до асссея

  1. Гидратация датчика картриджа.
    1. Инкубировать 5 мл калибранта(Таблица материалов) в инкубаторе без CO2 37 градусов по Цельсию на ночь.
    2. Откройте набор ассеа требет(Таблица материалов)и отделите картридж датчика (зеленый; сверху) от пластины полезности (прозрачной; внизу). Затем поместите картридж датчика вверх дном и примыкающий к утилите пластины.
    3. Используя стерильную воду, заполните колодцы утилиты пластины (200 л) и камеры вокруг колодцев (400 л).
    4. Погрузите картридж датчика в утилиту пластины убедившись, что датчики полностью покрыты водой. Нажмите 3x, чтобы избежать образования пузырьков.
    5. Поместите картридж, погруженный в утилиту пластины в не-CO2 37 C инкубатор на ночь. Чтобы предотвратить испарение воды, убедитесь, что инкубатор правильно увлажняется. Поместите открытый стакан, содержащий H2O в качестве дополнительной меры предосторожности рядом с картриджом-полезной пластины, особенно при использовании обычной печи.
  2. Приготовьте тарелку асссея.
    1. Стерилизовать поверхность биобезопасности шкаф класса 2 с использованием 70% этанола. Откройте пластину для ассеа под капотом.
    2. Добавьте 40 qL коммерчески доступных 0,01% (w/v) поли-L-лизин (PLL) раствор для каждой скважины из асссе пластины под капотом.
    3. Обложка асссе пластины с крышкой, представленной в комплекте. Инкубировать закрытую пластину ассеа при комнатной температуре (RT) под капотом на 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель инкубации заключается в том, чтобы PLL пальто поверхности ассеа пластины для облегчения сцепления подвесных клеток на поверхность пластины ассеа.
    4. После 1 ч инкубации пластины асссея удалите лишний раствор с помощью стерильного вакуумного аспиратора и просушите хорошо под капотом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется 30-60 мин, чтобы просушить скважины пластины асссея после чрезмерного удаления PLL с помощью аспиратора.

2. День ассеа

  1. Приготовьте картридж.
    1. Поднимите картридж датчика. Поместите его вверх дном в капюшоне культуры тканей и отбросить воду из утилиты пластины.
    2. Заполните полезные скважины с 200 зл и золотом предварительно подогретого калибранта.
    3. Заполните камеры вокруг колодцев 400 зл калибранта.
    4. Погрузите картридж датчика в утилиту пластины, убедившись, что датчики полностью покрыты калибровкой. Нажмите 3x, чтобы избежать образования пузырьков.
    5. Равновесие картриджа датчика, погруженного в утилиту пластины в инкубаторе без CO2 37 градусов по Цельсию в течение 45–60 мин.
  2. Урожай морин костного мозга полученных LSK HSPCs.
    1. Для размещения достаточного количества биологических репликаций, планируйте использовать HSPCs, полученные из одной мыши на скважину пластины асссея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод сбора костного мозга обеспечивает 50 000-80 000 LSK HSPCs от каждой мыши. Этот протокол для измерения внеклеточного потока оптимизирован для 70 000 LSK HSPCs на скважину из 96 хорошо пластины.
    2. Эвтаназия мышей с использованием передозировки CO2 и вывихшей шейки матки, следуя местным методам IACUC утвержденных.
    3. Стерилизовать поверхность рассекающих инструментов и скамейки с помощью 70% этанола.
    4. Для каждой мыши предварительно заполнить одну чашку Петри с 1x фосфат-буферный солен (PBS), содержащий 2% тепла инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте предварительно охлажденный PBS, так как он создаст комки в следующих шагах.
    5. Спрей 70% этанола (v/v) на всю эвтаназию мышь. Изолировать все кости, в том числе верхние и нижние конечности, тазобедренные кости, грудину, грудную клетку и позвоночник, от мыши17,18. Вытяните белое вещество из спинного мозга мыши, поскольку оно может загрязнять клетки LSK. Поместите все кости в 1x PBS (2% FBS), как они собираются, в чашку Петри до дальнейшего использования.
    6. Переворачивать 50 мл конической трубки (новый каждый раз) и использовать его для тритурации костей погруженв в 1x PBS (2% FBS) в чашке Петри.
    7. Использование серологического пипетки 10 мл, пипетки вверх и вниз (10x) для равномерного вымотать клетки из костей, после дробления костей.
    8. Поместите 40 мкм ячейки ситечко на 50 мл конической трубки. Предварительно промокните поверхность ситечко, пройдя 1 мл 1x PBS (2% FBS).
    9. Урожай костного мозга полученных клеточной суспензии от шага 2.2.7 и передать его через предварительно мокрой поверхности клеточного ситечко для удаления костного мусора.
    10. Повторите шаги 2.2.6 до 2.2.9 до тех пор, пока все костные материалы не побелеют в качестве маркера, который большинство клеток костного мозга собирается в конической трубке 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто занимает два 50 мл конических труб на мышь, чтобы собрать все клетки костного мозга полученных.
    11. Центрифуга 50 мл конических труб, содержащих клетки костного мозга, полученные в течение 5 мин при 500 х г и RT.
    12. Удалите супернатант. Resuspend костного мозга полученных клеток (комбинат содержание обоих 50 мл труб) в 5 мл 1x PBS (2% FBS) в качестве окончательного объема и держать клетки на RT.
  3. Урожай мононуклиновых клеток костного мозга.
    1. Добавьте 5 мл среды градиента плотности (т.е. Ficoll) в коническую трубку 15 мл. Затем медленно добавьте 5 мл суспензии клеток костного мозга. Убедитесь, что клетки остаются в виде слоя выше среды градиента плотности.
    2. Центрифуга в течение 30 мин при 500 х г и RT. Не используйте тормоз в центрифуге. Убедитесь, что центрифуга находится на самом низком возможном ускорении (например, 1 ускорение и 0 замедление).
    3. Урожай средний интерфейс мононуклиновых клеток (белый цвет) после центрифугирования в свежий 15 мл конической трубки.
    4. Вымойте клетки, собранные из среды градиента плотности, с 5 мл 1x PBS (2% FBS). Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. c. Удалите супернатант.
    5. Повторите шаг 2.3.4.
    6. Приостановить содержание клеток трубки в 300 л 1x PBS (2% FBS). Aliquot 10 зл клеточной подвески для неокрашенного или одноцветного управления в трубке FACS.
  4. Урожай LSK HSPCs из мононуклиновых клеток костного мозга мокровина.
    1. Сделать коктейль из биотино-антител, смешивая 3 Зл на образец следующих антител: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Добавьте 15 кл/л биотино-антитела к 300 л мононуклиированных клеток костного мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело используется при 1:100 разбавления.
    2. Инкубировать клетки с биотином антитела коктейль в течение 30 минут при 4 кВ с волнением, чтобы избежать клеток слипаются в нижней части трубки.
    3. Добавьте 10 мл предварительно охлажденных 1x PBS (2% FBS) в клетки, смешанные с коктейлем из биотина-антитела.
    4. Центрифуге трубки в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. C. Откажитесь от супернатанта и приостановите действие клеточной гранулы в 400 л 1x PBS (2% FBS). Aliquot 10 зл для стрептавидина-однократного контроля цвета.
    5. Кратко вихрь анти-биотина микробусы (Таблица материалов) перед использованием. Добавьте 80 qL микробусов к каждому образцу клетки (из 400 л). Хорошо перемешайте и инкубировать еще 20 мин при 4 градусах По Цельсию, с возбуждением.
    6. Добавьте в клетки 10 мл предварительно охлажденных 1x PBS (2% FBS). Центрифуге трубки в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. C.
    7. Откажитесь от супернатанта и отразите клеточные гранулы в 1 мл 1x PBS (2% FBS). Храните при 4-c при настройке магнитного разделительного устройства.
    8. Поместите столбец(Таблица материалов) в магнитное поле сортировки магнитных клеток (MACS) при 4 градусах Цельсия. Подготовьте столбец для магнитного разделения, промыв его с 3 мл 1x PBS (2% FBS) под гравитационным потоком при 4 c.
    9. Добавьте суспензию ячейки со ступени 2.4.7 к предварительно мокрой колонке при 4 градусах Цельсия. Разрешить клеткам пройти через столбец при 4 градусах Цельсия и собирать сточные воды в конической трубке 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фракция с немаркированными клетками в таких сточных вод представляет обогащенную линию отрицательных клеток.
    10. Колонка мытья с 3 мл 1x PBS (2% FBS) при 4 градусах Цельсия. Повторите 3x. Соберите поток через и держать его на 4 градуса Цельсия. Подсчитайте eluted жизнеспособных клеток trypan синий исключение с помощью гемоситометра.
    11. Centrifuge коническая трубка 15 мл, содержащая протока в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. м. Отбросьте супернатант. Оттачивайте клетки в 0,5 мл 1x PBS (2% FBS) и перенесите содержимое в трубку FACS.
    12. Добавьте 24 злитровых коктейля с антителами LSK к каждому 10 7-клеток. Коктейль из антител содержит равную концентрацию антител 450 стрептавидинов, антител PE-CY7-Sca1 и антитела APC-c-Kit.
    13. Инкубировать в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия с возбуждением в темное время суток (покрыто фольгой).
    14. Добавьте 3 мл 1x PBS (2% FBS) в трубку FACS. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г и 4 кв. c. Отбросьте супернатант.
    15. Приостановить действие клеток, маркированных антителами, в 1 мл 1x PBS (2% FBS). Добавьте 1 кВ 1 мг/мл пропидий йодида к клеточной подвеске непосредственно перед сортировкой.
    16. Содержимое фильтра трубки FACS с помощью 40 мкм ситечко прямо перед сортировкой клеток LSK.
    17. Сбор LSK клеток, с помощью сортировки FACS, в 1,5 мл трубки, содержащей 0,5 мл полного носителя дополнены 2 мм глутамина, 3 мг/мл глюкозы, 1 мм pyruvate, 1x тромбопоэтин (TPO), 1x фактор стволовых клеток (SCF), 0,5x пенициллин / streptomycin (P/S),1/

3. Митохондриальное дыхание и гликолиз анализы LSK HSPCs

  1. LSK посева в ассе пластины
    1. Центрифуги LSK клетки от шага 2.4.17 в течение 5 мин на 500 х г и RT. Отбросьте супернатант.
    2. Пристойная концентрация клеток в полных носителях до конечной концентрации не менее 70 000 ячеек/40 л.
    3. Содержимое семян 40 множеству (содержащего 70 000 клеток) в 8-колодской пластине с 8-ступенчатой пластиной 1.2.4. Оставьте все угловые колодцы пустыми.
    4. Центрифуга в течение 1 мин при 450 х г и RT. Не нанося тормоза. Убедитесь, что клетки прикрепляются к дну колодца с помощью перевернутого микроскопа.
    5. Добавьте 135 кЛ полных носителей в клетки в каждой скважине для окончательного объема 175 Л. Добавьте 175 л полных носителей в 2 угла пластины в виде заготовок.
    6. Инкубировать клетки в инкубаторе non-CO2 в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
    7. Настройка программы для добавления лекарств к каждой скважине пластины в анализаторе с помощью метрики, описанной в таблице 2 (митохондриальный стресс-тест) и таблицы 3 (гликолиз стресс-тест).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как клетки инкубируют, включите инструмент и убедитесь, что он находится на 37 градусов по Цельсию.
  2. Митохондриальный стресс-тест
    1. Подготовьте 45 хм фондовых растворов олигомицина, 50 мкм карбонилового цианида 4-(трифлурометокси)фенилгидразон (FCCP) и 25 мкм фондовых растворов ротенона/антимицина А. Чтобы подготовить 45 мкм олигомицина, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 280 л из полных носителей. Чтобы подготовить решение по запасам 50 мКМ FCCP, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 288 л из полного носителя. Чтобы подготовить 25 мкм rotenone/antimycin A биржевого раствора, растворите содержимое коммерчески доступной сумки в 216 зл.
    2. Возьмите картридж датчика в утилите пластины из инкубатора и загрузить его порты (A, B, и C), так что каждая скважина будет иметь окончательную концентрацию 2 ММ олигомицина, 1,5 ММ FCCP, и 0,5 мкм ротенона / антимицина По мере необходимости, после разбавления метрик, описанных в таблице 4 (для коэффициента потребления кислорода).
    3. Снимите крышку с картриджа датчика, собранного в пластине утилиты, и поместите ее на поднос инструмента. Начните калибровку, которая займет 20 минут.
    4. После калибровки снимите пластину и замените ее пластиной, содержащей LSK-клетки, которые теперь прилипают к нижней части колодца.
    5. Пресс Продолжить, чтобы начать программу, описанную в таблице 2. После завершения программы, получить данные и проанализировать их с помощью программного обеспечения Wave Desktop.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, генерируемые из внеклеточных анализов потока, могут быть построены с помощью точечного участка из программного обеспечения Wave Desktop или экспортируются в веб-программу статистики.
  3. Гликолиз стресс-тест
    1. Восстановите глюкозу в 300 кл (100 мМ), олигомицин в 288 л (50 мкм), 2-D глюкозы (2-DG) в 300 Л (500 мм) полного носителя из коммерчески доступной сумки.
    2. Аккуратно пипетка вверх и вниз (10x), чтобы утолить соединений. Vortex 2-DG в течение примерно 1 мин для обеспечения надлежащего растворения в средствах массовой информации.
    3. Удалите картридж датчика из инкубатора. Загрузка портов A через C следующие показатели разбавления, описанные в таблице 5, чтобы получить окончательную концентрацию глюкозы 10 мМ, 2 мкм олигомицина и 50 мМ 2-DG.
    4. Повторите шаги 3.2.3 и 3.2.4.
    5. Пресс Продолжить, чтобы начать программу, описанную в таблице 3. После завершения программы, получить данные и проанализировать их с помощью программного обеспечения Wave Desktop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наш метод извлечения позволил нам собрать до 80 000 LSK HSPCs на мышь. Жизнеспособность и количество lSK клеток были улучшены с нашим методом, потому что мы: (1) комбинированный костный мозг из верхних и нижних конечностей, тазобедренных костей, грудины, грудной клетки и позвоночника, (2) избежать использования красноклеточного лизиса буфера, что бы увеличить клеточной смерти и слипание, (3) использовали градиентплотное среднее разделение мононуклеадных клеток и (4) избегали использования предварительно охлажденного буфера, что привело бы к потере интересов ячеек в скоплениях.

Хотя внеклеточный анализ потока традиционно используется для клеток адептов, наше использование PLL покрытия скважин, а затем центрифугирование клеток на нем, способствовало присоединению LSK HSPCs к поверхности скважины. Это позволило нам измерить внеклеточный поток, и, таким образом, метаболическое здоровье LSK HSPCs. Учитывая ограниченное количество клеток, которые могут быть собраны из мыши и продолжительность протокола для их изоляции, наше использование анализатора с его 8 хорошо формат стал наиболее экономически эффективным и осуществимым решением (Рисунок 1).

Клетки используют гликолиз и митохондрийное дыхание для пополнения своих энергетических потребностей и для производства промежуточных, необходимых для их распространения и роста19. Фермент гексокиназа преобразует глюкозу в глюкозу-6-фосфат и впоследствии превращается в пируват20. Pyruvate может быть обработан в лактат и экспортируется из клетки с протонами21. ECAR измеряет подкисление средств массовой информации и, таким образом, является индикатором гликолиза. Пирувате также можно транспортировать в митохондрии и трансформировать в ацетилкоэнзим А (CoA). Acetyl CoA входит в цикл TCA, который обеспечивает энергетические промежуточные для привода движения электронов сети электронных перевозок (ETC) и генерирует градиент протона в митохондриальном межмеманом пространстве22. Кислород действует как конечный приемэлектрон, и протоны вернуться к митохондриальной матрицы через комплекс атф синтезаторпри при генерации АТФ23. OCR измеряет потребление кислорода и поэтому используется для количественной оценки митохондриального дыхания.

Для того, чтобы проанализировать OCR и ECAR в базальных и подчеркнул условиях, мы использовали последовательные инъекции препаратов, которые мешают гликолизии и митохондриального дыхания. Мы использовали глюкозу и 2-дезоксиглюкозу (2-DG), аналог глюкозы, чтобы инициировать и блокировать гликолиз соответственно24. Мы использовали Rotenone (комплекс I-специфический ингибитор ETC), антимицин А (комплекс III-специфический ингибитор ETC), олигомицин (ингибитор синтазы АТФ) и разъединяющий агент карбонила цианида-4-(трифторометцось)фенилгидразон (FCCP) для блокирования конкретных событий ETC25. Мы озарели такие реагенты, чтобы найти оптимальную концентрацию для ЛКС ГСПК(рисунок 2A,B).

Для выполнения стресс-теста на гликолиз мы культивировали LSK HSPCs в глюкозе/пирувате, лишенном средств массовой информации (по рекомендации производителя) или в глюкозе/пирувате, содержащем носители. Как и ожидалось, мы обнаружили, что базальный уровень ECAR был выше для LSK HSPCs, культивированных в глюкозе / pyruvate сми по сравнению с LSK HSPCs культивировалвав в глюкозе / pyruvate-СМИ. Первая инъекция с глюкозой не изменила базальный уровень ECAR для LSK HSPCs, культивируется в глюкозе /пирувате-носителях, в то время как она увеличила гликолиз в LSK HSPCs, культивируется в глюкозе/пирувате-носителях. Тем не менее, базальный уровень ECAR, после инъекции с глюкозой, оставался ниже по сравнению с глюкозой / pyruvate группы. Вторая инъекция с олигомицином, которая могла блокировать выработку АТФ через окислительный фосфорилирование, активировала гликолиз на максимальном уровне LSK HSPCs в глюкозе/пирувате, но не повлияла на глюкозу/пируват-группу. Последняя инъекция с аналогом глюкозы 2-DG вернула ECAR на негликолитический уровень(рисунок 2C).

Для митохондриального стресс-теста мы измерили базальный уровень OCR LSK HSPCs в глюкозе/пирувате. Сначала мы ввели олигомицин, который первоначально гиперполяровал митохондриальную мембрану, предотвратил более протонную протонную протонную протону через комплексы ETC и тем самым снизил скорость митохондриального дыхания. Вторая инъекция ионофоров FCCP подтолкнула уровни ETC и OCR к максимуму, поскольку клетки пытались восстановить потенциал митохондриальной мембраны. Окончательная инъекция с двумя другими ингибиторами ETC (антимицин А и ротенон) вызвала полную остановку митохондриального дыхания и, таким образом, OCR вернулся к своему минимальному уровню(рисунок 2D).

Figure 1
Рисунок 1: Схема, демонстрирующая изоляцию Lineageneg Sca1иc-Kit (LSK) гематопоиетические стволовые клетки-предтечи из костного мозга мыши. Костный мозг извлекается из костей и моноядерных клеток (МНК) изолированы через плотность градиента среднего градиента разделения. Далее, клетки инкубируются с биотинилатами Lineage- антитела и стрептавидин-конъюгированные магнитные бусы, чтобы elute Lineage отрицательных (Lin- )клеток после их магнитного разделения. Лин- клетки впоследствии инкубируются с антителами LSK и LSK клетки изолированы путем сортировки клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Внеклеточный анализ потока мурин Lineage negSca1иc-Kit (LSK) гематопоиэтидные стволовые клетки-прародители. (A, B) Механистовое описание препаратов, используемых для внеклеточного анализа потока при гликолизе и митохондриальном дыхании. (C) Представитель результаты гликолиза стресс-тест на мурин LSK HSPCs при наличии или отсутствии глюкозы / пирувата в средствах массовой информации. (D) Репрезентативные результаты митохондриального стресс-теста на murine LSK HSPCs. Ошибки баров представляют собой стандартное отклонение среднего (S.D.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Фондовая Окончательная концентрация Объем 30 мл
Полное мультимедиа 28,691 мл л.
P/S 100x 0,5x 150 л
Л-глютамин 200 мМ 2 мМ 300 л
Пирувате 100 мМ 1 мМ 300 л
Глюкозы 1 М/180,2 мг/мл 3 мг/мл 499,4 л л
Тпо 100 мкг/мл 100 нг/мл 30 зл
Scf 100 мкг/мл 100 нг/мл 30 зл

Таблица 1: Содержание и подготовка полного XF-носителя.

Базальной Олигомицин (2 мкм) FCCP (1,5 км) R/A (0,5 мкм)
Повторения 3 раза 3 раза 3 раза 3 раза
Смесь 3 мин. 3 мин. 3 мин. 3 мин.
Подожди 0 мин. 0 мин. 0 мин. 0 мин.
Измерения 4 мин. 4 мин. 4 мин. 4 мин.

Таблица 2: Протокол инъекций для митохондриального стресс-теста.

Базальной Глюкоза (10 мМ) Олигомицин (2 мкм) 2-DG (50 мМ)
Повторения 3 раза 3 раза 3 раза 3 раза
Смесь 3 мин. 3 мин. 3 мин. 3 мин.
Подожди 0 мин. 0 мин. 0 мин. 0 мин.
Измерения 7 мин. 7 мин. 7 мин. 7 мин.

Таблица 3: Протокол инъекций для стресс-теста на гликолиз.

Порт Наркотиков Окончательная концентрация скважины (мКм) Объем стокового раствора (Зл) Объем мультимедиа (КЛ) Портовое решение (мМ) Объем, добавленный в порт (КЛ)
Порт А Олигомицин 2 100 181.25 16 25
Порт B FCCP 1.5 100 270.4 13.5 25
Порт C Ротеноне/антимицин А 0.5 60 240 5 25

Таблица 4: Показатели разбавления для получения оптимальной концентрации препарата для митохондриального стресс-теста в каждой скважине анализатора.

Порт Наркотиков Окончательная концентрация скважины Объем стокового раствора (Зл) Объем мультимедиа (КЛ) Портовое решение Объем, добавленный в порт (КЛ)
Порт А Глюкозы 10 мМ 300 75 80 мМ 25
Порт B Олигомицин 2 мкм 108 192 18 км 25
Порт C 2-DG 50 мМ 300 0 500 мМ 25

Таблица 5: Показатели разбавления для получения оптимальной концентрации препарата для стресс-теста на гликолиз в каждом колодце анализатора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы демонстрируем изоляцию максимального количества чистого и жизнеспособного мурина популяции LSK HSPCs, а также измерение их гликолиза и митохондриального дыхания с помощью внеклеточного анализатора потока. В частности, протокол преодолевает следующие технические вопросы для использования LSK HSPCs : i) низкая частота LSK HSPCs в murine костного мозга14,ii) низкая базальная метаболическая активность LSK HSPCs26, iii) хрупкость LSK HSPCs27,и iv) несоблюдение LSK HSPCs к культуре судов15. Кроме того, мы оптимизировали концентрацию препарата и состав носителей для оптимальной производительности внеклеточного потока анализов.

Костного мозга полученных HSPCs проживают в гипоксической нише, и они отображают гликолитический фенотип, который имеет решающее значение для поддержания их стебли28. И наоборот, дыхание имеет важное значение для дифференциации HSPC6. Как метаболическая дисфункция HSPCs приводит к заболеваниям крови; здесь мы описали протокол и видео-учебники для измерения отличительных черт метаболических функций, таких как OCR и ECAR, для murine костного мозга полученных LSK HSPCs.

Вопреки рекомендациям производителя для клеток адептов, мы обнаружили, что результаты стресс-теста на гликолиз на LSK HSPCs являются оптимальными, когда клетки культивируются в глюкозе /пирувате- носителях по сравнению с глюкозой/пируват-медиа. Мы поняли, что недостаток глюкозы в средствах массовой информации для LSK HSPCs приводит к гибели клеток в период равновесия в 2 ч в инкубаторе, не относящемуся к CO2. Поскольку инъекция глюкозы не изменила базальный уровень ECAR для LSK HSPCs, культивированный в глюкозе/пирувате, наша модификация протокола не только сохраняет суть гликолитического стресс-теста, но и позволяет различать базальный гликолиз (до любых инъекций), гликолитический потенциал (после инъекции олигомицина) и негликолиточная подкисление (после инъекции с 2-ДГ) ЛСК ГСПК.

Наш митохондриальный стресс-тест LSK HSPCs показал, что АТФ, производимый оксидативным фосфорилированием в LSK HSPCs, является минимальным, как видно с небольшим снижением OCR после инъекции олигомицина. И наоборот, высота в OCR на инъекции FCCP подтверждает, что LSK HSPCs способны реагировать на более высокий спрос на энергию.

Вместе, цель этого протокола состояла в том, чтобы обеспечить набор четких, кратких инструкций для сопровождения видео-уроки о том, как измерить метаболические функции, такие как OCR и ECAR, HSPCs. С ключевыми изменениями и дополнительными рекомендациями для сбора больших чисел здоровых LSK HSPCs, что делает их приверженцами на поверхности скважины, а также оптимизации времени инкубации и концентрации наркотиков, этот протокол позволит исследователи для анализа гликолиза и митохондриального дыхания статус HSPCs, а также неприсоединения гематопоитических клеток во время развития крови и заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа частично поддерживается при финансовой поддержке Национальных институтов здравоохранения (HL131645, CA016058), Фонда Святого Болдрика и Фонда Пелотонии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

Биология развития Выпуск 153 гематопоитетические стволовые клетки-предродители обмен веществ митохондриальное дыхание гликолиз внеклеточный анализ потока неприсоединения клеток
Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter