Summary
造血干细胞（HSPCs）由于血液形成过程中的代谢可塑性，从静止状态过渡到分化状态。在这里，我们提出了一个优化的方法，用于测量线粒体呼吸和HSPCs的糖解。
Abstract
造血干细胞（HSPCs）具有明显的代谢可塑性，允许它们从静止状态过渡到分化状态，以维持血液形成的需求。然而，由于HSPC数量有限，并且缺乏针对非粘附性、易碎HSPCs的优化方案，因此很难分析HSPC的代谢状态（线粒体呼吸和糖解）。在这里，我们提供一套清晰、分步的指示，以测量代谢呼吸（耗氧率;OCR）和糖解（细胞外酸化率;ECAR） 的鼠骨髓-血统内格Sca1+c-Kit= （LSK） HSPCs。该协议从小鼠骨髓中提供更高量的LSK HSPCs，提高孵育期间HSPCs的生存能力，促进非粘附性HSPCs的细胞外通量分析，并为针对氧化磷酸化和糖解途径的药物提供优化的注射方案（浓度和时间）。该方法能够预测血液发育和疾病期间的代谢状态和HSPCs的健康。
Introduction
由于大多数成熟血细胞的寿命较短，血液的平衡依赖于长寿但罕见的造血干细胞（HSPCs）1的自我更新和分化。HSPC是静止的，但它们在刺激下迅速增殖和分化，以维持血液系统的需求。由于每个HSPC细胞状态都需要独特的生物能量需求，代谢变化是HSPC命运决定的关键驱动因素。因此，代谢可塑性的损失，通过改变HSPCs的静止、自我更新和分化之间的平衡，往往导致骨髓或淋巴增殖性疾病。总之，对HSPC发育的代谢调节的理解对于发现血液恶性肿瘤2、3、4、5的深层机制至关重要。
线粒体呼吸和糖解产生ATP，以推动细胞内反应，并产生大分子合成所需的构建基块。由于HSPCs与分化细胞6相比线粒体质量较低，并且它们在低氧骨髓利基中维持静止，因此HSPCs主要依靠糖解。HSPCs的激活增强了其线粒体代谢，导致静止的丧失和随后进入细胞周期。HSPC的这种代谢可塑性允许在整个成人寿命6，7，8，9，10，11，12期间维持HSPC池。因此，分析HSPC活化和健康状况，必须研究其代谢活动，如耗氧率（OCR;氧化磷酸化指数）和细胞外酸化率（ECAR;糖解指数）。OCR 和 ECAR 都可以使用细胞外通量分析仪进行实时测量。然而，目前的方法需要大量的细胞，并针对附着细胞13进行了优化。由于HSPC不能从小鼠14中大量分离，需要分拣才能获得纯种群，是非粘附细胞15，并且不能在一夜之间培养，而不避免分化16，因此很难测量HSPC的OCR和ECAR。在这里，我们提供一组清晰的分步说明，以伴随视频教程如何测量代谢呼吸和糖解的几千个小鼠骨髓-血统negSca1+c-Kit+ （LSK） HSPCs。
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Protocol
该协议得到了全国儿童医院动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注：协议按时间顺序描述，时间顺序跨越两天。使用如下协议中所述的新鲜试剂。
1. 在测定前一天制备试剂
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水化传感器盒。
- 在非CO2 37°C培养箱中孵育5mL的校准（材料表）。
- 打开助焊剂检测套件（材料表），将传感器盒（绿色;顶部）与公用板（透明;底部）分开。接下来，将传感器盒倒置并置于公用电源板旁边。
- 使用无菌水，填充公用板（200 μL）和井周围腔室（400 μL）的井。
- 将传感器盒浸入公用板中，确保传感器完全被水覆盖。点击 3 倍，避免形成气泡。
- 将墨盒浸入公用板中，在非 CO2 37 °C 培养箱中过夜。为了防止水蒸发，请确保孵化器经过适当的加湿。将装有 H2O 的开式烧杯放在墨盒实用程序板旁边，以防使用普通烤箱。
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准备测定板。
- 使用 70% 乙醇对生物安全柜 2 类表面进行消毒。打开发动机罩下方的测定板。
- 在发动机罩下每个孔中加入 40 μL 的商用 0.01% （w/v） 聚L-流结酶 （PLL） 溶液。
- 用套件中提供的盖子盖住测定板。在机罩下的室温 （RT） 下孵育闭合的测定板 1 小时。
注：孵育的目的是让PLL涂覆测定板的表面，以促进悬浮细胞粘附到测定板表面。 - 在测定板孵育 1 小时后，使用无菌真空吸气器去除多余的溶液，并在发动机罩下干燥井。
注：使用吸气器清除过多的 PLL 后，需要 ±30-60 分钟对测试板的孔进行空气干燥。
2. Asay 日
- 准备墨盒。
- 提起传感器盒。将其倒置在组织培养罩中，然后丢弃公用板中的水。
- 用预加热的校准200 μL填充公用板孔。
- 用 400 μL 的校准填充井周围的腔室。
- 将传感器盒浸入公用板中，确保传感器完全被校准覆盖。点击 3 倍，避免形成气泡。
- 将浸入在非 CO2 37 °C 培养箱中的电源盒中的传感器盒进行 45-60 分钟的平衡。
- 收获鼠骨髓衍生的LSK HSPCs。
- 为了适应足够的生物复制，计划使用从每孔测定板一只小鼠衍生的HSPCs。
注：这种骨髓采集方法从每只小鼠中提供 50，000~80，000 个 LSK HSPC。此测量细胞外通量的协议针对 96 孔板每孔 70，000 个 LSK HSPC 进行了优化。 - 按照当地IACUC批准的方法，使用CO2过量和宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
- 使用 70% 乙醇对解剖工具和工作台的表面进行消毒。
- 对于每只小鼠，在RT处用含有2%热灭活胎儿牛血清（FBS）的1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）预填充一个培养皿。
注：请勿使用预冷却的 PBS，因为它将在以下步骤中产生块状。 - 在整个安乐死小鼠上喷洒 70% 乙醇 （v/v）。从小鼠17、18分离出所有骨骼，包括上肢和下肢、髋骨、胸骨、肋骨和脊柱。从小鼠的脊髓中提取白质，因为它会污染LSK细胞。将所有骨骼放入 1x PBS （+ 2% FBS）中，因为它们正在被收集，放入培养皿中，直到进一步使用。
- 反转 50 mL 锥形管（每次新管），并用它来对浸在培养皿中的 1x PBS （+ 2% FBS） 中的骨骼进行三聚。
- 使用 10 mL 血清学移液器，在粉碎骨骼后，上下移液器（±10x）均匀地从骨骼中冲洗细胞。
- 将 40 μm 细胞滤网放在 50 mL 锥形管上。通过 1 x PBS 的 1 mL（+ 2% FBS）预湿滤网表面。
- 从步骤2.2.7收获骨髓衍生细胞悬浮液，并通过细胞滤网的预湿表面去除骨屑。
- 重复步骤2.2.6至2.2.9，直到所有骨骼材料变成白色作为标记，大多数骨髓细胞收集在50 mL锥形管。
注：每只小鼠通常需要两个50 mL锥形管来收集所有骨髓衍生的细胞。 - 在500 x g和RT下将含有骨髓衍生细胞的50 mL锥形管离心5分钟。
- 拆下上清液。将骨髓衍生细胞（将两个50 mL管的含量组合）以5mL的1xPBS（+2%FBS）作为最终体积，并将细胞保持在RT。
- 为了适应足够的生物复制，计划使用从每孔测定板一只小鼠衍生的HSPCs。
- 收获单核化鼠骨髓细胞。
- 将 5 mL 的密度梯度介质（即 Ficoll）添加到 15 mL 锥形管中。然后缓慢地加入5 mL的骨髓细胞悬浮液。确保单元格保持为密度梯度介质上方的图层。
- 在 500 x g和 RT 下离心 30 分钟。请勿在离心机中使用制动器。确保离心机的加速度最低（例如，1 加速和 0 减速）。
- 离心后，将单核细胞（白色）的中间界面收获到新鲜的15 mL锥形管中。
- 洗涤细胞，从密度梯度培养基收获，5 mL 1x PBS （+ 2% FBS）。在 500 x g和 4 °C 下离心 5 分钟。拆下上清液。
- 重复步骤 2.3.4。
- 在 300 μL 的 1x PBS （+ 2% FBS） 中重新悬浮管中的细胞内容物。在FACS管中无染色或单色控制的电池悬浮液的10μL。
- 从单核化小鼠骨髓细胞中收获LSK HSPCs。
- 通过混合以下抗体的样品3μL，制作生物锡抗体的混合物：Gr1、Cd8a、Cd5、B220、Ter119。将15μL的生物素抗体鸡尾酒加入300μL的单核化骨髓细胞。
注：每个抗体在1：100稀释时使用。 - 用生物素抗体鸡尾酒孵育细胞30分钟，在4°C下搅拌，避免细胞在管底聚集。
- 在与生物素抗体鸡尾酒混合的细胞中加入10 mL的预冷冻1x PBS（+2%FBS）。
- 在 500 x g和 4 °C 下将管离心 5 分钟。丢弃上清液，在 400 μL 的 1x PBS （+ 2% FBS） 中重新悬浮细胞颗粒。用于链球菌单色控制的阿利特 10 μL。
- 使用前简要涡旋抗生物素微珠（材料表）。在每个细胞样本中加入80μL的微珠（400μL）。混合良好，在4°C下再孵育20分钟，搅拌。
- 向细胞中加入10 mL的预冷冻1x PBS（+2%FBS）。在 500 x g和 4 °C 下将管离心 5 分钟。
- 丢弃上清液，在 1x PBS （+ 2% FBS） 的 1 mL 中重新悬浮细胞颗粒。设置磁分离装置时，在 4°C 下存放。
- 在4°C的磁辅助单元分拣（MACS）分离器的磁场中放置一列（材料表）。在 4°C 的重力流下，用 3 mL 的 1x PBS （± 2% FBS） 进行磁分离处理，为磁分离准备柱。
- 将步骤 2.4.7 中的电池悬浮液添加到 4°C 的预湿柱中。让细胞在4°C下通过柱，并在15 mL锥形管中收集流出物。
注：这种流出物中未标记细胞的分数表示富集的系骨负细胞。 - 在 4°C 下用 3 mL 的 1x PBS （+ 2% FBS） 清洗柱。重复 3 次。收集流过，并保持在4°C。使用血细胞计通过锥蓝色排除来计数洗脱的活细胞。
- 在 500 x g和 4 °C 下将包含流通的 15 mL 锥形管离心 5 分钟。丢弃上清液。将细胞悬浮在1xPBS（+2%FBS）的0.5 mL中，并将内容物转移到FACS管中。
- 将24μL的LSK抗体鸡尾酒加入每107个细胞。抗体鸡尾酒含有相当于450-链球菌素抗体、PE-CY7-Sca1抗体和APC-c-Kit抗体的浓度。
- 在4°C下孵育1小时，在黑暗中搅拌（用锡箔覆盖）。
- 将 3 mL 的 1x PBS （+ 2% FBS） 添加到 FACS 管中。在 500 x g和 4 °C 下离心 5 分钟。丢弃上清液。
- 在 1x PBS 的 1 mL 中重新悬浮抗体标记细胞（+ 2% FBS）。在分拣前将1 μL的1毫克/mL碘化钠添加到细胞悬浮液中。
- 在对 LSK 细胞进行排序之前，使用 40 μm 滤网过滤 FACS 管的内容。
- 通过FACS分类，将LSK细胞收集到含有0.5 mL的完整培养基的1.5 mL管中，辅以2 mM谷氨酰胺、3mg/mL葡萄糖、1mM丙酮酸、1x血栓丙酮（TPO）、1x干细胞因子（SCF）、0.5x青霉素/链霉素（P/S）、pH 7.4（表1）。
- 通过混合以下抗体的样品3μL，制作生物锡抗体的混合物：Gr1、Cd8a、Cd5、B220、Ter119。将15μL的生物素抗体鸡尾酒加入300μL的单核化骨髓细胞。
3. LSK HSPCs的线粒体呼吸和糖解测定
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在测定盘中进行LSK播种
- 从步骤2.4.17离心LSK细胞5分钟，在500 x g和RT.丢弃上清液。
- 将细胞重新悬浮在完整介质中，最终浓度至少为70，000个细胞/40μL。
- 从步骤 1.2.4 开始，PLL 涂层 8 孔板中 40 μL 介质（包含 70，000 个细胞）的种子含量。将所有角井留空。
- 在 450 x g和 RT 下离心 1 分钟。请勿踩下制动器。使用倒置显微镜确保细胞附着在井底。
- 在每个孔中的单元中加入135μL的完整介质，最终体积为175μL。将175μL的完整介质作为空白添加到板的2个角。
- 在37°C下在非CO2培养箱中孵育细胞2小时。
- 使用表 2（线粒体压力测试）和表 3（糖解压力测试）中描述的指标，设置一个程序，将药物添加到分析仪中井板的每个孔板中。
注：当细胞孵育时，打开仪器并确保其温度为37°C。
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线粒体应力测试
- 制备45μM库存溶液的寡霉素，50μM碳基氰化物4-（三氟辛）苯乙酰胺（FCCP）和25μM库存溶液的罗酮/抗霉素A。要制备45μM寡霉素库存溶液，将商用袋中的内容溶解在280μL的完整介质中。要制备 50 μM FCCP 库存溶液，请将商用袋中的内容溶解在 288 μL 的完整介质中。要制备 25 μM rotenone/抗霉素 A 库存溶液，请将市售袋中可售袋的内容溶解在 216 μL 的完整介质中。
- 根据表 4中描述的稀释指标（含氧率），根据需要将公用板中的传感器盒从培养箱中拿出来并加载其端口（A、B 和 C），以便每口井的最终浓度为 2 μM 寡聚霉素、1.5 μM FCCP 和 0.5 μM 的罗酮/抗霉素 A。
- 从组装在公用电源板上的传感器盒上取下盖子，并将其放在仪器托盘上。开始校准需要 20 分钟。
- 校准后，取出公用板，并将其替换为含有 LSK 电池的测定板，这些测试板现在粘附在井底。
- 按"继续"以启动表2中描述的程序。程序完成后，检索数据并使用波浪桌面软件进行分析。
注：从细胞外通量测定中生成的数据可以使用 Wave 桌面软件中的点图绘制，也可以导出到基于 Web 的统计程序。
-
糖解压力测试
- 在 300 μL （100 mM） 中重组葡萄糖，在 288 μL （50 μM） 中重组寡聚霉素，在 300 μL （500 mM） 的完整介质中从市售袋中重组二维葡萄糖 （2-DG）。
- 轻轻上下移液（±10x），使化合物溶解。涡旋 2-DG 约 1 分钟，以确保正确溶解到介质中。
- 从培养箱中取出传感器盒。按照表 5中描述的稀释指标加载端口 A 到 C，以获得 10 mM 葡萄糖的最终浓度、2 μM 寡霉素和 50 mM 2-DG 的浓度。
- 重复步骤 3.2.3 和 3.2.4。
- 按"继续"以启动表3中描述的程序。程序完成后，检索数据并使用波浪桌面软件进行分析。
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Representative Results
我们的提取方法允许我们每只小鼠收获高达 80，000 个 LSK HSPC。LSK细胞的存活性和数量通过我们的方法得到了提高，因为我们：（1）将上肢和下肢、髋骨、胸骨、肋骨、肋骨和脊柱的骨髓组合在一起，（2）避免使用红细胞裂化缓冲液，这将增加细胞死亡和结块，（3）使用单核细胞的密度梯度介质分离，避免使用预冷却缓冲液，这会导致团块中兴趣细胞的丧失。
虽然细胞外通量分析传统上用于粘附细胞，但我们使用井的PLL涂层，然后对井上的细胞进行离心，有助于LSK HSPCs粘附到井表面。这使我们能够测量LSK HSPCs的细胞外通量，从而测量其代谢健康。 考虑到从小鼠中采集的细胞数量有限，并且分离协议的持续时间很长，我们使用具有8井格式的分析仪已成为最具成本效益和可行性的解决方案（图1）。
细胞使用糖解和线粒体呼吸来补充其能量需求，并产生其增殖和生长所需的中间体19。六角糖酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸盐，随后转化为丙酮酸酯20。然后，丙酮酸盐可以加工成乳酸盐，然后从带有质子21的细胞中导出。ECAR 测量介质的酸化，因此是糖解的指标。丙酮酸盐也可以输送到线粒体中，并在乙酰辅酶A（CoA）中转化。乙酰CoA进入TCA周期，它提供能量中间体来驱动电子传输链（ETC）的电子运动，并在线粒体膜间空间22中产生质子梯度。氧气作为最终的电子接受者，质子通过ATP合成酶复合物移回线粒体基质，同时生成ATP23。OCR 测量耗氧量，因此用于量化线粒体呼吸。
为了在基础和压力条件下分析OCR和ECAR，我们使用干扰糖解和线粒体呼吸的药物的连续注射。我们使用葡萄糖和2-脱氧糖（2-DG），一种葡萄糖模拟，分别启动和阻止糖解24。我们使用罗泰酮（ETC的一种复杂的I特异性抑制剂）、抗霉素A（ETC的一种复杂的III特异性抑制剂）、寡霉素（ATP合成酶抑制剂）和脱钩剂碳基氰化物-4-（三氟化酶）苯甲酰胺（FCCP）来阻止ETC25的特定事件。我们给这种试剂打定头，以找到LKS HSPCs的最佳浓度（图2A，B）。
为了执行糖解压力测试，我们在葡萄糖/丙酮酸盐剥夺介质（根据制造商的建议）或含有葡萄糖/丙酮的介质中培养LSK HSPCs。正如预期的那样，我们发现在葡萄糖/丙酮®培养的LSK HSPCs基基水平高于葡萄糖/丙酮培养的LSK HSPCs。第一次葡萄糖注射并没有改变在葡萄糖/丙酸酯®介质中培养的LSK HSPCs的ECAR基础水平，同时它提高了在葡萄糖/丙酸酯介质中培养的LSK HSPCs中的糖解。然而，与葡萄糖/丙酮®组相比，在用葡萄糖注射后，ECAR的基础水平仍然较低。第二次注射寡霉素，可以通过氧化磷酸化阻止ATP的生产，在葡萄糖/丙酸酯®介质中激活了其最高水平的LSK HSPCs的糖解，但它不影响葡萄糖/丙酸酯组。最后一次注射葡萄糖模拟2-DG返回ECAR到其非糖解水平（图2C）。
对于线粒体压力测试，我们测量了葡萄糖/丙酮®介质中LSK HSPCs的OCR基础水平。我们首先注射了寡聚素，最初使线粒体膜超极化，防止更多的质子通过ETC复合物泵送，从而降低了线粒体呼吸的速度。第二次注射FCCP电泳将ETC和OCR水平推到最大，因为细胞试图恢复线粒体膜电位。最后注射其他两个ETC抑制剂（抗霉素A和罗酮）导致线粒体呼吸完全停止，因此OCR恢复到其最低水平（图2D）。
图1：图：图，图显示从小鼠骨髓中分离的上系negSca1+c-Kit+ （LSK）造血干细胞祖细胞。骨髓从骨骼中提取，单核细胞（MNIC）通过密度梯度中梯度分离分离。接下来，细胞用生物回位-抗体和链球毒结合的磁珠孵育到磁分离后脱毛的上系阴性（Lin-）细胞。林细胞随后用LSK抗体和LSK细胞通过细胞分拣分离进行孵育.请点击此处查看此图的较大版本。
图2：鼠系内系内格Sca1+c-Kit+ （LSK）造血干细胞细胞的细胞外通量分析。（A，B）糖解和线粒体呼吸期间用于细胞外通量分析的药物的力学描述。（C） 在介质中存在或不含葡萄糖/丙酮酸盐的情况下，对小鼠LSK HSPCs进行糖解压力测试的代表性结果。（D） 在鼠狼LSK HSPCs上进行线粒体应力测试的代表性结果。误差柱表示均值（S.D.）的标准偏差请点击此处查看此图的较大版本。
| 股票 | 最终浓度 | 30 mL 的容量 | |
| 完整的介质 | 28.691 mL | ||
| P/S | 100 倍 | 0.5 倍 | 150 μL |
| L-谷氨酰胺 | 200 mM | 2 mM | 300 μL |
| 丙酮 酸 | 100 mM | 1 mM | 300 μL |
| 葡萄糖 | 1 M/180.2 毫克/升 | 3毫克/升 | 499.4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 纳克/升 | 30 μL |
| Scf | 100 μg/mL | 100 纳克/升 | 30 μL |
表 1：完整 XF 介质的内容和准备。
| 基底 | 寡霉素 （2 μM） | FCCP （1.5 μM） | R/A （0.5 μM） | |
| 重复 | 3 次 | 3 次 | 3 次 | 3 次 |
| 混合 | 3分钟 | 3分钟 | 3分钟 | 3分钟 |
| 等 | 0 分钟 | 0 分钟 | 0 分钟 | 0 分钟 |
| 措施 | 4分钟 | 4分钟 | 4分钟 | 4分钟 |
表2：线粒体应力测试的注射方案。
| 基底 | 葡萄糖 （10 mM） | 寡霉素 （2 μM） | 2-DG （50 mM） | |
| 重复 | 3 次 | 3 次 | 3 次 | 3 次 |
| 混合 | 3分钟 | 3分钟 | 3分钟 | 3分钟 |
| 等 | 0 分钟 | 0 分钟 | 0 分钟 | 0 分钟 |
| 措施 | 7分钟 | 7分钟 | 7分钟 | 7分钟 |
表3：糖解压力测试的注射方案。
| 港口 | 药物 | 最终井浓度 （μM） | 库存溶液量 （μL） | 介质容量 （μL） | 端口解决方案 （μM） | 添加到端口的体积 （μL） |
| 端口 A | 奥利戈霉素 | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| 端口 B | FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| 端口 C | 罗泰酮/抗霉素A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
表4：稀释指标，以获得最佳药物浓度，用于分析仪各井的线粒体应力测试。
| 港口 | 药物 | 最终井浓度 | 库存溶液量 （μL） | 介质容量 （μL） | 端口解决方案 | 添加到端口的体积 （μL） |
| 端口 A | 葡萄糖 | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| 端口 B | 奥利戈霉素 | 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| 端口 C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
表5：稀释指标，以获得最佳药物浓度的糖解压力测试在分析仪的每一井。
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Discussion
在这里，我们演示了最大数量的纯和活的鼠LSK HSPCs种群的分离，以及使用细胞外通量分析仪测量其糖解和线粒体呼吸。具体来说，该协议克服了使用LSK HSPCs的下列技术问题：i） LSK HSPCs在小鼠骨髓14中的低频率，ii） LSK HSPCs26的低基础代谢活性，iii） LSK HSPCs27的脆弱;iv） LSK HSPCs 不粘附于培养容器15。此外，我们还优化了药物浓度和介质成分，以实现细胞外通量测定的最佳性能。
骨髓衍生的HSPCs存在于低氧利基，他们表现出一个糖解表型，这是维持其茎28的关键。相反，呼吸对于HSPC分化6至关重要。由于HSPCs的代谢功能障碍导致血液疾病;在这里，我们描述了协议和基于视频的教程，以测量代谢功能的标志，如OCR和ECAR，为鼠骨髓衍生的LSK HSPCs。
与制造商对粘附细胞的建议相反，我们发现，与葡萄糖/丙酮-介质相比，在葡萄糖/丙酮®培养的细胞中，LSK HSPCs上的糖解压力测试结果是最佳的。我们意识到，LSK HSPCs的介质中缺乏葡萄糖会导致在非CO2培养箱的+2 h平衡期间细胞死亡。由于葡萄糖注射并没有改变在葡萄糖/丙二酮培养的LSK HSPCs的ECAR基基水平， 我们对该协议的修改不仅保留了糖解压力测试的本质，还使我们能够区分LSK HSPCs的基础糖解（注射前）、糖解能力（寡霉素注射后）和非糖解酸化（注射后用2-DG）。
我们对LSK HSPCs的线粒体应力测试表明，在LSK HSPCs中氧化磷酸化产生的ATP是最小的，在寡霉素注射后OCR的小幅减少。相反，在 FCCP 注入时 OCR 中的提升确认 LSK HSPC 能够响应更高的能源需求。
总之，该协议的目标是提供一套清晰、简洁的说明，以伴随有关如何测量HSPC的代谢功能（如OCR和ECAR）的视频教程。通过关键修改和额外的建议，收获更多健康的LSK HSPC，使它们粘附在井的表面，以及优化孵育时间和药物浓度，该协议将增强研究者分析HSPCs的糖解和线粒体呼吸状态，以及血液发育和疾病期间的非粘附造血细胞。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了国家卫生研究院（HL131645、CA016058）、圣巴尔德里克基金会和佩洛多尼亚基金会的资助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
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