Summary
Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.
Abstract
Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) haben eine ausgeprägte metabolische Plastizität, die es ihnen ermöglicht, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen der Blutbildung aufrechtzuerhalten. Allerdings war es schwierig, den metabolischen Zustand (mitochondriale Atmung und Glykolyse) von HSPCs aufgrund ihrer begrenzten Anzahl und des Fehlens optimierter Protokolle für nicht-haftige, zerbrechliche HSPCs zu analysieren. Hier stellen wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Messung der metabolischen Atmung (Sauerstoffverbrauchsrate; OCR) und Glykolyse (extrazelluläre Versauerungsrate; ECAR) von murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Dieses Protokoll bietet eine höhere Menge an LSK-HSPCs aus murinen Knochenmark, verbessert die Lebensfähigkeit von HSPCs während der Inkubation, erleichtert extrazelluläre Flussanalysen von nicht-haftenden HSPCs und bietet optimierte Injektionsprotokolle (Konzentration und Zeit) für Medikamente, die auf oxidative Phosphorylierung und glykolytische Pfade abzielen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage des Stoffwechselzustands und der Gesundheit von HSPCs während der Blutentwicklung und Krankheiten.
Introduction
Da die Lebensdauer der meisten reifen Blutkörperchen kurz ist, beruht die Homöostase des Blutes auf der Selbsterneuerung und Differenzierung einer langlebigen, aber seltenen Population hämatopoetischer Stammzellen (HSPCs)1. HSPCs sind still, aber sie sind schnell zu vermehren und unterziehen Differenzierung auf Stimulation, um die Anforderungen des Blutsystems zu erhalten. Da jeder HSPC-Zellzustand eine einzigartige bioenergetische Nachfrage erfordert, sind die metabolischen Veränderungen die wichtigsten Treiber von HSPC-Schicksalsentscheidungen. Daher führt der Verlust der metabolischen Plastizität, indem das Gleichgewicht zwischen Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs verändert wird, oft zu myelo- oder lympho-proliferativen Störungen. Zusammen ist das Verständnis der metabolischen Regulation der HSPC-Entwicklung entscheidend, um Mechanismen aufzudecken, die hämatologischen Malignitäten2,3,4,5zugrunde liegen.
Mitochondriale Atmung und Glykolyse erzeugen ATP, um intrazelluläre Reaktionen anzutreiben und die für die Makromolekülsynthese notwendigen Bausteine zu produzieren. Da HSPCs im Vergleich zu differenzierten Zellen6 eine niedrige mitochondriale Masse haben und in hypoxischen Knochenmarknischen Ruhe halten, setzen HSPCs in erster Linie auf Glykolyse. Die Aktivierung von HSPCs verbessert ihren mitochondrialen Stoffwechsel, der zum Verlust der Ruhe und ihrem anschließenden Eintritt in den Zellzyklus führt. Eine solche metabolische Plastizität von HSPCs ermöglicht die Aufrechterhaltung des HSPC-Pools während des gesamten Erwachsenenlebens6,7,8,9,10,11,12. Daher ist es wichtig, ihre metabolischen Aktivitäten zu untersuchen, wie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; Index der oxidativen Phosphorylierung) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR; Index der Glykolyse), um die HSPC-Aktivierung und den Gesundheitszustand zu analysieren. Sowohl die OCR als auch die ECAR können gleichzeitig in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen werden. Die aktuelle Methode erfordert jedoch eine große Anzahl von Zellen und ist für anhimierende Zellen13optimiert. Da HSPCs nicht in großen Mengen von Mäusen isoliert werden können14, eine Sortierung erfordern, um eine reine Population zu erhalten, sind nicht-anhantibe Zellen15, und kann nicht über Nacht kultiviert werden, ohne Differenzierung zu vermeiden16, war es schwierig, die OCR und die ECAR von HSPCs zu messen. Hier bieten wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen, um videobasierte Tutorials zu begleiten, wie man metabolische Atmung und Glykolyse von einigen tausend murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs misst.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Nationwide Children es Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
HINWEIS: Das Protokoll wird in chronologischer Reihenfolge beschrieben, die sich über einen Zeitraum von zwei Tagen erstreckt. Verwenden Sie frische Reagenzien, wie im folgenden Protokoll beschrieben.
1. Herstellung von Reagenzien am Tag vor dem Assay
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Hydratisieren Sie die Sensorpatrone.
- Inkubieren Sie 5 ml des Kalibranten (Materialtabelle) in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator über Nacht.
- Öffnen Sie das Fluss-Assay-Kit (Materialtabelle) und trennen Sie die Sensorpatrone (grün; oben) von der Nutzplatte (transparent; unten). Stellen Sie als Nächstes die Sensorpatrone auf den Kopf und neben der Versorgungsplatte.
- Füllen Sie mit sterilem Wasser die Brunnen der Versorgungsplatte (200 l) und die Kammern um die Brunnen (400 l).
- Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Netzteilplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig mit Wasser bedeckt sind. Tippen Sie auf 3x, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Legen Sie die Patrone über Nacht in einen Nicht-CO2 37 °C-Inkubator ein. Um eine Verdunstung des Wassers zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Inkubator ordnungsgemäß befeuchtet ist. Legen Sie einen offenen Becher mit H2O als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme neben die Patronen-Utility-Platte, insbesondere bei Verwendung eines normalen Ofens.
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Bereiten Sie die Assay-Platte vor.
- Sterilisieren Sie die Oberfläche des Biosicherheitsschranks Klasse 2 mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Assayplatte unter der Haube.
- Fügen Sie 40 l der handelsüblichen 0,01% (w/v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung zu jedem Brunnen der Assayplatte unter der Haube hinzu.
- Bedecken Sie die Assayplatte mit dem im Kit enthaltenen Deckel. Inkubieren Sie die geschlossene Assayplatte bei Raumtemperatur (RT) unter der Haube für 1 h.
HINWEIS: Das Ziel der Inkubation ist es, PLL die Oberfläche der Assayplatte beschichten zu lassen, um die Haftung von Suspensionszellen an der Oberfläche der Assayplatte zu erleichtern. - Nach 1 h Inkubation der Assayplatte die überschüssige Lösung mit einem sterilen Vakuum-Sauger entfernen und den Brunnen unter der Haube an der Luft trocknen.
HINWEIS: Es dauert 30 bis 60 min, um die Brunnen der Assayplatte nach der übermäßigen PLL-Entfernung mit dem Aspirator lufttrocken zu trocknen.
2. Tag des Assays
- Bereiten Sie die Patrone vor.
- Heben Sie die Sensorpatrone an. Legen Sie es auf den Kopf in die Gewebekulturhaube und entsorgen Sie das Wasser von der Nutzplatte.
- Füllen Sie die Nutzplattenbrunnen mit 200 l des vorgewärmten Kalibrants.
- Füllen Sie die Kammern um die Brunnen mit 400 l des Kalibranten.
- Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Nutzplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig vom Kalibrant abgedeckt sind. Tippen Sie auf 3x, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Equilibrate die Sensorpatrone in der Versorgungsplatte in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator für 45-60 min.
- Ernte murinen Knochenmark abgeleiteten LSK HSPCs.
- Um ausreichende biologische Replikationen aufzunehmen, planen Sie die Verwendung von HSPCs, die von einer Maus pro Bohrung der Assayplatte abgeleitet wurden.
HINWEIS: Diese Knochenmark-Erntemethode bietet von jeder Maus 50.000 bis 80.000 LSK-HSPCs. Dieses Protokoll zur Messung des extrazellulären Flusses ist für 70.000 LSK HSPCs pro Bohrung einer 96-Well-Platte optimiert. - Euthanisieren Sie Mäuse mitCO2-Überdosierung und Zervixdislokation nach lokalen IACUC-zugelassenen Methoden.
- Sterilisieren Sie die Oberfläche von Sezieren von Werkzeugen und die Bank mit 70% Ethanol.
- Für jede Maus eine Petrischale mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) vorfüllen, die 2% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) bei RT enthält.
HINWEIS: Verwenden Sie keine vorgekühlten PBS, da in den folgenden Schritten Klumpen entstehen. - Sprühen Sie 70% Ethanol (v/v) auf die gesamte eingeschläferte Maus. Isolieren Sie alle Knochen, einschließlich der oberen und unteren Gliedmaßen, Hüftknochen, Brustbein, Rippenkäfig und Wirbelsäule, von der Maus17,18. Ziehen Sie weiße Materie aus dem Rückenmark der Maus, da sie LSK-Zellen kontaminieren kann. Legen Sie alle Knochen in 1x PBS (+ 2% FBS), wie sie gesammelt werden, in eine Petrischale bis zur weiteren Verwendung.
- Invertieren Sie ein 50 ml kegelförmiges Rohr (jedes Mal neu) und verwenden Sie es, um Knochen, die in 1x PBS (+ 2% FBS) in der Petrischale getaucht sind, zu trituieren.
- Mit einer 10 ml serologischen Pipette, Pipette nach oben und unten (ca. 10x) gleichmäßig ausspülen Zellen aus Knochen, nach dem Zerkleinern der Knochen.
- Legen Sie ein 40 m Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr. Vorbefeuchten der Oberfläche des Siebs durch Durchgang 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS).
- Ernteknochenmark-abgeleitete Zellsuspension aus Schritt 2.2.7 und passieren Sie es durch die vornasse Oberfläche des Zellsiebs, um Knochenablagerungen zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6 bis 2.2.9, bis alle Knochenmaterialien weiß werden, als Marker dafür, dass die meisten Knochenmarkzellen in der 50 ml konischen Röhre gesammelt werden.
HINWEIS: Es dauert oft zwei 50 ml konische Röhren pro Maus, um alle Knochenmark-abgeleiteten Zellen zu sammeln. - Zentrifuge 50 ml konische Röhren mit Knochenmark-abgeleiteten Zellen für 5 min bei 500 x g und RT.
- Entfernen Sie den Überstand. Aussetzen von Knochenmark-abgeleiteten Zellen (Kombinationsgehalte beider 50 ml-Röhren) in 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) als Endvolumen und Halten sie die Zellen bei RT.
- Um ausreichende biologische Replikationen aufzunehmen, planen Sie die Verwendung von HSPCs, die von einer Maus pro Bohrung der Assayplatte abgeleitet wurden.
- Ernte mononukleierte murinierte Knochenmarkzellen.
- Fügen Sie 5 ml Dichtegradientenmedium (d. h. Ficoll) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu. Dann langsam 5 ml der Knochenmarkzellsuspension hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass Zellen als Schicht über dem Dichtegradientenmedium verbleiben.
- Zentrifuge für 30 min bei 500 x g und RT. Verwenden Sie keine Bremse in der Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge bei der geringstmöglichen Beschleunigung ist (z. B. 1 Beschleunigung und 0 Verzögerung).
- Ernten Sie die mittlere Schnittstelle von mononukleierten Zellen (weiße Farbe) nach Zentrifugation in ein frisches 15 ml konisches Rohr.
- Waschzellen, geerntet aus Dichtegradientenmedium, mit 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Zentrifuge für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 2.3.4.
- Den Zellinhalt des Rohres in 300 l 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aufsetzen. Aliquot 10 l Zellsuspension zur ungefärbten oder einfarbigen Kontrolle in einem FACS-Rohr.
- Ernte LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen.
- Machen Sie einen Cocktail aus Biotin-Antikörpern, indem Sie 3 l pro Probe der folgenden Antikörper mischen: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Fügen Sie 15 L des Biotin-Antikörper-Cocktails zu 300 l mononukleierten Knochenmarkzellen hinzu.
HINWEIS: Jeder Antikörper wird bei 1:100 Verdünnung verwendet. - Inkubieren Sie Zellen mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail für 30 min bei 4 °C mit Agitation, um zu vermeiden, dass Zellen im Boden des Rohres verklumpen.
- Fügen Sie 10 ml vorgekühlten 1x PBS (+ 2% FBS) zu Zellen hinzu, die mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail gemischt werden.
- Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 400 l 1x PBS (+ 2% FBS) wieder auf. Aliquot 10 l für streptavidin-single Farbregelung.
- Kurz Wirbel Anti-Biotin Mikroperlen (Tabelle der Materialien) vor der Verwendung. Fügen Sie jeder Zellprobe 80 L Mikroperlen hinzu (von 400 l). Gut mischen und für weitere 20 min bei 4 °C mit Rührung inkubieren.
- Fügen Sie 10 ml vorgekühlten 1x PBS (+ 2% FBS) zu den Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 500 x g und 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder auf. Bei 4 °C lagern, während Sie eine magnetische Trenneinheit einrichten.
- Platzieren Sie eine Säule (Materialtabelle) im Magnetfeld des magnetischen zellsortierbaren Trennzeichens (MACS) bei 4 °C. Bereiten Sie die Säule für die magnetische Trennung vor, indem Sie sie mit 3 ml 1x 1x PBS (+ 2% FBS) unter dem Schwerkraftstrom bei 4 °C spülen.
- Fügen Sie die Zellsuspension ab Schritt 2.4.7 bei 4 °C in die vornasse Säule ein. Lassen Sie die Zellen die Säule bei 4 °C passieren und sammeln Sie Abwässer in einem 15 ml konischen Rohr.
HINWEIS: Der Anteil mit nicht beschrifteten Zellen in solchen Abwässern stellt die angereicherten Liniennegativen Zellen dar. - Waschsäule mit 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) bei 4 °C. Wiederholen Sie 3x. Sammeln Sie den Durchfluss und halten Sie ihn bei 4 °C. Zählen Sie die eluierten lebensfähigen Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss mit einem Hämozytometer.
- Zentrifugieren Sie das 15 ml konische Rohr, das den Durchfluss für 5 min bei 500 x g und 4 °C enthält. Entsorgen Sie den Überstand. Zellen in 0,5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aussetzen und den Inhalt in ein FACS-Rohr übertragen.
- Fügen Sie je 107 Zellen 24 L des LSK-Antikörpercocktails hinzu. Der Antikörper-Cocktail enthält eine gleiche Konzentration von 450-Streptavidin-Antikörpern, PE-CY7-Sca1-Antikörpern und APC-c-Kit-Antikörpern.
- 1 h bei 4 °C mit Erregung unter Dunkel (mit Zinnfolie überzogen) inkubieren.
- Fügen Sie 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) in das FACS-Rohr. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
- A-Antikörper-markierte Zellen in 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aufsetzen. Fügen Sie kurz vor der Sortierung 1 l von 1 mg/ml Propidiumjodid in die Zellsuspension ein.
- Filtern Sie den Inhalt des FACS-Rohrs mit einem 40-mm-Sieb direkt vor dem Sortieren von LSK-Zellen.
- Sammeln Sie LSK-Zellen über FACS-Sortierung in 1,5 ml-Rohr mit 0,5 ml komplettem Medium, ergänzt durch 2 mM Glutamin, 3 mg/ml Glukose, 1 mM Pyruvat, 1x Thrombopoietin (TPO), 1x Stammzellfaktor (SCF), 0,5x Penicillin/Streptomycin (P/S), pH 7,4 (Tabelle 1).
- Machen Sie einen Cocktail aus Biotin-Antikörpern, indem Sie 3 l pro Probe der folgenden Antikörper mischen: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Fügen Sie 15 L des Biotin-Antikörper-Cocktails zu 300 l mononukleierten Knochenmarkzellen hinzu.
3. Mitochondriale Atmung und Glykolyse Assays von LSK HSPCs
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LSK-Saat in der Assayplatte
- Zentrifuge LSK-Zellen ab Schritt 2.4.17 für 5 min bei 500 x g und RT. Entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspend Zellen in vollständigen Medien auf eine Endkonzentration von mindestens 70.000 Zellen/40 l.
- Saatgutgehalt von 40 L-Medien (mit 70.000 Zellen) in der PLL-beschichteten 8-Well-Platte ab Schritt 1.2.4. Lassen Sie alle Eckbrunnen leer.
- Zentrifuge für 1 min bei 450 x g und RT. Tragen Sie die Bremse nicht an. Stellen Sie sicher, dass Zellen mit dem invertierten Mikroskop am Brunnenboden befestigt sind.
- Fügen Sie den Zellen in jedem Brunnen 135 L komplette Medien für ein Endvolumen von 175 l hinzu. Fügen Sie den 2 Ecken der Platte als Rohlinge 175 L kompletter Medien hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen im Nicht-CO2-Inkubator für 2 h bei 37 °C.
- Richten Sie ein Programm ein, um jedem Brunnen der Brunnenplatte im Analysator Medikamente hinzuzufügen, wobei eine Metrik verwendet wird, die in Tabelle 2 (mitochondrialer Stresstest) und Tabelle 3 (Glykolyse-Stresstest) beschrieben ist.
HINWEIS: Während Zellen inkubieren, schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie sicher, dass es bei 37 °C ist.
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Mitochondrialer Stresstest
- Bereiten Sie 45 M Bestandslösungen von Oligomycin, 50 M Carbonylcyanid 4-(Trifluromethoxy)phenylhydraon (FCCP) und 25 M Bestandslösungen von Roton/Antimycin A vor. Um die 45-M-Oligomycin-Stammlösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 280 l des gesamten Mediums auf. Um die 50-M-FCCP-Lagerlösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 288 l des gesamten Mediums auf. Um 25 'M Roton/Antimycin A Stofflösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 216 l des gesamten Mediums auf.
- Nehmen Sie die Sensorpatrone in der Versorgungsplatte aus dem Inkubator und laden Sie ihre Anschlüsse (A, B und C) so, dass jeder Brunnen eine Endkonzentration von 2 M Oligomycin, 1,5 M FCCP und 0,5 M Roton/Antimycin A nach Bedarf gemäß den in Tabelle 4 beschriebenen Verdünnungsmetriken (für die Sauerstoffverbrauchsrate) haben würde.
- Entfernen Sie den Deckel von der sensorischen Patrone, die in der Gebrauchsplatte montiert ist, und legen Sie ihn auf das Instrumentenfach. Starten Sie die Kalibrierung, die 20 min dauert.
- Entfernen Sie nach der Kalibrierung die Versorgungsplatte und ersetzen Sie sie durch eine Assayplatte, die LSK-Zellen enthält, die nun an der Unterseite des Brunnens haften.
- Drücken Sie Weiter, um das in Tabelle 2beschriebene Programm zu starten. Rufen Sie nach Abschluss des Programms die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Wave Desktop-Software.
HINWEIS: Die aus den extrazellulären Flussversuchen generierten Daten können mit dem Punktdiagramm aus der Wave Desktop-Software geplottet oder in ein webbasiertes Statistikprogramm exportiert werden.
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Glycolyse-Stresstest
- Rekonstituieren Sie Glukose in 300 l (100 mM), Oligomycin in 288 l (50 m), 2-D-Glukose (2-DG) in 300 l (500 mM) Komplettmedium aus dem handelsüblichen Beutel.
- Sanfte Pipette nach oben und unten (ca. 10x), um die Verbindungen zu löslich. Vortex die 2-DG für ca. 1 min, um eine ordnungsgemäße Auflösung in Medien zu gewährleisten.
- Entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator. Lastanschlüsse A bis C nach in Tabelle 5 beschriebenen Verdünnungsmetriken, um eine Endkonzentration von 10 mM Glukose, 2 M Oligomycin und 50 mM 2-DG zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3 und 3.2.4.
- Drücken Sie Weiter, um das in Tabelle 3beschriebene Programm zu starten. Rufen Sie nach Abschluss des Programms die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Wave Desktop-Software.
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Representative Results
Unsere Extraktionsmethode ermöglichte es uns, bis zu 80.000 LSK HSPCs pro Maus zu ernten. Die Lebensfähigkeit und Anzahl der LSK-Zellen wurde mit unserer Methode verbessert, weil wir: (1) Knochenmark aus oberen und unteren Gliedmaßen, Hüftknochen, Brustbein, Rippenkäfig und Wirbelsäule kombinierten, (2) die Verwendung eines roten Zelllysepuffers vermieden, der den Zelltod und die Verklumpung erhöht hätte, (3) nutzte die Dichtegradienten-Mitteltrennung von mononukleierten Zellen und (4) die Verwendung von vorgekühlten Puffern, die den Verlust von Zellen des Interesses an Klumpen verursacht hätten.
Obwohl die extrazelluläre Flussanalyse traditionell für anhaftende Zellen verwendet wird, erleichterte unsere Verwendung der PLL-Beschichtung von Brunnen, gefolgt von der Zentrifugation von Zellen darauf, die Haftung von LSK HSPCs an der Oberfläche des Brunnens. Dies ermöglichte es uns, den extrazellulären Fluss und damit die metabolische Gesundheit von LSK HSPCs zu messen. Angesichts der begrenzten Anzahl von Zellen, die von einer Maus geerntet werden können, und der langen Dauer des Protokolls für ihre Isolierung hat sich unsere Verwendung des Analysators mit seinem 8-Well-Format als die kostengünstigste und praktikabelste Lösung herausgestellt (Abbildung 1).
Zellen verwenden Glykolyse und mitochondriale Atmung, um ihren Energiebedarf aufzufüllen und Zwischenprodukte zu produzieren, die für ihre Proliferation und ihr Wachstum benötigt werden19. Das Hexokinase-Enzym wandelt Glukose in Glucose-6-Phosphat um und wird anschließend in Pyruvat20umgewandelt. Pyruvat kann dann zu Laktat verarbeitet werden und wird aus der Zelle mit Protonen21exportiert. ECAR misst die Versauerung der Medien und ist damit ein Indikator für die Glykolyse. Pyruvat kann auch in die Mitochondrien transportiert und in Acetylcoenzym A (CoA) umgewandelt werden. Acetyl CoA tritt in den TCA-Zyklus ein, der Energiezwischenprodukte bereitstellt, um die Elektronenbewegungen der Elektronentransportkette (ETC) anzutreiben und einen Protonengradienten im mitochondrialen Intermembranraum22erzeugt. Sauerstoff fungiert als letzter Elektronenakzeptor, und Protonen bewegen sich durch den ATP-Synthase-Komplex zurück in die mitochondriale Matrix, während sie ATP23erzeugen. OCR misst den Sauerstoffverbrauch und wird daher zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung verwendet.
Um die OCR und die ECAR unter basalen und gestressten Bedingungen zu analysieren, verwendeten wir eine sequenzielle Injektion von Medikamenten, die die Glykolyse und die mitochondriale Atmung stören. Wir verwendeten Glukose und 2-Deoxyglucose (2-DG), ein Glukose-Analog, um Die Glykolyse bzw.24zu initiieren und zu blockieren. Wir verwendeten Rotenon (einen komplexen I-spezifischen Inhibitor des ETC), Antimycin A (ein komplexer III-spezifischer Inhibitor des ETC), Oligomycin (Inhibitor der ATP-Synthase) und das Entkopplungsmittel Carbonylcyanid-4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) um spezifische Ereignisse des ETC25zu blockieren. Wir haben solche Reagenzien titriert, um die optimale Konzentration für LKS HSPCs zu finden (Abbildung 2A,B).
Um den Glykolyse-Stresstest durchzuführen, haben wir die LSK HSPCs in einem Glukose-/Pyruvat-entzogenen Medium (wie vom Hersteller empfohlen) oder in Glucose/Pyruvat-haltigen Medien kultiviert. Wie erwartet, stellten wir fest, dass der Basalgehalt des ECAR bei LSK HSPCs, die in Glucose/Pyruvat+-Medien kultiviert sind, höher war als bei LSK-HSPCs, die in Glucose/Pyruvat-Medien kultiviert wurden. Die erste Injektion mit Glukose änderte nicht den Basalgehalt von ECAR für LSK HSPCs, die in Glucose/Pyruvat+-Medien kultiviert wurden, während sie die Glykolyse in LSK-HSPCs, die in Glucose/Pyruvat-Medien kultiviert wurden, förderte. Der Basalgehalt des ECAR blieb jedoch nach der Injektion mit Glukose niedriger als die Glucose/Pyruvat+-Gruppe. Die zweite Injektion mit Oligomycin, die die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung blockieren konnte, aktivierte die Glykolyse auf ihrem maximalen Gehalt an LSK HSPCs in Glucose/Pyruvat+-Medien, hatte aber keinen Einfluss auf die Glucose/Pyruvat-Gruppe. Die letzte Injektion mit dem Glukoseanalog 2-DG brachte das ECAR auf seinen nicht-glykolytischen Wert zurück (Abbildung 2C).
Für den mitochondrialen Stresstest haben wir den Basalgehalt der OCR von LSK HSPCs in Glucose/Pyruvat+ Medien gemessen. Wir injizierten zuerst Oligomycin, das zunächst die mitochondriale Membran hyperpolarisierte, verhinderte mehr Protonenpumpen durch die ETC-Komplexe und reduzierte so die Rate der mitochondrialen Atmung. Die zweite Injektion von FCCP-Ionophoren drückte die ETC- und OCR-Spiegel auf ihr Maximum, da Zellen versuchten, das mitochondriale Membranpotenzial zurückzugewinnen. Die endgültige Injektion mit zwei weiteren ETC-Inhibitoren (Antimycin A und Roton) verursachte den vollständigen Stopp der mitochondrialen Atmung und damit kehrte die OCR auf ihr Mindestniveau zurück (Abbildung 2D).
Abbildung 1: Schema, das die Isolierung von LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) hämatopoetischen Stammvorläuferzellen aus Mausknochenmark demonstriert. Knochenmark wird aus Knochen extrahiert und mononukleäre Zellen (MNCs) werden durch Dichtegradienten-Mittelgradiententrennung isoliert. Als nächstes werden Zellen mit biotinylatierter Abstammung+ Antikörpern und streptavidin-konjugierten Magnetperlen inkubiert, um Liniennegative (Lin - ) Nach ihrer magnetischen Trennung zu elute Lineage-Negativzellen (Lin-) zu machen. Lin- Zellen werden anschließend mit LSK-Antikörpern und LSK-Zellen durch Zellsortierung isoliert inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Extrazelluläre Flussanalysen von murinen AbstammungnegSca1+c-Kit+ (LSK) hämatopoetischen Stammvorläuferzellen. (A,B) Mechanistische Beschreibung von Medikamenten, die für extrazelluläre Flussanalysen während der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung verwendet werden. (C) Repräsentative Ergebnisse des Glykolyse-Stresstests an murinen LSK-HSPCs in Gegenwart oder Fehlen von Glucose/Pyruvat in den Medien. (D) Repräsentative Ergebnisse des mitochondrialen Stresstests an murinen LSK HSPCs. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts (S.D.) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lager | Endgültige Konzentration | Volumen für 30 ml | |
| Komplette Medien | 28.691 ml | ||
| P/S | 100x | 0,5x | 150 l |
| L-Glutamin | 200 mM | 2 mM | 300 l |
| Pyruvat | 100 mM | 1 mM | 300 l |
| Glukose | 1 M/180,2 mg/ml | 3 mg/ml | 499,4 l |
| Tpo | 100 g/ml | 100 ng/mL | 30 l |
| Scf | 100 g/ml | 100 ng/mL | 30 l |
Tabelle 1: Inhalt und Vorbereitung des gesamten XF-Mediums.
| Basale | Oligomycin (2 m) | FCCP (1,5 m) | R/A (0,5 m) | |
| Wiederholung | 3 mal | 3 mal | 3 mal | 3 mal |
| Mix | 3 Min. | 3 Min. | 3 Min. | 3 Min. |
| Warte | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Messen | 4 Min. | 4 Min. | 4 Min. | 4 Min. |
Tabelle 2: Injektionsprotokoll für den mitochondrialen Stresstest.
| Basale | Glukose (10 mM) | Oligomycin (2 m) | 2-DG (50 mM) | |
| Wiederholung | 3 mal | 3 mal | 3 mal | 3 mal |
| Mix | 3 Min. | 3 Min. | 3 Min. | 3 Min. |
| Warte | 0 min | 0 min | 0 min | 0 min |
| Messen | 7 Min. | 7 Min. | 7 Min. | 7 Min. |
Tabelle 3: Injektionsprotokoll für den Glykolyse-Stresstest.
| Hafen | Droge | Endbrunnenkonzentration (M) | Lagerlösungsvolumen (L) | Medienvolumen (L) | Anschlusslösung (M) | Volume, das dem Port hinzugefügt wird (L) |
| Port A | Oligomycin | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| Port B | FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| Port C | Rotenon/Antimycin A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tabelle 4: Verdünnungsmetriken zur Erzielung einer optimalen Wirkstoffkonzentration für den mitochondrialen Stresstest in jedem Brunnen des Analysators.
| Hafen | Droge | Letzte Brunnenkonzentration | Lagerlösungsvolumen (L) | Medienvolumen (L) | Hafenlösung | Volume, das dem Port hinzugefügt wird (L) |
| Port A | Glukose | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| Port B | Oligomycin | 2 M | 108 | 192 | 18 m | 25 |
| Port C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tabelle 5: Verdünnungsmetriken zur Erzielung einer optimalen Wirkstoffkonzentration für den Glykolyse-Stresstest in jedem Bohrwert des Analysators.
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Discussion
Hier zeigen wir die Isolierung einer maximalen Menge an reiner und lebensfähiger muriner LSK HSPCs Population sowie die Messung ihrer Glykolyse und mitochondrialen Atmung mit einem extrazellulären Flussanalysator. Insbesondere überwindet das Protokoll die folgenden technischen Probleme für die Verwendung von LSK HSPCs: i) die niedrige Frequenz von LSK HSPCs im murinen Knochenmark14, ii) niedrige basale metabolische Aktivität von LSK HSPCs26, iii) die Fragilität von LSK HSPCs27und iv) die Nicht-Haftung von LSK HSPCs an Kulturgefäßen15. Darüber hinaus haben wir die Wirkstoffkonzentrationen und die Medienzusammensetzung für die optimale Leistung der extrazellulären Flusstests optimiert.
Knochenmark-abgeleitete HSPCs befinden sich in der hypoxischen Nische und zeigen einen glykolytischen Phänotyp, der für die Aufrechterhaltung ihres Stammes entscheidend ist28. Umgekehrt ist die Atmung für die HSPC-Differenzierung6unerlässlich. Da metabolische Dysfunktion von HSPCs führt zu Blutkrankheiten; hier haben wir die protokollarischen und videobasierten Tutorials beschrieben, um die Merkmale von Stoffwechselfunktionen, wie der OCR und der ECAR, für murine Knochenmark-abgeleitete LSK-HSPCs zu messen.
Im Gegensatz zu den Empfehlungen der Hersteller für anhantibe Zellen haben wir festgestellt, dass die Glykolyse-Stresstestergebnisse an LSK HSPCs optimal sind, wenn Zellen in Glucose/Pyruvat+-Medien im Vergleich zu Glucose/Pyruvat-Medien kultiviert werden. Wir erkannten, dass der Mangel an Glukose in den Medien für LSK HSPCs zu einem Zelltod während der 2 h Gleichgewichtszeit in einem Nicht-CO2-Inkubator führt. Da die Glukoseinjektion den Basalgehalt von ECAR für LSK-HSPCs, die in Glucose/Pyruvat+-Medien kultiviert wurden, nicht verändert hat, Unsere Änderung des Protokolls bewahrt nicht nur die Essenz des glykolytischen Stresstests, sondern ermöglicht es uns auch, zwischen der basalen Glykolyse (vor Injektionen), der glykolytischen Kapazität (nach Oligomycin-Injektion) und der nicht-glykolytischen Versauerung (nach Injektion mit 2-DG) von LSK HSPCs zu unterscheiden.
Unser mitochondrialer Stresstest von LSK HSPCs zeigte, dass der durch oxidative Phosphorylierung in LSK HSPCs erzeugte ATP minimal ist, wie die geringe Reduktion der OCR nach der Oligomycin-Injektion zeigt. Umgekehrt bestätigt die Erhöhung des OCR nach der FCCP-Injektion, dass LSK HSPCs in der Lage sind, auf einen höheren Energiebedarf zu reagieren.
Das Ziel dieses Protokolls war es, eine Reihe klarer, prägnanter Anleitungen zur Messung videobasierter Tutorials zur Messung der metabolischen Funktionen, wie der OCR und der ECAR, von HSPCs zu liefern. Mit wichtigen Modifikationen und zusätzlichen Empfehlungen für die Ernte einer höheren Anzahl gesunder LSK HSPCs, die sie an der Oberfläche des Brunnens haften lassen, sowie der Optimierung der Inkubationszeit und der Medikamentenkonzentration wird dieses Protokoll Forscher zur Analyse der Glykolyse und des mitochondrialen Atmungsstatus von HSPCs sowie nicht-haftenden hämatopoetischen Zellen während der Blutentwicklung und Erkrankungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird zum Teil durch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health (HL131645, CA016058), der St. Baldrick es Foundation und der Pelotonia Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
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