Summary
조혈 줄기 전구 세포 (HSPC) 혈액 형성 동안 그들의 신진 대사 가소성으로 인해 분화 상태로 정지 상태에서 전환. 여기에서는 HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 당화 분석을 측정하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.
Abstract
조혈 줄기 전구 세포 (HSPC)는 혈액 형성의 요구를 유지하기 위해 그들의 정지 상태에서 분화 상태로 전환 할 수 있습니다 뚜렷한 대사 가소성을 가지고있다. 그러나 HSPC의 대사 상태(미토콘드리아 호흡 및 당해 용해)는 제한된 수와 비부착성, 깨지기 쉬운 HSPC에 대한 최적화된 프로토콜의 부족으로 인해 분석하기가 어려웠습니다. 여기에서, 우리는 신진 대사 호흡을 측정하기 위하여 명확한, 단계별 지침의 세트를 제공합니다 (산소 소비 비율; OCR) 및 당해(세포외 산성화 속도; Murine 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 ECAR) 이 프로토콜은 뮤린 골수에서 LSK HSPC의 높은 양을 제공하고, 배양 중 HSPC의 생존력을 향상시키고, 비 부착 HSPC의 세포 외 플럭스 분석을 용이하게 하며, 산화 인산화 및 당해 경로를 표적으로 하는 약물에 최적화된 주사 프로토콜(농도 및 시간)을 제공합니다. 이 방법은 혈액 발달 및 질병 도중 HSPC의 신진 대사 상태 그리고 건강의 예측가능하게 합니다.
Introduction
대부분의 성숙한 혈액 세포의 수명이 짧기 때문에, 혈액의 항상성은 조혈 줄기 세포 (HSPC)의 장수하지만 희귀 한 집단의 자기 갱신 및 분화에 의존합니다1. HSPC는 정지, 하지만 그들은 증식 하 고 혈액 시스템의 요구를 유지 하기 위해 자극에 차별화를 겪고 신속. 각 HSPC 세포 상태는 독특한 생체 에너지 수요를 필요로하기 때문에, 신진 대사 변화는 HSPC 운명 결정의 주요 드라이버입니다. 따라서, 대사 가소성의 손실은, 정지, 자기 갱신 및 HSPC의 분화 사이의 평형을 변경함으로써, 종종 골수- 또는 림프증증성 장애로 이어집니다. 함께, HSPC 개발의 대사 조절의 이해는 혈액 학적 악성2,3,4,5의 근본적인 메커니즘을 발견하는 데 중요합니다.
미토콘드리아 호흡과 당해는 ATP를 생성하여 세포내 반응을 유도하고 거대분자 합성에 필요한 빌딩 블록을 생성합니다. HSPC는 분화 된 세포에 비해 낮은 미토콘드리아질량을 가지고 있기 때문에 6 그들은 저산소 골수 틈새 에 정지를 유지, HSPC는 주로 당해에 의존. HSPC의 활성화는 정지의 손실과 세포 주기로의 후속 항목으로 이어지는 미토콘드리아 대사를 향상시킵니다. HSPC의 이러한 대사 가소성은 성인 생활6,7,8,9,10,11,12에 걸쳐 HSPC 풀의 유지 보수를 허용합니다. 따라서, HSPC 활성화 및 건강 상태를 분석하기 위해 산소 소비율(OCR; 산화 인산화 지수) 및 세포외 산성화 율(ECAR; glycolysis 의 지수)과 같은 그들의 대사 활동을 조사하는 것이 중요하다. OCR과 ECAR는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 실시간으로 동시에 측정할 수 있습니다. 그러나, 현재의 방법은 많은 수의 셀을 필요로 하며 부착셀(13)에최적화되어 있다. HSPC는마우스(14)로부터대량으로 분리될 수 없기 때문에, 순수한 집단을 얻기 위해 선별이 필요하고, 비부착세포(15)이며,분화를피하지 않고 하룻밤 배양될 수 없고, HSP의 OCR 및 ECAR를 측정하는 것이 어려웠다. 여기에서는 수천 개의 뮤린 골수-리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) HSPC의 대사 호흡 및 당해 를 측정하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반하는 명확한 단계별 지침 세트를 제공합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 전국 어린이 병원 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜은 2 일의 기간에 걸쳐 연대순으로 설명된다. 아래 프로토콜에 설명된 대로 신선한 시약을 사용하십시오.
1. 분석 전날 시약 준비
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센서 카트리지에 수분을 공급합니다.
- 비CO2 37°C 인큐베이터에서 교정제(재료표)의 5 mL을 밤새 인큐베이터한다.
- 플럭스 분석키트(재료 표)를열고 센서 카트리지(녹색; 위쪽)를 유틸리티 플레이트(투명; 하단)에서 분리합니다. 다음으로 센서 카트리지를 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트에 인접시됩니다.
- 멸균수를 사용하여 유틸리티 플레이트(200 μL)의 웰과 웰 주변의 챔버(400 μL)를 채웁니다.
- 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 담그면 센서가 물로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 3x를 누릅니다.
- 유틸리티 플레이트에 잠긴 카트리지를 비CO2 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 물의 증발을 방지하려면 인큐베이터가 제대로 가습되었는지 확인하십시오. 특히 일반 오븐을 사용하는 경우 카트리지 유틸리티 플레이트 옆에H2O가들어 있는 오픈 비커를 추가 예방 조치로 놓습니다.
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분석 판을 준비합니다.
- 70% 에탄올을 사용하여 생물 안전 성 캐비닛 클래스 2의 표면을 살균하십시오. 후드 아래에 분석 판을 엽니다.
- 후드 아래의 분석 판의 각각의 웰에 시판되는 0.01% (w/v) 폴리-L-리신(PLL) 용액의 40 μL을 추가합니다.
- 키트에 제공된 뚜껑으로 분석 판을 덮습니다. 1 시간 동안 후드 아래실온 (RT)에서 폐쇄 된 분석 판을 배양합니다.
참고: 인큐베이션의 목적은 PLL이 분석판의 표면에 현탁액 세포의 부착을 용이하게 하기 위해 분석판의 표면을 코팅하게 하는 것이다. - 분석판의 1시간 배양 후, 멸균 진공 계 아스피레이터로 과잉 용액을 제거하고 후드 아래에 잘 건조시다.
참고: 흡인기를 사용하여 과도한 PLL 제거 후 분석 판의 우물을 공기 건조하려면 ~ 30-60 분이 소요됩니다.
2. 분석의 날
- 카트리지를 준비합니다.
- 센서 카트리지를 들어 올립니다. 조직 배양 후드에 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트에서 물을 버립니다.
- 사전 데온 교정기의 200 μL로 유틸리티 플레이트 웰을 채웁니다.
- 교정제의 400 μL로 우물 주위의 챔버를 채웁니다.
- 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 담그고 센서가 교정장치로 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 3x를 누릅니다.
- 45-60 분 동안 비 CO2 37 °C 인큐베이터에서 유틸리티 플레이트에 잠긴 센서 카트리지를 평형화하십시오.
- 수확 뮤린 골수 유래 LSK HSPC.
- 충분한 생물학적 복제를 수용하기 위해, 분석 판의 웰 당 하나의 마우스에서 파생 된 HSPC를 사용할 계획.
참고: 이 골수 수확 방법은 각 마우스로부터 ~50,000-80,000 LSK HSPC를 제공합니다. 세포외 플럭스를 측정하는 이 프로토콜은 96개의 웰 플레이트당 ~70,000 LSK HSPC에 최적화되어 있습니다. - CO2 과다 복용 및 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 국소 IACUC 승인 방법에 따라.
- 70% 에탄올을 사용하여 해부 도구와 벤치의 표면을 살균합니다.
- 각 마우스에 대해, RT에서 2% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 1x 인산완충 식염수(PBS)로 페트리 접시 1개를 미리 채웁니다.
참고: 다음 단계에서 덩어리를 생성하기 때문에 미리 냉각된 PBS를 사용하지 마십시오. - 안락사된 마우스 전체에 70% 에탄올(v/v)을 뿌린다. 마우스17,18에서상지와 하반신, 엉덩이 뼈, 흉골, 흉골, 흉골 및 척추를 포함한 모든 뼈를 분리합니다. LSK 세포를 오염시킬 수 있으므로 마우스척수에서 흰 물질을 꺼냅니다. 모든 뼈를 1x PBS(+ 2% FBS)에 넣으세요, 수집되는 대로 페트리 접시에 추가 로 사용할 때까지 넣으세요.
- 50 mL 원추형 튜브를 반전 (매번 새로운) 페트리 접시에 1 x PBS (+ 2 % FBS)에 잠긴 뼈를 삼중화하는 데 사용합니다.
- 10 mL 혈청학적 파이펫을 사용하여, 피펫을 위아래로 (~10x) 뼈를 분쇄 한 후 뼈에서 세포를 균일하게 플러시합니다.
- 50 mL 원엽 튜브에 40 μm 세포 스트레이너를 놓습니다. 1x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL을 통과하여 스트레이너의 표면을 미리 적시십시오.
- 2.2.7단계에서 골수 유래 세포 현탁액을 수확하고 세포 스트레이너의 젖은 표면을 통과하여 뼈 찌꺼기를 제거한다.
- 모든 골재료가 50 mL 원추형 튜브에서 수집되는 마커로서 흰색으로 변할 때까지 2.2.6단계부터 2.2.9단계를 반복합니다.
참고: 그것은 수시로 모든 골수 파생한 세포를 모으기 위하여 마우스 당 2개의 50 mL 원추형 관이 걸립니다. - 원심분리기 50 mL 원추형 튜브는 500 x g 및 RT에서 5분 동안 골수 유래 세포를 함유한다.
- 상급체를 제거합니다. 골수 유래 세포(50 mL 튜브의 내용물 결합)를 최종 부피로 1x PBS(+ 2% FBS)의 5mL에 다시 중단하고 RT에서 세포를 유지합니다.
- 충분한 생물학적 복제를 수용하기 위해, 분석 판의 웰 당 하나의 마우스에서 파생 된 HSPC를 사용할 계획.
- 수확 단핵구 뮤린 골수 세포.
- 15mL 원엽 튜브에 밀도 그라데이션 매질(즉, Ficoll)의 5mL를 추가합니다. 그런 다음 골수 세포 현탁액의 5 mL를 천천히 추가하십시오. 셀이 밀도 그라데이션 매체 위의 레이어로 유지되는지 확인합니다.
- 500 x g 및 RT에서 30 분 동안 원심 분리기. 원심분리기에서 브레이크를 사용하지 마십시오. 원심분리기가 가능한 가장 낮은 가속도(예: 가속 1및 감속)에 있는지 확인합니다.
- 원심분리 후 단핵구 세포(백색색)의 중간 계면을 신선한 15 mL 원추형 튜브로 수확합니다.
- 1x PBS (+ 2 % FBS)의 5 mL로 밀도 그라데이션 배지에서 수확 한 세척 셀. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급체를 제거합니다.
- 2.3.4단계를 반복합니다.
- 1x PBS (+ 2 % FBS)의 300 μL에서 튜브의 세포 내용체를 다시 중단하십시오. FACS 튜브에서 얼룩이 없거나 단색 제어를 위한 세포 현탁액의 Aliquot 10 μL.
- 단핵구 뮤린 골수 세포에서 LSK HSPC를 수확.
- Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119 : 다음 항체의 샘플 당 3 μL을 혼합하여 비오틴 항체의 칵테일을 확인합니다. 단핵구 골수 세포의 300 μL에 비오틴 항체 칵테일 15 μL을 추가합니다.
참고: 각 항체는 1:100 희석에서 사용된다. - 4°C에서 30분 동안 비오틴 항체 칵테일을 배양하여 튜브 바닥에 세포가 응집되는 것을 피한다.
- 비오틴 항체 칵테일과 혼합된 세포에 미리 냉장된 1x PBS(+ 2% FBS)의 10 mL를 추가합니다.
- 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상급체를 버리고 1 x PBS (+ 2 % FBS)의 400 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 스트렙타비딘 단일 색상 제어를 위한 Aliquot 10 μL.
- 사용하기 전에 간략하게 소용돌이 안티 비오틴 마이크로 비드(재료표). 각 세포 샘플에 80 μL의 마이크로비드를 추가합니다(400 μL). 잘 섞고 교반과 함께 4 °C에서 추가로 20 분 동안 배양하십시오.
- 세포에 미리 냉각된 1x PBS(+ 2% FBS)의 10mL를 추가합니다. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.
- 상급체를 버리고 1 x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 자기 분리 장치를 설정하는 동안 4 °C에서 보관하십시오.
- 4°C에서 자기 보조 세포 선별(MACS) 분리기의 자기장에 컬럼(재료표)을놓습니다. 4 °C에서 중력 흐름 하에서 1x PBS (+ 2 % FBS)의 3 mL로 헹구어 자기 분리를위한 컬럼을 준비하십시오.
- 2.4.7단계에서 4°C에서 젖은 전열에 셀 현탁액을 추가합니다. 세포가 4°C에서 컬럼을 통과하고 15 mL 원엽 튜브에서 유출물을 수집하도록 한다.
참고: 이러한 유출물에 표지되지 않은 세포를 가진 분율은 농축된 계보 음성 세포를 나타낸다. - 4 °C에서 1x PBS (+ 2 % FBS)의 3 mL로 열을 세척하십시오. 3회 반복합니다. 흐름을 수집하고 4 °C에서 유지합니다. 혈세포계를 사용하여 트라이판 블루 배제에 의해 용출 된 생존 세포를 계산합니다.
- 원심분리기 500 x g 및 4°C에서 5분 동안 유동을 포함하는 15 mL 원원튜브. 상급제는 버리십시오. 1x PBS (+ 2 % FBS)의 0.5 mL에서 세포를 다시 중단하고 내용물체를 FACS 튜브로 옮김을 옮김.
- LSK 항체 칵테일 24 μL을 각 10개의 7 세포에 추가합니다. 항체 칵테일은 450-스트렙타비딘 항체, PE-CY7-Sca1 항체 및 APC-c-Kit 항체의 동일한 농도를 함유한다.
- 어두운 아래 교반과 함께 4 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오 (주석 호일로 덮여 있음).
- FACS 튜브에 1x PBS(+ 2% FBS)의 3mL를 추가합니다. 500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
- 1x PBS (+ 2 % FBS)의 1 mL에서 항체 라벨 세포를 다시 중단하십시오. 1 μL의 1 mg/mL 프로피듐 요오드화물을 분류 직전에 세포 현탁액에 넣으세요.
- LSK 세포를 분류하기 전에 바로 40 μm 스트레이너를 사용하여 FACS 튜브의 내용물.
- FACS 선별을 통해 LSK 세포를 수집하여 2 mM 글루타민, 3 mg/mL 글루타민, 1 mMPruvate, 1x 혈전세포 인자(SCF), 0.5x 페니실린/스트렙토마이신(P/7)으로 보충된 완전한 매체의 0.5 mL을 포함하는 1.5 mL 튜브로 수집합니다.
- Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119 : 다음 항체의 샘플 당 3 μL을 혼합하여 비오틴 항체의 칵테일을 확인합니다. 단핵구 골수 세포의 300 μL에 비오틴 항체 칵테일 15 μL을 추가합니다.
3. LSK HSPC의 미토콘드리아 호흡 및 글리콜리시스 어설션
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분석 판에 LSK 시드
- 원심 분리기 LSK 세포는 500 x g및 RT에서 5 분 동안 2.4.17 단계에서 상급을 폐기한다.
- 적어도 70,000 세포/40 μL의 최종 농도로 완전한 매체에 세포를 다시 중단.
- 1.2.4단계로부터 PLL 코팅된 8웰 플레이트에서 40 μL 매질(70,000 셀 함유)의 종자 함량. 모든 코너 웰을 비워 둡니다.
- 450 x g 및 RT에서 1 분 동안 원심 분리기. 브레이크를 걸지 마십시오. 세포가 반전 된 현미경을 사용하여 잘 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오.
- 175 μL의 최종 부피에 대해 각 웰의 셀에 135 μL의 완전한 용지를 추가하십시오.
- 37°C에서 2시간 동안비CO2 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
- 표 2(미토콘드리아 스트레스 테스트) 및 표 3(glycolysis 스트레스 테스트)에 기재된 메트릭을 사용하여 분석기내의 웰 플레이트의 각각의 웰에 약물을 추가하는 프로그램을 설정한다.
참고: 세포가 인큐베이션하는 동안 기기를 켜고 37°C에 있는지 확인합니다.
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미토콘드리아 스트레스 테스트
- 올리고마이신, 50 μM 카보닐 시안화물 4-(트리플루로메톡시) 페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/항마이신 A의 25 μM 스톡 솔루션을 준비합니다. 45 μM 올리고마이신 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물280 μL을 완전 용지의 용해한다. 50 μM FCCP 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물28μL을 전체 용지의 용해한다. 25 μM 로테네/항마이신 A 스톡 용액을 준비하려면, 시판되는 파우치의 내용물216 μL을 전체 용지의 용해한다.
- 센서 카트리지를 인큐베이터에서 꺼내서 각 웰이 최종 농도2 μM 올리고마이신, 1.5 μM FCCP 및 0.5 μM의 로테톤/안티마이신 A의 최종 농도를 갖도록 포트(A, B 및 C)를 적재하고 표 4에 설명된 희석 메트릭(산소 소비율)에 따라 필요에 따라.
- 유틸리티 플레이트에 조립된 센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하고 계측기 트레이에 놓습니다. 20분 정도 걸리는 교정을 시작합니다.
- 교정 후, 유틸리티 플레이트를 제거하고 LSK 세포를 함유 한 분석 판으로 대체하여 이제 웰의 바닥에 부착됩니다.
- 계속 누르면 표 2에설명된 프로그램을 시작합니다. 프로그램이 완료되면 Wave Desktop 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 분석합니다.
참고: 세포외 플럭스 분석에서 생성된 데이터는 Wave Desktop 소프트웨어의 도트 플롯을 사용하여 플롯하거나 웹 기반 통계 프로그램으로 내보낼 수 있습니다.
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글리콜리시스 스트레스 테스트
- 시판되는 파우치로부터 300 μL(100 mM), 올리고마이신 288 μL(50 μM), 2-D 포도당(2-DG)에서 300 μL(500 mM)의 완전한 매질로 포도당을 재구성한다.
- 화합물을 용해시키기 위해 상하(~10x)를 부드럽게 피펫합니다. 2-DG를 약 1분 동안 소용돌이로 하여 적절한 용해를 보장한다.
- 인큐베이터에서 센서 카트리지를 꺼낸다. 로드 포트 A~C는 표 5에 기재된 희석 메트릭들을 따라 10 mM 포도당, 2 μM 올리고마이신, 및 50 mM 2-DG의 최종 농도를 얻었다.
- 3.2.3 단계와 3.2.4 단계를 반복합니다.
- 계속 누르면 표 3에설명된 프로그램을 시작합니다. 프로그램이 완료되면 Wave Desktop 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 분석합니다.
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Representative Results
우리의 추출 방법은 우리가 마우스 당 ~ 80,000 LSK HSPC까지 수확 할 수 있었습니다. LSK 세포의 생존력과 수는 우리의 방법으로 향상되었다, 우리는 때문에: (1) 상지와 하부 사지에서 결합 된 골수, 엉덩이 뼈, 흉골, 늑골 케이지, 및 척추, (2) 세포 사멸과 응집 증가 했을 붉은 세포 용해 버퍼를 사용하여 피, (3) 단핵세포의 밀도 구배 배지 분리를 사용하고, (4) 덩어리에서 세포의 손실을 야기했을 사전 냉각 버퍼를 사용하여 피하였다.
세포 외 플럭스 분석은 전통적으로 부착 세포에 사용되었지만, 우물의 PLL 코팅의 우리의 사용, 그것에 세포의 원심 분리 에 이어, 우물의 표면에 LSK HSPC의 준수를 촉진. 이를 통해 우리는 세포외 플럭스를 측정할 수 있었고, 따라서 LSK HSPC의 대사 건강도를 측정할 수 있었습니다. 마우스로부터 수확할 수 있는 세포의 수가 제한되어 있고, 그들의 격리를 위한 프로토콜의 긴 기간을 고려할 때, 8개의 잘 포맷을 가진 분석기의 우리의 사용은 가장 비용 효율적이고 실행 가능한 해결책으로 나타났습니다(그림 1).
세포는 당해 와 미토콘드리아 호흡을 사용하여 에너지 요구 사항을 보충하고 증식 및 성장에 필요한 중간체를생산합니다 19. 헥소키나아제 효소는 포도당-6-인산염에서 포도당을 변환하고 그 후에 피루브산염20으로변환됩니다. 피루베테는 젖산으로 가공될 수 있고 양성자21를가진 세포에서 내보내질 수 있습니다. ECAR는 매체의 산성화를 측정하고 따라서 glycolysis의 표시기입니다. 피루브산은 또한 미토콘드리아로 수송되고 아세틸 코엔자임 A(CoA)로 변형될 수 있다. 아세틸 CoA는 TCA 사이클에 진입하여, 전자 수송 사슬(ETC)의 전자 이동을 구동하는 에너지 중간체를 제공하고 미토콘드리아 간 막공간(22)에서양성자 구배를 생성한다. 산소는 최종 전자 수용자로서 작용하고, 양성자는 ATP23을생성하면서 ATP 신타제 복합체를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 이동한다. OCR은 산소 소비를 측정하고 따라서 미토콘드리아 호흡을 정량화하는 데 사용됩니다.
기저 및 스트레스 조건에서 OCR 및 ECAR를 분석하기 위해, 우리는 글리콜리시스 및 미토콘드리아 호흡을 방해하는 약물의 순차적 주입을 사용했습니다. 우리는 포도당과 2-DG(2-DG)를 사용하여 각각24개의당분해를 시작하고 차단했습니다. 우리는 로테노네(ETC의 복합I특이적 억제제), 항마이신 A(ETC의 복합III 특이적 억제제), 올리고마이신(ATP 신타제의 억제제), 및 분리제 카보닐 시안화물-4-(트리플루오롬톡시)페닐히드라존(FCC)을 사용하여 ETC25의특정 이벤트를 차단하였다. 우리는 LKS HSPC에 대한 최적의 농도를 찾기 위해 이러한 시약을 적정(그림 2A, B).
당분해 스트레스 테스트를 수행하기 위해, 우리는 LSK HSPC를 포도당/피루베이트 박탈 된 매체 (제조업체에서 권장하는 대로) 또는 배지가 함유 된 포도당 / 피루베이트에서 배양했습니다. 예상대로, 우리는 ECAR의 기저 수준이 포도당 / 피루브 - 배지에서 배양 된 LSK HSPC에 비해 포도당 / 피루베테 + 배지에서 배양 된 LSK HSPC에 대해 더 높다는 것을 발견했습니다. 포도당과 첫 번째 주사는 포도당 /pyruvate- 매체에서 배양 된 LSK HSPC에서 당분해를 증폭하는 동안 포도당 / 피루바테 + 배지에서 배양 된 LSK HSPC에 대한 ECAR의 기저 수준을 변경하지 않았습니다. 그러나, ECAR의 기저 수준, 포도 당 주입 후, 포도 당/pyruvate+ 그룹에 비해 낮은 남아. 산화 인산화를 통해 ATP의 생산을 차단할 수 있는 올리고마이신을 함유한 두 번째 주사는 포도당/피루바테+ 매체에서 LSK HSPC의 최대 수준에서 당분해를 활성화시켰지만 포도당/피루바테-그룹에는 영향을 미치지 않았습니다. 포도당 유사체 2-DG를 가진 마지막 주사는 그것의 비 glycolytic 수준으로 ECAR를 반환했습니다(그림 2C).
미토콘드리아 스트레스 테스트를 위해, 우리는 포도당/피루브- 매체에서 LSK HSPC의 OCR의 기저 수준을 측정했습니다. 우리는 처음에 미토콘드리아 막을 과분화하고, ETC 복합체를 통해 더 많은 양성자 펌핑을 방지하고, 따라서 미토콘드리아 호흡의 비율을 감소시키는 올리고마이신을 처음 주입했습니다. FCCP 이온포어의 두 번째 주입은 세포가 미토콘드리아 막 전위를 회복하려고 시도함에 따라 ETC 및 OCR 수준을 최대로 밀어 붙였습니다. 다른 두 개의 ETC 억제제(항마이신 A 및 로테논)를 사용하여 최종 주사를 통해 미토콘드리아 호흡이 완전히 중단되고 OCR이 최소 수준으로 되돌아갔습니다(도2D).
도 1: 마우스 골수로부터 리니지네그Sca1+c-Kit +(LSK) 조혈 줄기 전구 세포의 분리를 입증하는 스키마. 골수는 뼈로부터 추출되고 단핵 세포(MNCs)는 밀도 구배 배지 분리를 통해 단리된다. 다음으로, 세포는 생체오염 계보+ 항체 및 스트렙타비딘-공액자성 비드로 배양되어 자기 분리 후 세포인 리니지 네거티브(Lin-)를 용출한다. 린-세포는 세포 선별에 의해 단리된 LSK 항체 및 LSK 세포로 이어서 배양된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 뮤린 리니지negSca1+c-Kit+ (LSK) 조혈 줄기 전구 세포의 세포 외 플럭스 분석. (A, B) 당화 및 미토콘드리아 호흡 중 세포 외 플럭스 분석에 사용되는 약물에 대한 기계론적 설명. (C)무린 LSK HSPC에 대한 당분해 스트레스 테스트의 대표적인 결과 또는 매체에 포도당/피루브가 없거나 존재하지 않는다. (D)뮤린 LSK HSPC에 대한 미토콘드리아 스트레스 테스트의 대표적인 결과. 오류 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다(S.D.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주식 | 최종 농도 | 30 mL용 볼륨 | |
| 완전한 미디어 | 28.691 mL | ||
| P/S | 100x | 0.5배 | 150 μL |
| L-글루타민 | 200mm | 2 mM | 300 μL |
| 피루바테 | 100 mM | 1 mM | 300 μL |
| 포도 당 | 1 M/180.2 mg/mL | 3 mg/mL | 499.4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
| Scf | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
표 1: 전체 XF 미디어의 내용 및 준비.
| 기저 | 올리고마이신 (2 μM) | FCCP (1.5 μM) | R/A(0.5 μM) | |
| 반복 | 3회 | 3회 | 3회 | 3회 |
| 혼합 | 약 3분 | 약 3분 | 약 3분 | 약 3분 |
| 기다릴 | 약 0분 | 약 0분 | 약 0분 | 약 0분 |
| 측정 | 4분 | 4분 | 4분 | 4분 |
표 2: 미토콘드리아 스트레스 테스트를 위한 주입 프로토콜.
| 기저 | 포도당 (10 mM) | 올리고마이신 (2 μM) | 2-DG (50 mM) | |
| 반복 | 3회 | 3회 | 3회 | 3회 |
| 혼합 | 약 3분 | 약 3분 | 약 3분 | 약 3분 |
| 기다릴 | 약 0분 | 약 0분 | 약 0분 | 약 0분 |
| 측정 | 약 7분 | 약 7분 | 약 7분 | 약 7분 |
표 3: 당해 응력 시험을 위한 주입 프로토콜.
| 포트 | 약물 | 최종 웰 농도(μM) | 재고 용액 량(μL) | 미디어 볼륨(μL) | 포트 솔루션(μM) | 포트에 추가된 볼륨(μL) |
| 포트 A | 올리고마이신 | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| 포트 B | FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| 포트 C | 로테네네/안티마이신 A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
표 4: 분석기의 각 웰에서 미토콘드리아 스트레스 시험을 위한 최적 약물 농도를 얻기 위한 희석 메트릭.
| 포트 | 약물 | 최종 우물 농도 | 재고 용액 량(μL) | 미디어 볼륨(μL) | 포트 솔루션 | 포트에 추가된 볼륨(μL) |
| 포트 A | 포도 당 | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| 포트 B | 올리고마이신 | 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| 포트 C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
표 5: 분석기의 각 웰에서 당해 응력 시험을 위한 최적의 약물 농도를 얻기 위한 희석 메트릭.
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Discussion
여기에서, 우리는 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 순수하고 실행 가능한 뮤린 LSK HSPC 집단의 최대 양뿐만 아니라 그들의 당해 및 미토콘드리아 호흡의 측정의 격리를 보여줍니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 LSK HSPC의 사용에 대한 다음과 같은 기술적 문제를 극복한다 : i) murine 골수14에서LSK HSPC의 낮은 빈도, ii) LSK HSPC26의낮은 기저 대사 활성, iii) LSK HSPC27의취약성, iv) 배양혈관에LSK HSPC의 비 준수를 극복한다. 또한, 세포외 플럭스 어설법의 최적 성능을 위해 약물 농도 및 배지 조성을 최적화하였다.
골수 유래 HSPC는 저산소 틈새 에 상주하고 그들의 줄기의 유지보수에 중요한 당해 표현형을표시합니다 28. 반대로 호흡은 HSPC 분화6에필수적입니다. HSPC의 대사 기능 장애는 혈액 질환으로 이어질; 여기에서, 우리는 Murine 골수 유래 LSK HSPC를 위한 OCR 및 ECAR와 같은 신진 대사 기능의 특징을 측정하기 위하여 프로토콜 및 비디오 기지를 둔 자습서를 기술했습니다.
부착 세포에 대한 제조업체의 권장 사항과는 달리, 우리는 LSK HSPC의 당분해 스트레스 테스트 결과가 포도당/피루바테-배지에 비해 포도당/피루바테+ 배지에서 배양될 때 최적의 것으로 나타났습니다. 우리는 LSK HSPC에 대한 매체에서 포도당의 부족이 비CO2 인큐베이터에서 ~2 h 평형 기간 동안 세포 사멸을 초래한다는 것을 깨달았다. 포도당 주사는 포도당/피루바테+ 배지에서 배양된 LSK HSPC에 대한 ECAR의 기저 수준을 변경하지 않았기 때문에, 프로토콜의 우리의 수정은 당해 스트레스 테스트의 본질을 보존 할뿐만 아니라, 또한 우리가 기저 당해 (어떤 주사 전에), 당화 용량 (올리고 마이신 주입 후) 및 비 당화 산성화 (2-DG 주입 후) LSK HSPc의 비 당산성 산성화 사이 구별 할 수 있습니다.
LSK HSPC의 미토콘드리아 스트레스 테스트는 LSK HSPC에서 산화 인산화에 의해 생성된 ATP가 올리고마이신 주사 후 OCR의 작은 감소와 같이 최소한임을 보여주었다. 반대로, FCCP 주입시 OCR의 상승은 LSK HSPC가 더 높은 에너지 수요에 대응할 수 있음을 확인합니다.
이 프로토콜의 목표는 HSPC의 OCR 및 ECAR와 같은 대사 기능을 측정하는 방법에 대한 비디오 기반 자습서를 동반하는 명확하고 간결한 지침 집합을 제공하는 것이었습니다. 건강한 LSK HSPC의 더 높은 숫자를 수확하기위한 주요 수정 및 추가 권장 사항으로, 인큐베이션 시간 및 약물 농도의 최적화뿐만 아니라 표면을 부착하게하는이 프로토콜은 힘을 실어 줄 것입니다. HSPC의 글리코용해 및 미토콘드리아 호흡 상태뿐만 아니라 혈액 발달 및 질병 중 비 부착 조혈 세포를 분석하는 조사자.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 국립 보건원 (HL131645, CA016058), 세인트 볼드릭 재단 및 펠로토니아 재단의 자금 지원에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
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