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Developmental Biology

हेमेटोपोइटिक स्टेम प्रोजेनिटर सेल मेटाबोलिज्म का विश्लेषण

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

रक्त गठन के दौरान मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी के कारण एक शांत राज्य से एक भेदभाव राज्य में हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाएं (एचएसपीसी) संक्रमण। यहां, हम एचएसपीसी के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस को मापने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) में अलग मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी होती है, जो उन्हें रक्त गठन की मांगों को बनाए रखने के लिए अपने शांत राज्य से एक भेदभाव राज्य में संक्रमण करने की अनुमति देती है। हालांकि, एचएसपीसी की मेटाबोलिक स्थिति (माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस) का विश्लेषण करना मुश्किल रहा है क्योंकि उनकी सीमित संख्या और गैर-अनुयायी, नाजुक एचएसपीसी के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल की कमी है। यहां, हम मेटाबोलिक श्वसन (ऑक्सीजन की खपत दर) को मापने के लिए स्पष्ट, कदम-दर-कदम निर्देशों का एक सेट प्रदान करते हैं; ओसीआर) और ग्लाइकोलाइसिस (एक्स्सेल्युलर एसिडिफिकेशन रेट; मूत्र अस्थि मज्जा-वंशनेगSca1+सी-किट+ (एलएसके) एचएसपीसी का ECAR। यह प्रोटोकॉल मूत्र अस्थि मज्जा से एलएसके एचएसपीसी की अधिक मात्रा प्रदान करता है, ऊष्मायन के दौरान एचसीपीसी की व्यवहार्यता में सुधार करता है, गैर-अनुयायी एचएसपीसी के बाह्य प्रवाह विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है, और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन और ग्लाइकोलिटिक रास्तों को लक्षित करने वाली दवाओं के लिए अनुकूलित इंजेक्शन प्रोटोकॉल (एकाग्रता और समय) प्रदान करता है। यह विधि रक्त विकास और बीमारियों के दौरान मेटाबोलिक स्थिति और एचएसपीसी के स्वास्थ्य की भविष्यवाणी को सक्षम बनाती है।

Introduction

चूंकि सबसे परिपक्व रक्त कोशिकाओं की उम्र कम है, रक्त की होमोस्टेसिस हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएसपीसी)1की लंबे समय तक रहने वाली लेकिन दुर्लभ आबादी के आत्म-नवीकरण और भेदभाव पर निर्भर करती है। एचएसपीसी शांत हैं, लेकिन वे रक्त प्रणाली की मांगों को बनाए रखने के लिए उत्तेजना पर भेदभाव पैदा करने और भेदभाव से गुजरने के लिए जल्दी कर रहे हैं । प्रत्येक एचएसपीसी सेलुलर राज्य के रूप में एक अद्वितीय जैव ऊर्जावान मांग की आवश्यकता है, चयापचय परिवर्तन एचएसपीसी भाग्य निर्णय के प्रमुख ड्राइवर हैं । इसलिए, मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी का नुकसान, एचएसपीसी के संतुलन, आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन में फेरबदल करके, अक्सर माइलो-या लिम्फो-प्रोलिफेरेटिव विकारों की ओर जाता है। साथ में, एचएसपीसी विकास के मेटाबोलिक विनियमनकी समझ2,3,4,5अंतर्निहित तंत्र को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है।

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस इंट्रासेलुलर प्रतिक्रियाओं को चलाने और मैक्रोमॉलिक्यूल सिंथेसिस के लिए आवश्यक इमारत ब्लॉकों का उत्पादन करने के लिए एटीपी उत्पन्न करते हैं। चूंकि एचएसपीसी में विभेदित कोशिकाओंकी तुलना में कम माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है और वे हाइपोक्सिक बोन मैरो निकस में quiescence बनाए रखते हैं, इसलिए एचसीपीसी मुख्य रूप से ग्लाइकोलिसिस पर भरोसा करते हैं। एचएसपीसी की सक्रियता उनके माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म को बढ़ाती है जो quiescence की हानि और सेल चक्र में उनके बाद प्रवेश की ओर जाता है। एचएसपीसी की ऐसी मेटाबॉलिक प्लास्टिसिटी एचएसपीसी पूल को वयस्क जीवन6,7, 8 ,9,10,11,12में बनाए रखने की अनुमति देती है . इसलिए, एचएसपीसी सक्रियण और स्वास्थ्य स्थिति का विश्लेषण करने के लिए ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर; ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलाइजेशन का सूचकांक) और एक्स्सेल्युलर एसिडिफिकेशन रेट (ईसीएआर; ग्लाइकोलिसिस का सूचकांक) जैसी उनकी मेटाबोलिक गतिविधियों की जांच करना महत्वपूर्ण है । ओसीआर और ईएआर दोनों को एक अतिरिक्त प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके वास्तविक समय में एक साथ मापा जा सकता है। हालांकि, वर्तमान विधि को बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है और13अनुयायी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है। चूंकि HSPCs चूहों14से बड़ी मात्रा में अलग नहीं किया जा सकता है, एक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए छंटाई की आवश्यकता है, गैर अनुयायी कोशिकाओं15हैं, और16विभेदन से बचने के बिना रातोंरात सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, यह OCR और HSPCs के ECAR को मापने के लिए मुश्किल हो गया है । यहां, हम वीडियो-आधारित ट्यूटोरियल के साथ कुछ हजारों मूत्र अस्थि मज्जा-वंशनेगस्का1+सी-किट+ (एलएसके) एचसीपीसी को मापने के तरीके पर स्पष्ट, कदम-दर-कदम निर्देश ों का एक सेट प्रदान करते हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: प्रोटोकॉल कालक्रम में वर्णित है जो दो दिनों की अवधि में फैला है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में वर्णित ताजा अभिकर्मकों का उपयोग करें।

1. परख से पहले दिन पर अभिकर्मकों की तैयारी

  1. सेंसर कारतूस हाइड्रेट करें।
    1. एक गैर सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कैलिब्रेट(सामग्री की तालिका)के 5 मिलील रातोंरात।
    2. प्रवाह परख किट(सामग्री की मेज)खोलें और सेंसर कारतूस (हरे; ऊपर) को उपयोगिता प्लेट (पारदर्शी; नीचे) से अलग करें। इसके बाद, सेंसर कारतूस को उल्टा और उपयोगिता प्लेट से सटे रखें।
    3. बाँझ पानी का उपयोग करके, उपयोगिता प्लेट (200 μL) और कुओं (400 μL) के आसपास कक्षों के कुओं को भरें।
    4. सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट में जलमग्न करें जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि सेंसर पूरी तरह से पानी से ढके हुए हैं। बुलबुले के गठन से बचने के लिए 3x पर टैप करें।
    5. यूटिलिटी प्लेट में डूबे कारतूस को रात भर नॉन सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। पानी के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर ठीक से आर्द्र है। कारतूस-उपयोगिता प्लेट के बगल में एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में एच2ओ युक्त एक खुला बीकर रखें, खासकर यदि नियमित ओवन का उपयोग कर रहे हैं।
  2. परख की थाली तैयार करें।
    1. 70% इथेनॉल का उपयोग करके बायोसेफ्टी कैबिनेट क्लास 2 की सतह को स्टरलाइज करें। हुड के नीचे परख की थाली खोलें।
    2. हुड के नीचे परख प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 0.01% (w/v) पॉली-एल-लिसिन (PLL) समाधान के 40 माइक्रोन जोड़ें।
    3. किट में दिए गए ढक्कन से परख की थाली को ढक दें। 1 घंटे के लिए हुड के नीचे कमरे के तापमान (आरटी) पर बंद परख की थाली इनक्यूबेट करें ।
      नोट: ऊष्मायन का लक्ष्य परख प्लेट की सतह पर निलंबन कोशिकाओं के आसंजन की सुविधा के लिए PLL कोट को परख प्लेट की सतह पर जाने देना है।
    4. परख प्लेट के 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, एक बाँझ वैक्यूम आधारित एस्पिरेटर और हवा हुड के नीचे अच्छी तरह से सूखी के साथ अतिरिक्त समाधान को हटा दें।
      नोट: यह आकांक्षी का उपयोग कर अत्यधिक PLL हटाने के बाद परख प्लेट के कुओं को हवा में सुखाने के लिए ~ 30−60 min लेता है।

2. परख का दिन

  1. कारतूस तैयार करें।
    1. सेंसर कारतूस उठा। इसे टिश्यू कल्चर हुड में उल्टा रखें और यूटिलिटी प्लेट से पानी को त्याग दें।
    2. यूटिलिटी प्लेट कुओं को पूर्व-गर्म कैलिबेंट के 200 माइक्रोन से भरें।
    3. कुओं के चारों ओर कक्षों को कैलिब्रेटेंट के 400 माइक्रोन से भरें।
    4. सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट में डूबकर रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि सेंसर पूरी तरह से कैलिब्रेटेंट से ढके हुए हैं। बुलबुले के गठन से बचने के लिए 3x पर टैप करें।
    5. 45−60 मिन के लिए एक गैर सीओ2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में यूटिलिटी प्लेट में डूबे सेंसर कारतूस को समतुल्य करें।
  2. हार्वेस्ट मैरिन बोन मैरो-व्युत्पन्न एलएसके एचएसपीसी।
    1. पर्याप्त जैविक प्रतिकृतियों को समायोजित करने के लिए, परख प्लेट के प्रति अच्छी तरह से एक माउस से प्राप्त एचएसपीसी का उपयोग करने की योजना है।
      नोट: यह बोन मैरो-हार्वेस्टिंग विधि प्रत्येक माउस से ~ 50,000−80,000 एलएसके एचएसपीसी प्रदान करती है। एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स को मापने के लिए यह प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से ~ 70,000 एलएसके एचएसपीसी के लिए अनुकूलित है।
    2. स्थानीय आईएसयूसी अनुमोदित तरीकों के बाद, सीओ2 ओवरडोज और सर्वाइकल अव्यवस्था का उपयोग करचूहों को इच्छामृत्यु दें।
    3. 70% इथेनॉल का उपयोग करके विच्छेदन उपकरण और बेंच की सतह को स्टरलाइज करें।
    4. प्रत्येक माउस के लिए, 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के साथ एक पेट्री डिश को प्री-फिल करें जिसमें आरटी में 2% हीट इनएक्टिवेटेड भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) शामिल हैं।
      नोट: प्री-चिल्ड पीबीएस का उपयोग न करें क्योंकि यह निम्नलिखित चरणों में झुरमुट पैदा करेगा।
    5. पूरे इच्छामृत्यु वाले माउस पर 70% इथेनॉल (v/v) स्प्रे करें। माउस17,18से ऊपरी और निचले अंगों, कूल्हे की हड्डियों, उरोस्थि, रिब पिंजरे और रीढ़ सहित सभी हड्डियों को अलग करें। माउस की रीढ़ की हड्डी से सफेद पदार्थ बाहर खींचो के रूप में यह LSK कोशिकाओं को दूषित कर सकते हैं । सभी हड्डियों को 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) में रखें, क्योंकि उन्हें आगे उपयोग तक पेट्री डिश में एकत्र किया जा रहा है।
    6. एक 50 मिलीआर शंकुट्यूब (हर बार नया) उलटा और पेट्री डिश में 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) में जलमग्न हड्डियों को त्रिकोणीय करने के लिए इसका उपयोग करें।
    7. हड्डियों को कुचलने के बाद हड्डियों से कोशिकाओं को समान रूप से बाहर निकालने के लिए 10 मीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करना, ऊपर और नीचे (~ 10x) का उपयोग करना।
    8. 50 मीटर शंकुट्यूब पर 40 माइक्रोन सेल छलनी रखें। 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 1 एमएल पास करके छलनी की सतह को प्री-वेट करें।
    9. फसल अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न सेल निलंबन चरण 2.2.7 से और यह हड्डी मलबे को हटाने के लिए सेल छलनी की पूर्व गीली सतह के माध्यम से गुजरती हैं।
    10. 2.2.9 के माध्यम से चरण 2.2.6 दोहराएं जब तक कि सभी अस्थि सामग्री एक मार्कर के रूप में सफेद न हो जाएं कि अधिकांश अस्थि मज्जा कोशिकाएं 50 मिलीआर शंकुपूर्ण ट्यूब में एकत्र की जाती हैं।
      नोट: यह अक्सर सभी अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए प्रति माउस दो 50 मिलीएल शंकुट्यूब लेता है।
    11. सेंट्रलाइज 50 0 0एल शंकुई ट्यूब जिसमें बोन मैरो-व्युत्पन्न कोशिकाएं 500 x ग्राम और आरटी पर 5 मिन के लिए होती हैं।
    12. अधिस्थान निकालें। बोन मैरो-व्युत्पन्न कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना (दोनों 50 मिलील ट्यूबों की सामग्री को जोड़ना) अंतिम मात्रा के रूप में 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 5 मिलील में और आरटी में कोशिकाओं को रखें।
  3. हार्वेस्ट मोनोन्यूकेलेट मैरो बोन मैरो कोशिकाएं।
    1. एक 15 mL शंकुट्यूब में घनत्व ढाल माध्यम (यानी, Ficoll) के 5 mL जोड़ें। इसके बाद धीरे-धीरे बोन मैरो सेल सस्पेंशन का 5 एमल डालें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं घनत्व ढाल माध्यम से ऊपर एक परत के रूप में बनी रहें।
    2. 500 x जी और आरटी पर 30 मिन के लिए सेंट्रलाइज। सेंट्रलाइज में ब्रेक का इस्तेमाल न करें। सुनिश्चित करें कि अपकेंद्रित्र सबसे कम संभव त्वरण (जैसे, 1 त्वरण और 0 मंदी) पर है।
    3. एक ताजा 15 mL शंकुट्यूब में केंद्रीकरण के बाद मोनोन्यूक्लिट कोशिकाओं (सफेद रंग) के मध्य इंटरफेस फसल।
    4. 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 5 मिलील के साथ घनत्व ढाल माध्यम से काटा कोशिकाओं को धोएं। 500 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज। अधिस्थान निकालें।
    5. दोहराएं कदम 2.3.4।
    6. 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 300 माइक्रोन में ट्यूब की सेल सामग्री को फिर से निलंबित करें। एक FACS ट्यूब में अनदाग या एकल रंग नियंत्रण के लिए सेल निलंबन के Aliquot 10 μL ।
  4. मोनोन्यूक्लिट किए गए मूत्र अस्थि मज्जा कोशिकाओं से हार्वेस्ट एलएसके एचएसपीसी।
    1. निम्नलिखित एंटीबॉडी के प्रति नमूने 3 माइक्रोन मिलाकर बायोटिन-एंटीबॉडी का कॉकटेल बनाएं: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119। मोनोन्यूक्लिट बोन मैरो कोशिकाओं के 300 माइक्रोन में बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के 15 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी का उपयोग 1:100 कमजोर पड़ने पर किया जाता है।
    2. ट्यूब के नीचे झुकाकोशिकाओं से बचने के लिए आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 डिग्री सेल्सियस के लिए बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    3. बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ मिश्रित कोशिकाओं में प्री-ठंडा 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 10 मिलील जोड़ें।
    4. 500 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को त्यागें और 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 400 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। स्ट्रेप्टाविडिन-सिंगल कलर कंट्रोल के लिए अलीकोट 10 माइक्रोन।
    5. उपयोग से पहले संक्षेप में भंवर एंटी-बायोटिन माइक्रोमोतियों(सामग्री की तालिका)। प्रत्येक कोशिका नमूने (400 माइक्रोन) में माइक्रोमोतियों के 80 माइक्रोमोतियों को जोड़ें। आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 20 मिन के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
    6. कोशिकाओं में प्री-ठंडा 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 10 मिलील जोड़ें। 500 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
    7. सुपरनेट को त्यागें और 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। चुंबकीय सेपरेशन यूनिट स्थापित करते समय 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. चुंबकीय सहायता प्राप्त कोशिका छंटाई (एमएसीएस) सेपरेटर के चुंबकीय क्षेत्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कॉलम(सामग्रीकी तालिका) रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के तहत 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 3 mL के साथ इसे rinsing द्वारा चुंबकीय जुदाई के लिए कॉलम तैयार करें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गीला कॉलम के लिए पूर्व गीला कॉलम के लिए कदम 2.4.7 से सेल निलंबन जोड़ें। कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर कॉलम के माध्यम से पारित करने और 15 मीटर शंकुट्यूब में बहिस्त्राव एकत्र करने की अनुमति दें।
      नोट: इस तरह के प्रवाह में अवेलेबल कोशिकाओं के साथ अंश समृद्ध वंश नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 3 mL के साथ कॉलम धोएं। 3x दोहराएं। फ्लो-थ्रू को कलेक्ट करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके नीले रंग के बहिष्कार को ट्राइपैन करके विशाल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    11. सेंट्रलाइज 15 एमएल शंकुई ट्यूब जिसमें 500 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए फ्लो-थ्रू होता है। अधिस्थान त्यागें। 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 0.5 एमएएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सामग्री को एक FACS ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    12. प्रत्येक 107 कोशिकाओं में एलएसके एंटीबॉडी कॉकटेल के 24 माइक्रोन जोड़ें। एंटीबॉडी कॉकटेल में 450-स्ट्रेप्टाविडिन एंटीबॉडी, पीई-CY7-Sca1 एंटीबॉडी और एपीसी-सी-किट एंटीबॉडी की बराबर एकाग्रता होती है।
    13. अंधेरे के तहत आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट (टिन पन्नी के साथ कवर)।
    14. 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 3 mL FACS ट्यूब में जोड़ें। 500 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें।
    15. 1x पीबीएस (+ 2% एफबीएस) के 1 मिलील में एंटीबॉडी-लेबल वाली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। छंटाई से ठीक पहले सेल निलंबन के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड के 1 माइक्रोन जोड़ें ।
    16. एलएसके कोशिकाओं को छांटने से ठीक पहले 40 माइक्रोन छलनी का उपयोग करके एफएसीएस ट्यूब की सामग्री फ़िल्टर करें।
    17. एलएसके कोशिकाओं को ले लीजिए, FACS छंटाई के माध्यम से, 1.5 mL ट्यूब में 2 mM ग्लूटामाइन, 3 मिलीग्राम/mL ग्लूकोज, 1 mM pyruvate, 1x थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ), 1x स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), 0.5x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) के साथ पूरक पूर्ण मीडिया के 0.5 मिलीग्राम शामिलहैं।

3. एलएसके एचएसपीसी के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलिसिस एसकह

  1. परख की थाली में एलएसके सीडिंग
    1. 500 x ग्राम और आरटी पर 5 मिन के लिए चरण 2.4.17 से सेंट्रलाइज एलएसके कोशिकाएं सुपरनेटेंट को छोड़ दें।
    2. कम से कम 70,000 कोशिकाओं/40 μL की अंतिम एकाग्रता के लिए पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. चरण 1.2.4 से प्लेट-लेपित 8-कूप में 40 माइक्रोन मीडिया (70,000 कोशिकाओं वाले) की बीज सामग्री। सभी कोने के कुओं को खाली छोड़ दें।
    4. 450 x ग्राम और आरटी पर 1 मिन के लिए सेंट्रलाइज। ब्रेक न लगाएं। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अच्छी तरह से नीचे से जुड़े हुए हैं ।
    5. 175 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के लिए पूर्ण मीडिया के 135 μL जोड़ें। खाली स्थान के रूप में प्लेट के 2 कोनों में पूर्ण मीडिया के 175 μL जोड़ें।
    6. नॉन-सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. टेबल 2 (माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट) और टेबल 3 (ग्लाइकोलाइसिस स्ट्रेस टेस्ट) में वर्णित मीट्रिक का उपयोग करके एनालाइजर में अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में दवाओं को जोड़ने के लिए एक कार्यक्रम स्थापित करें।
      नोट: जबकि कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, साधन चालू करें और सुनिश्चित करें कि यह 37 डिग्री सेल्सियस पर है।
  2. माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट
    1. ओलिगोमाइसिन, 50 माइक्रोन कार्बोनाइल सायनाइड 4-(ट्राइफ्लोरेमेथोक्सी) फिनाइलहाइड्रेज़ोन (एफसीसीपी) और रोटेनोन/एंटीमाइसिन ए के 25 माइक्रोन स्टॉक समाधानों के 45 माइक्रोएम स्टॉक समाधान तैयार करें। 45 माइक्रोएम ओलिगोमाइसिन स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के लिए, पूर्ण मीडिया के 280 माइक्रोन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थैली की सामग्री को भंग करें। 50 माइक्रोन एफसीसीपी स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, पूर्ण मीडिया के 288 माइक्रोन में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थैली की सामग्री को भंग करें। 25 μM rotenone/antimycin एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, पूरा मीडिया के २१६ μL में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध थैली की सामग्री को भंग ।
    2. इनक्यूबेटर से उपयोगिता प्लेट में सेंसर कारतूस लें और अपने बंदरगाहों (ए, बी और सी) को लोड करें जैसे कि प्रत्येक अच्छी तरह से 2 μM ओलिगोमाइसिन, 1.5 माइक्रोन एफसीसीपी, और 0.5 माइक्रोन/एंटीमाइसिन ए की अंतिम एकाग्रता होगी, आवश्यकतानुसार, टेबल 4 (ऑक्सीजन खपत दर के लिए) में वर्णित कमजोर पड़ने वाले मैट्रिक्स के बाद।
    3. यूटिलिटी प्लेट में इकट्ठे हुए सेंसर कारतूस से ढक्कन निकालकर इंस्ट्रूमेंट ट्रे पर रखें। अंशांकन शुरू करें जो 20 मिन लेगा।
    4. अंशांकन के बाद, उपयोगिता प्लेट को हटा दें और इसे एलएसके कोशिकाओं वाली परख प्लेट के साथ प्रतिस्थापित करें, जो अब कुएं के नीचे का पालन कर रहे हैं।
    5. प्रेस तालिका 2में वर्णित कार्यक्रम शुरू करने के लिए जारी रखें । कार्यक्रम के पूरा होने के बाद, डेटा को पुनः प्राप्त करें और वेव डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।
      नोट: एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स परखसे से उत्पन्न डेटा को वेव डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर से डॉट प्लॉट का उपयोग करके प्लॉट किया जा सकता है या वेब-आधारित सांख्यिकी कार्यक्रम में निर्यात किया जा सकता है।
  3. ग्लाइकोलाइसिस स्ट्रेस टेस्ट
    1. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध थैली से पूर्ण मीडिया के 300 माइक्रोन (500 मीटर) में 300 माइक्रोन (100 एमएम), ओलिगोमाइसिन में 288 माइक्रोन (50 माइक्रोएम), 2-डी ग्लूकोज (2-डीजी) में ग्लूकोज का पुनर्गठन करें।
    2. यौगिकों को घुलनशील बनाने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे (~ 10x) पिपेट करें। भंवर लगभग 1 मिन के लिए 2-डीजी मीडिया में उचित विघटन सुनिश्चित करने के लिए ।
    3. इनक्यूबेटर से सेंसर कारतूस निकालें। 10 मीटर ग्लूकोज, 2 माइक्रोन ओलिगोमाइसिन, और 50 एमएम 2-डीजी की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए तालिका 5 में वर्णित कमजोर पड़ने वाले मैट्रिक्स के बाद सी के माध्यम से लोड पोर्ट ए।
    4. दोहराएं कदम 3.2.3 और 3.2.4।
    5. प्रेस तालिका 3में वर्णित कार्यक्रम शुरू करने के लिए जारी रखें । कार्यक्रम के पूरा होने के बाद, डेटा को पुनः प्राप्त करें और वेव डेस्कटॉप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें।

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Representative Results

हमारी निष्कर्षण विधि ने हमें प्रति माउस ~ 80,000 एलएसके एचएसपीसी तक फसल करने की अनुमति दी। व्यवहार्यता और LSK कोशिकाओं की संख्या हमारी विधि के साथ सुधार किया गया, क्योंकि हम: (1) ऊपरी और निचले अंगों, कूल्हे की हड्डियों, उरोस्थि, रिब पिंजरे, और रीढ़ से संयुक्त अस्थि मज्जा, (2) लाल सेल lysis बफर का उपयोग करने से परहेज है कि सेल मौत और झुरमुट में वृद्धि हुई होगी, (3) मोनो-नाभिक कोशिकाओं के घनत्व ढाल मध्यम पृथक्करण का उपयोग किया जाता है, और (4) पूर्व-ठंडा बफर का उपयोग करने से बचा जाता है जिससे झुरमुटों में कोशिकाओं की रुचि का नुकसान होता है।

हालांकि बाह्य प्रवाह विश्लेषण पारंपरिक रूप से अनुयायी कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है, कुओं के PLL कोटिंग के हमारे उपयोग, उस पर कोशिकाओं के केंद्रीकरण के बाद, अच्छी तरह से की सतह के लिए एलएसके HSPCs के पालन की सुविधा । इससे हमें बाह्य प्रवाह को मापने की अनुमति मिली, और इस प्रकार एलएसके एचएसपीसी का मेटाबोलिक स्वास्थ्य । कोशिकाओं की सीमित संख्या है कि एक माउस से काटा जा सकता है और उनके अलगाव के लिए प्रोटोकॉल की लंबी अवधि को ध्यान में रखते हुए, अपने 8 अच्छी तरह से प्रारूप के साथ विश्लेषक के हमारे उपयोग के सबसे अधिक लागत प्रभावी और व्यवहार्य समाधान(चित्र 1)के रूप में उभरा है ।

कोशिकाएं अपनी ऊर्जा आवश्यकताओं की भरपाई करने और उनके प्रसार और विकास19के लिए आवश्यक मध्यवर्ती उत्पादन करने के लिए ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का उपयोग करती हैं । हेक्सोकिनेज़ एंजाइम ग्लूकोज-6-फॉस्फेट में ग्लूकोज को परिवर्तित करता है और बाद में इसे पायरुवेट20में बदल दिया जाता है। इसके बाद पायरुवेट को लैक्टेट में प्रोसेस किया जा सकता है और इसे सेल से प्रोटॉन21के साथ निर्यात किया जाता है । ECAR मीडिया के एसिडिफिकेशन को मापता है और इस प्रकार ग्लाइकोलाइसिस का सूचक है। पाइरुवेट को माइटोकॉन्ड्रिया में भी ले जाया जा सकता है और एसीटाइल कोएंजाइम ए (सीओए) में बदल दिया जा सकता है। एसीटाइल सीओए टीसीए चक्र में प्रवेश करता है, जो इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) के इलेक्ट्रॉन आंदोलनों को चलाने के लिए ऊर्जा मध्यवर्ती प्रदान करता है और माइटोकॉन्ड्रियल अंतर-झिल्ली अंतरिक्ष22में प्रोटोन ग्रेडिएंट उत्पन्न करता है। ऑक्सीजन अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में कार्य करता है, और प्रोटॉन एटीपी सिंथासे परिसर के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में वापस चले जाते हैं, जबकि एटीपी23उत्पन्न करते हैं। ओसीआर ऑक्सीजन की खपत को मापता है और इसलिए इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

बेसल और स्ट्रेस्ड कंडीशन में ओसीआर और ईसीएआर का विश्लेषण करने के लिए, हमने दवाओं के अनुक्रमिक इंजेक्शन का इस्तेमाल किया जो ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में हस्तक्षेप करते हैं। हमने ग्लूकोज और 2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-डीजी), ग्लूकोज एनालॉग का उपयोग क्रमशः ग्लाइकोलाइसिस को शुरू करने और ब्लॉक करने के लिएकिया। हमने रोटेनोन (ईटीसी का एक जटिल आई-विशिष्ट अवरोधक), एंटीमाइसिन ए (ईटीसी का एक जटिल III-विशिष्ट अवरोधक), ओलिगोमाइसिन (एटीपी सिंथासे का अवरोधक), और अनकपलिंग एजेंट कार्बोनिल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोमेथोक्सी) फिनाइलहाइडराज़ोन (एफसीसीपी) का उपयोग ईटीसी25की विशिष्ट घटनाओं को अवरुद्ध करने के लिए किया। हमने एलकेएस एचएसपीसी(चित्रा 2ए, बी)के लिए इष्टतम एकाग्रता खोजने के लिए ऐसे अभिकर्मकों को टिटकिया।

ग्लाइकोलिस तनाव परीक्षण करने के लिए, हमने एलएसके एचएसपीसी को ग्लूकोज/पायरुवेट वंचित मीडिया (निर्माता द्वारा अनुशंसित) में या ग्लूकोज/पायरुवेट युक्त मीडिया में सुसंस्कृत किया । जैसा कि अपेक्षित था, हमने पाया कि ग्लूकोज/पाइरुवेट + मीडिया में सुसंस्कृत एलएसके एचएसपीसी के लिए ईएआर का बेसल स्तर ग्लूकोज/पाइरुवेट मीडिया में सुसंस्कृत एलएसके एचएसपीसी के लिए अधिक था । ग्लूकोज के साथ पहला इंजेक्शन ग्लूकोज/pyruvate + मीडिया में सुसंस्कृत एलएसके एचएसपीसी के लिए ECAR के बेसल स्तर को नहीं बदला, जबकि यह एलएसके HSPCs में ग्लाइकोलिस को बढ़ाया ग्लूकोज/pyruvate-मीडिया में सुसंस्कृत । हालांकि, ग्लूकोज के साथ इंजेक्शन के बाद ईएआर का बेसल लेवल ग्लूकोज/पाइरुवेट + ग्रुप की तुलना में कम रहा । ओलिगोमाइसिन के साथ दूसरा इंजेक्शन, जो ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एटीपी के उत्पादन को अवरुद्ध कर सकता है, ग्लूकोज/पायरुवेट + मीडिया में एलएसके एचसीपीसी के अपने अधिकतम स्तर पर ग्लाइकोलिसिस को सक्रिय करता है, लेकिन यह ग्लूकोज/पायरुवेट-समूह को प्रभावित नहीं करता था । ग्लूकोज एनालॉग 2-डीजी के साथ अंतिम इंजेक्शन ने ईएआर को अपने गैर-ग्लाइकोलिटिक स्तर(चित्रा 2सी)में लौटा दिया।

माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट के लिए हमने ग्लूकोज/पाइरुवेट + मीडिया में एलएसके एचएसपीसी के ओसीआर के बेसल लेवल को मापा । हमने पहली बार ओलिगोमाइसिन को इंजेक्ट किया जो शुरू में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को हाइपरपोलाइज्ड करता था, ईटीसी परिसरों के माध्यम से अधिक प्रोटोन पंपिंग को रोका जाता था, और इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की दर कम हो जाती है। एफसीसीपी आयनोफोरस के दूसरे इंजेक्शन ने ईटीसी और ओसीआर के स्तर को अपने अधिकतम तक धकेल दिया क्योंकि कोशिकाओं ने माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को ठीक करने की कोशिश की। ईटीसी अवरोधकों (एंटीमाइसिन ए और रोटेनोन) के अन्य दो के साथ अंतिम इंजेक्शन माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के पूर्ण स्टॉप का कारण बना और इस प्रकार ओसीआर अपने न्यूनतम स्तर(चित्रा 2डी)पर वापस आ गया।

Figure 1
चित्रा 1: स्कीमा माउस बोन मैरो से वंशnegSca1+सी-किट+ (एलएसके) हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन । अस्थि मज्जा हड्डियों से निकाला जाता है और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (बहुराष्ट्रीय कंपनियों) घनत्व ढाल मध्यम ढाल जुदाई के माध्यम से अलग कर रहे हैं । इसके बाद, कोशिकाओं को उनके चुंबकीय अलगाव के बाद वंश नकारात्मक (लिन-)कोशिकाओं को एल्यूट करने के लिए बायोटिनीड लाइनेज+ एंटीबॉडी और स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। लिन- कोशिकाओं को बाद में सेल छंटाई द्वारा अलग एलएसके एंटीबॉडी और एलएसके कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मूत्र वंशnegSca1+सी-किट+ (एलएसके) हेमेटोपोइटिक स्टेम जनक कोशिकाओं का एक्सपेरिसेलुलर फ्लक्स विश्लेषण करता है। (ए, बी) ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के दौरान बाह्य प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली दवाओं का मशीनी विवरण। (ग)मीडिया में ग्लूकोज/पायरुवेट की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मूत्र एलएसके एचएसपीसी पर ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के प्रतिनिधि परिणाम । (घ)मिमूत्र एलएसके एचएसपीसी पर माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट के प्रतिनिधि परिणाम। त्रुटि सलाखों के बीच के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं (एसडी) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

भंडार अंतिम एकाग्रता 30 मीटर के लिए वॉल्यूम
पूरा मीडिया 28.691 मीटर
पी/एस 100x 0.5x 150 माइक्रोन
एल-ग्लूटामाइन 200 एमएम 2 एमएम 300 माइक्रोन
पाइरुवेट 100 एमएम 1 एमएम 300 माइक्रोन
ग्लूकोज 1 M/180.2 मिलीग्राम/mL 3 मिलीग्राम/मीटर 499.4 माइक्रोन
Tpo 100 μg/mL 100 एनजी/एमएल 30 माइक्रोन
एससीएफ 100 μg/mL 100 एनजी/एमएल 30 माइक्रोन

तालिका 1: सामग्री और पूरा XF मीडिया की तैयारी।

बेसल ओलिगोमाइसिन (2 माइक्रोन) एफसीसीपी (1.5 माइक्रोन) आर/ए (0.5 माइक्रोन)
पुनरावृत्ति 3 बार 3 बार 3 बार 3 बार
मिश्रण 3 मिन 3 मिन 3 मिन 3 मिन
ज़रा रुको 0 मिन 0 मिन 0 मिन 0 मिन
माप 4 मिन 4 मिन 4 मिन 4 मिन

तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट के लिए इंजेक्शन प्रोटोकॉल।

बेसल ग्लूकोज (10 एमएम) ओलिगोमाइसिन (2 माइक्रोन) 2-डीजी (50 एमएम)
पुनरावृत्ति 3 बार 3 बार 3 बार 3 बार
मिश्रण 3 मिन 3 मिन 3 मिन 3 मिन
ज़रा रुको 0 मिन 0 मिन 0 मिन 0 मिन
माप 7 मिन 7 मिन 7 मिन 7 मिन

तालिका 3: ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए इंजेक्शन प्रोटोकॉल।

बंदरगाह दवा अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता (μM) स्टॉक सॉल्यूशन वॉल्यूम (μL) मीडिया की मात्रा (μL) पोर्ट सॉल्यूशन (μM) मात्रा बंदरगाह में जोड़ा (μL)
पोर्ट ए ओलिगोमाइसिन 2 100 181.25 16 25
पोर्ट बी एफसीसीपी 1.5 100 270.4 13.5 25
पोर्ट सी रोटेनोन/एंटीमाइसिन ए 0.5 60 240 5 25

तालिका 4: विश्लेषक के प्रत्येक कुएं में माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण के लिए इष्टतम दवा एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने वाले मीट्रिक।

बंदरगाह दवा अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता स्टॉक सॉल्यूशन वॉल्यूम (μL) मीडिया की मात्रा (μL) पोर्ट सॉल्यूशन मात्रा बंदरगाह में जोड़ा (μL)
पोर्ट ए ग्लूकोज 10 एमएम 300 75 80 एमएम 25
पोर्ट बी ओलिगोमाइसिन 2 माइक्रोन 108 192 18 माइक्रोन 25
पोर्ट सी 2-डीजी 50mm 300 0 500 एमएम 25

तालिका 5: विश्लेषक के प्रत्येक कुएं में ग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण के लिए इष्टतम दवा एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने वाले मीट्रिक।

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Discussion

यहां, हम शुद्ध और व्यवहार्य मूत्र एलएसके एचएसपीसी आबादी की अधिकतम मात्रा के अलगाव के साथ-साथ एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक के साथ उनके ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की माप को प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल एलएसके एचएसपीसी के उपयोग के लिए निम्नलिखित तकनीकी मुद्दों पर काबू पा रहा है: i) मूत्र अस्थि मज्जा14में एलएसके एचसीपीसी की कम आवृत्ति 14,ii) एलएसके एचएसपीसी 26 की कम बेसल मेटाबोलिक गतिविधि26,iii) एलएसके एचएसपीसी27की कमजोरी, और iv) एलएसके एचसीपीसी का पालन न करने से संस्कृति जहाजों के लिए15। इसके अलावा, हमने एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स परखके के इष्टतम प्रदर्शन के लिए दवा सांद्रता और मीडिया संरचना को अनुकूलित किया है।

बोन मैरो-व्युत्पन्न एचएसपीसी हाइपोक्सिक आला में रहते हैं और वे एक ग्लाइकोलिटिक फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं, जो उनके स्टेमनेस28के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके विपरीत, श्वसन एचएसपीसी भेदभाव6के लिए आवश्यक है । चूंकि एचएसपीसी की मेटाबोलिक शिथिलता रक्त रोगों की ओर ले जाती है; यहां, हमने मूत्र अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एलएसके एचएसपीसी के लिए मेटाबोलिक कार्यों की पहचान को मापने के लिए प्रोटोकॉल और वीडियो आधारित ट्यूटोरियल का वर्णन किया है।

अनुयायी कोशिकाओं के लिए निर्माता सिफारिशों के विपरीत, हमने पाया कि एलएसके एचएसपीसी पर ग्लाइकोलिसिस तनाव परीक्षण परिणाम इष्टतम हैं जब कोशिकाओं को ग्लूकोज/पायरुवेट + मीडिया में ग्लूकोज/पायरुवेट+ मीडिया की तुलना में ग्लूकोज/पायरुवेट-मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है । हमें एहसास हुआ कि एलएसके एचएसपीसी के लिए मीडिया में ग्लूकोज की कमी के परिणामस्वरूप एक गैर-सीओ2 इनक्यूबेटर में ~ 2 एच समतुल्यता अवधि के दौरान सेल मौत होती है। ग्लूकोज इंजेक्शन के रूप में एलएसके HSPCs ग्लूकोज में सुसंस्कृत के लिए ECAR के बेसल स्तर को बदल नहीं किया/ प्रोटोकॉल का हमारा संशोधन न केवल ग्लाइकोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट के सार को बरकरार रखता है, बल्कि यह हमें बेसल ग्लाइकोलिसिस (किसी भी इंजेक्शन से पहले), ग्लाइकोलिटिक क्षमता (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद) और एलएसके एचएसपीसी के गैर-ग्लाइकोलिटिक एसिडिफिकेशन (इंजेक्शन के बाद) के बीच अंतर करने की अनुमति देता है।

एलएसके एचएसपीसी के हमारे माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट से पता चला है कि एलएसके एचएसपीसी में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन द्वारा उत्पादित एटीपी कम है जैसा कि ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद ओसीआर में छोटी कमी के साथ देखा गया है । इसके विपरीत, एफसीसीपी इंजेक्शन पर ओसीआर में ऊंचाई इस बात की पुष्टि करती है कि एलएसके एचएसपीसी उच्च ऊर्जा मांग का जवाब देने में सक्षम हैं।

साथ में, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एचसीपीसी के ओसीआर और ईएआर जैसे मेटाबोलिक कार्यों को मापने के तरीके पर वीडियो-आधारित ट्यूटोरियल के साथ स्पष्ट, संक्षिप्त निर्देशों का एक सेट प्रदान करना था। स्वस्थ एलएसके एचएसपीसी की उच्च संख्या की कटाई के लिए प्रमुख संशोधनों और अतिरिक्त सिफारिशों के साथ, उन्हें अच्छी तरह से सतह का पालन करने के साथ-साथ ऊष्मायन समय और दवा एकाग्रता का अनुकूलन, यह प्रोटोकॉल सशक्त होगा जांचकर्ताओं को एचएसपीसी के ग्लाइकोलिसिस और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन स्थिति के साथ-साथ रक्त विकास और बीमारियों के दौरान गैर-अनुयायी हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (HL131645, CA016058), सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन और पेलोतोनिया फाउंडेशन से धन समर्थन द्वारा समर्थित भाग में है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

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References

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Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

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