Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.

Abstract

Las células progenitoras hematopoyéticas del tallo (HSpC) tienen una plasticidad metabólica distinta, lo que les permite pasar de su estado de reposo a un estado de diferenciación para sostener las demandas de la formación de sangre. Sin embargo, ha sido difícil analizar el estado metabólico (respiración mitocondrial y glucólisis) de los HSCCP debido a su número limitado y la falta de protocolos optimizados para los HSCCP no adherentes y frágiles. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para medir la respiración metabólica (tasa de consumo de oxígeno; OCR) y glicólisis (tasa de acidificación extracelular; ECAR) de la médula ósea murina-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo proporciona una mayor cantidad de HSCCP LSK de la médula ósea murina, mejora la viabilidad de los HSCCP durante la incubación, facilita los análisis de flujo extracelular de los HSCCP no adherentes y proporciona protocolos de inyección optimizados (concentración y tiempo) para fármacos dirigidos a la fosforilación oxidativa y vías glucolíticas. Este método permite la predicción del estado metabólico y la salud de los HSCCP durante el desarrollo de la sangre y enfermedades.

Introduction

Dado que la vida útil de la mayoría de las células sanguíneas maduras es corta, la homeostasis de la sangre se basa en la auto-renovación y diferenciación de una población larga pero rara de células madre hematopoyéticas (HSCCP)1. Los HSCCP están en reposo, pero son rápidos para proliferar y se someten a una diferenciación al ser estimulación para sostener las demandas del sistema sanguíneo. Como cada estado celular hSPC requiere una demanda bioenergética única, los cambios metabólicos son factores clave de las decisiones del destino de HSPC. Por lo tanto, la pérdida de plasticidad metabólica, al alterar el equilibrio entre la reposo, la auto-renovación y la diferenciación de los HSCCP, a menudo conduce a trastornos mielo-o linfo-proliferativos. Juntos, la comprensión de la regulación metabólica del desarrollo de la HSPC es fundamental para descubrir mecanismos subyacentes a las neoplasias malignas hematológicas2,3,4,5.

La respiración mitocondrial y la glucólisis generan ATP para impulsar las reacciones intracelulares y producir los bloques de construcción necesarios para la síntesis de macromoléculas. Dado que los HSCCP tienen una masa mitocondrial baja en comparación con las células diferenciadas6 y sostienen la reposo en nichos hipoxicos de médula ósea, los HSCCP dependen principalmente de la glucólisis. La activación de los HSCCP mejora su metabolismo mitocondrial que conduce a la pérdida de reposo y su posterior entrada en el ciclo celular. Dicha plasticidad metabólica de hSCCP permite el mantenimiento de la piscina HSPC a lo largo de la vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, es fundamental investigar sus actividades metabólicas, como la tasa de consumo de oxígeno (OCR; índice de fosforilación oxidativa) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR; índice de glucólisis) para analizar la activación de la HSPC y el estado de salud. Tanto el OCR como el ECAR se pueden medir simultáneamente, en tiempo real, utilizando un analizador de flujo extracelular. Sin embargo, el método actual requiere un gran número de celdas y está optimizado para las celdas adherentes13. Dado que los HSCCP no se pueden aislar en grandes cantidades de ratones14,requieren clasificación para obtener una población pura, son células no adherentes15,y no se pueden cultivar durante la noche sin evitar la diferenciación16,ha sido difícil medir el OCR y el ECAR de HSCCP. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo medir la respiración metabólica y glucólisis de pocos miles de miles de médula ósea murinos-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil (IACUC).

NOTA: El protocolo se describe en orden cronológico que abarca el período de dos días. Utilice reactivos frescos como se describe en el protocolo siguiente.

1. Preparación de los reactivos el día anterior al ensayo

  1. Hidratar el cartucho del sensor.
    1. Incubar 5 ml del calibrante(Tabla de Materiales)en una incubadora no CO2 37 oC durante la noche.
    2. Abra el kit de ensayo de flujo(Tabla de materiales)y separe el cartucho del sensor (verde; superior) de la placa de servicios públicos (transparente; inferior). A continuación, coloque el cartucho del sensor boca abajo y adyacente a la placa de servicios públicos.
    3. Con agua estéril, llene los pozos de la placa de servicios públicos (200 l) y las cámaras alrededor de los pozos (400 l).
    4. Sumerja el cartucho del sensor en la placa de servicios para asegurarse de que los sensores estén completamente cubiertos por agua. Toque 3x para evitar la formación de burbujas.
    5. Coloque el cartucho sumergido en la placa de servicio en una incubadora no CO2 37 oC durante la noche. Para evitar la evaporación del agua, asegúrese de que la incubadora esté debidamente humidificada. Coloque un vaso de precipitados abierto que contenga H2O como precaución adicional junto a la placa de utilidad del cartucho, especialmente si utiliza un horno normal.
  2. Prepare la placa de ensayo.
    1. Esterilice la superficie del gabinete de bioseguridad clase 2 utilizando 70% de etanol. Abra la placa de ensayo debajo del capó.
    2. Añadir 40 ml de solución de poli-L-lisina (PLL) disponible en el uso comercial a cada pocal de la placa de ensayo bajo el capó.
    3. Cubra la placa de ensayo con la tapa incluida en el kit. Incubar la placa de ensayo cerrada a temperatura ambiente (RT) bajo el capó durante 1 h.
      NOTA: El objetivo de la incubación es dejar que la PLL recubra la superficie de la placa de ensayo para facilitar la adhesión de las células de suspensión a la superficie de la placa de ensayo.
    4. Después de 1 h de incubación de la placa de ensayo, retire el exceso de solución con un aspirador estéril a base de vacío y seque al aire el pozo debajo de la campana.
      NOTA: Se tarda n.o 30 a 60 minutos en secar al aire los pozos de la placa de ensayo después de la extracción excesiva de PLL con el aspirador.

2. Día del ensayo

  1. Prepare el cartucho.
    1. Levante el cartucho del sensor. Colóquelo boca abajo en la campana de cultivo de tejido y deseche el agua de la placa de servicios públicos.
    2. Llene los pozos de la matrícula con 200 ml del calibrador precalentado.
    3. Llene las cámaras alrededor de los pozos con 400 s de calibrador.
    4. Sumerja el cartucho del sensor en la placa de servicios públicos, asegurándose de que los sensores estén completamente cubiertos por el calibrador. Toque 3x para evitar la formación de burbujas.
    5. Equilibrar el cartucho del sensor sumergido en la placa de servicios públicos en una incubadora no CO2 37 oC durante 45 x 60 min.
  2. Cosechar HSCCP LSK derivados de la médula ósea de la murina.
    1. Para acomodar suficientes réplicas biológicas, planee utilizar HSCCP derivados de un ratón por pozo de la placa de ensayo.
      NOTA: Este método de recolección de médula ósea proporciona HSCC LSK de 50.000 a 80.000 HSCC de cada ratón. Este protocolo para medir el flujo extracelular está optimizado para HSCCP LSK de 70.000 euros por pozo de una placa de 96 pozos.
    2. Ratones eutanasiado utilizando sobredosis de CO2 y luxación cervical, siguiendo los métodos locales aprobados por la IACUC.
    3. Esterilice la superficie de las herramientas de diselación y el banco con un 70% de etanol.
    4. Para cada ratón, rellene previamente una placa Petri con 1 solución salina con fosfato (PBS) que contenga un 2% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor en RT.
      NOTA: No utilice PBS preenfriado, ya que creará grumos en los pasos siguientes.
    5. Rocíe 70% de etanol (v/v) en todo el ratón eutanizado. Aísle todos los huesos, incluidas las extremidades superiores e inferiores, los huesos de la cadera, el esternón, la caja torácica y la columna vertebral, del ratón17,18. Extraiga la materia blanca de la médula espinal del ratón, ya que puede contaminar las células LSK. Colocar todos los huesos en 1pbS (+ 2% FBS), ya que se están recolectiendo, en un plato de Petri hasta su uso posterior.
    6. Invierta un tubo cónico de 50 ml (nuevo cada vez) y utilícelo para triturar huesos sumergidos en 1pbS (+ 2% FBS) en la placa Petri.
    7. Usando una pipeta serológica de 10 ml, pipeta hacia arriba y hacia abajo (10x) para eliminar uniformemente las células de los huesos, después de triturar los huesos.
    8. Coloque un colador de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml. Prehumedezca la superficie del colador pasando 1 ml de 1pbS (+ 2% FBS).
    9. Cosecha la suspensión celular derivada de la médula ósea del paso 2.2.7 y pasala a través de la superficie prehúmeda del colador celular para eliminar los desechos óseos.
    10. Repita los pasos 2.2.6 a 2.2.9 hasta que todos los materiales óseos se vuelvan blancos como un marcador de que la mayoría de las células de la médula ósea se recogen en el tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: A menudo se necesitan dos tubos cónicos de 50 ml por ratón para recoger todas las células derivadas de la médula ósea.
    11. Centrífuga 50 ml tubos cónicos que contienen células derivadas de la médula ósea durante 5 min a 500 x g y RT.
    12. Retire el sobrenadante. Resuspender las células derivadas de la médula ósea (combinar el contenido de ambos tubos de 50 ml) en 5 ml de 1pbS (+ 2% FBS) como volumen final y mantener las células en RT.
  3. Cosecha de células de médula ósea murina mononucleada.
    1. Añadir 5 ml de medio de gradiente de densidad (es decir, Ficoll) a un tubo cónico de 15 ml. Luego agregue lentamente 5 ml de la suspensión de la médula ósea. Asegúrese de que las celdas permanezcan como una capa por encima del medio de gradiente de densidad.
    2. Centrífuga durante 30 min a 500 x g y RT. No utilice un freno en la centrífuga. Asegúrese de que la centrífuga esté en la aceleración más baja posible (por ejemplo, 1 aceleración y 0 desaceleración).
    3. Cosecha la interfaz media de las células mononucleadas (color blanco) después de la centrifugación en un tubo cónico fresco de 15 ml.
    4. Células de lavado, cosechadas a partir de un medio de gradiente de densidad, con 5 ml de 1x PBS (+ 2% FBS). Centrífuga durante 5 min a 500 x g y 4oC. Retire el sobrenadante.
    5. Repita el paso 2.3.4.
    6. Resuspenda el contenido celular del tubo en 300 ml de 1PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 l de suspensión celular para control sin manchas o de un solo color en un tubo FACS.
  4. Cosecha HSPC LSK de células de médula ósea murina mononucleada.
    1. Haga un cóctel de biotina-anticuerpos mezclando 3 l por muestra de los siguientes anticuerpos: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Añadir 15 l del cóctel de biotina-anticuerpos a 300 l de células de médula ósea mononucleadas.
      NOTA: Cada anticuerpo se utiliza a 1:100 de dilución.
    2. Incubar las células con el cóctel de biotina-anticuerpo durante 30 min a 4 oC con agitación para evitar que las células se agrupen en la parte inferior del tubo.
    3. Añadir 10 ml de 1x PBS pre-enfriado (+ 2% FBS) a las células mezcladas con el cóctel de anticuerpos biotina.
    4. Centrifugar el tubo durante 5 min a 500 x g y 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en 400 éL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 l para el control de un solo color de estreptavidina.
    5. Brevemente vórtice microbiotina microperlados(Tabla de Materiales)antes de su uso. Añadir 80 l de microperlas a cada muestra de célula (de 400 l). Mezclar bien e incubar durante 20 min adicionales a 4oC, con agitación.
    6. Agregue 10 ml de 1x PBS pre-enfriado (+ 2% FBS) a las células. Centrifugar el tubo durante 5 min a 500 x g y 4oC.
    7. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de 1pbS (+ 2% FBS). Almacenar a 4oC mientras se configura la unidad de separación magnética.
    8. Coloque una columna(Tabla de materiales)en el campo magnético del separador de clasificación de células asistidas magnéticas (MACS) a 4 oC. Preparar la columna para la separación magnética enjuagándola con 3 ml de 1pbS (+ 2% FBS) bajo el flujo de gravedad a 4 oC.
    9. Agregue la suspensión de la célula desde el paso 2.4.7 a la columna prehúmeda a 4 oC. Permita que las células pasen a través de la columna a 4 oC y recoja efluentes en un tubo cónico de 15 ml.
      NOTA: La fracción con celdas sin etiquetar en dicho efluente representa las celdas negativas de linaje enriquecido.
    10. Columna de lavado con 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) a 4oC. Repita 3x. Recoger el flujo a través y mantenerlo a 4 oC. Cuente las células viables eluidas por exclusión azul trypan usando un hemocaquímetro.
    11. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml que contiene el flujo a través de 5 min a 500 x g y 4 oC. Descarta el sobrenadante. Resuspenda las células en 0,5 ml de 1pbS (+ 2% FBS) y transfiera el contenido a un tubo FACS.
    12. Añadir 24 l del cóctel de anticuerpos LSK a cada 107 células. El cóctel de anticuerpos contiene la misma concentración de anticuerpos 450-streptavidin, anticuerpo saqueo PE-CY7-Sca1 y anticuerpo APC-c-Kit.
    13. Incubar durante 1 h a 4oC con agitación bajo la oscuridad (cubierta con papel de aluminio).
    14. Agregue 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) al tubo FACS. Centrífuga durante 5 min a 500 x g y 4oC. Descarta el sobrenadante.
    15. Resuspenda las células etiquetadas con anticuerpos en 1 ml de 1 PBS (+ 2% FBS). Añadir 1 l de 1 mg/ml de yoduro de propidium a la suspensión celular justo antes de la clasificación.
    16. Filtrar el contenido del tubo FACS utilizando un colador de 40 m justo antes de clasificar las células LSK.
    17. Recoger células LSK, a través de la clasificación FACS, en tubo de 1,5 ml que contiene 0,5 ml de medios completos complementados con 2 mM de glutamina, 3 mg/ml de glucosa, 1 mM de piruvato, 1x trombopoietin (TPO), 1x factor de células madre (SCF), 0,5x penicilina/estreptomicina (P/S), pH 7.4 (Tabla 1).

3. Ensayos de respiración mitocondrial y glucólisis de HSCCP LSK

  1. Sembrado LSK en la placa de ensayo
    1. Centrifugar las células LSK del paso 2.4.17 durante 5 min a 500 x g y RT. Deseche el sobrenadante.
    2. Resuspender las células en medios completos a una concentración final de al menos 70.000 células/40 l.
    3. Contenido de la semilla de medios de 40 l (que contiene 70.000 células) en la placa de 8 pocillos recubierta con PLL del paso 1.2.4. Deje todos los pozos de esquina vacíos.
    4. Centrífuga durante 1 min a 450 x g y RT. No aplique el freno. Asegúrese de que las células estén unidas a la parte inferior del pozo con el microscopio invertido.
    5. Añadir 135 l de medios completos a las celdas de cada pocelo para un volumen final de 175 l. Añadir 175 ml de medios completos a las 2 esquinas de la placa como espacios en blanco.
    6. Incubar las células de la incubadora no CO2 durante 2 h a 37oC.
    7. Configure un programa para agregar medicamentos a cada pozo de la placa de pozo en el analizador utilizando una métrica descrita en la Tabla 2 (prueba de esfuerzo mitocondrial) y la Tabla 3 (prueba de esfuerzo de glucólisis).
      NOTA: Mientras las células están incubando, encienda el instrumento y asegúrese de que esté a 37 oC.
  2. Prueba de esfuerzo mitocondrial
    1. Preparar soluciones de stock de 45 m de oligomicina, cianuro de carbonilo de 50 m 4-(triflurometoxi)fenilhidrazona (FCCP) y soluciones de stock de 25 m de rotenona/antimicina A. Para preparar una solución de stock de oligomicina de 45 m, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 280 ml del soporte completo. Para preparar una solución de stock FCCP de 50 m, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 288 ml del soporte completo. Para preparar una solución de stock de 25 m de rotenona/antimicina A, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 216 ml del soporte completo.
    2. Saque el cartucho del sensor de la placa de servicios públicos de la incubadora y cargue sus puertos (A, B y C) de modo que cada pozo tenga una concentración final de oligomicina de 2 M, FCCP de 1,5 m y 0,5 m de rotenona/antimicina A según sea necesario, tras las métricas descritas en la Tabla 4 (para la tasa de consumo de oxígeno).
    3. Retire la tapa del cartucho del sensor montado en la placa de servicios y colóquela en la bandeja de instrumentos. Inicie la calibración que tardará 20 minutos.
    4. Después de la calibración, retire la placa de utilidad y sustitúyala por una placa de ensayo que contenga celdas LSK, que ahora se adhieren a la parte inferior del pozo.
    5. Pulse Continuar para iniciar el programa descrito en la Tabla 2. Después de la finalización del programa, recuperar los datos y analizarlos utilizando el software Wave Desktop.
      NOTA: Los datos generados a partir de los ensayos de flujo extracelular se pueden trazar utilizando la gráfica de puntos del software Wave Desktop o exportarse al programa de estadísticas basado en web.
  3. Prueba de esfuerzo de glicólisis
    1. Reconstituir la glucosa en 300 ml (100 mM), oligomicina en 288 sL (50 oM), glucosa 2-D (2-DG) en 300 l (500 ml) de medios completos de la bolsa disponible en el comercial.
    2. Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo (10x) para solubilizar los compuestos. Vortex el 2-DG durante aproximadamente 1 min para asegurar la disolución adecuada en los medios.
    3. Retire el cartucho del sensor de la incubadora. Cargue los puertos A a C siguiendo las métricas de dilución descritas en la Tabla 5 para obtener una concentración final de glucosa de 10 mM, oligomicina de 2 m y 50 mM 2 DG.
    4. Repita los pasos 3.2.3 y 3.2.4.
    5. Pulse Continuar para iniciar el programa descrito en la Tabla 3. Después de la finalización del programa, recuperar los datos y analizarlos utilizando el software Wave Desktop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nuestro método de extracción nos permitió cosechar hasta 80.000 HSCCP LSK por ratón. La viabilidad y el número de células LSK mejoraron con nuestro método, porque: (1) combinamos la médula ósea de las extremidades superiores e inferiores, los huesos de la cadera, el esternón, la caja torácica y la columna vertebral, (2) evitamos el uso de tampón de lisis de glóbulos rojos que habría aumentado la muerte celular y el aglutinamiento, (3) utilizó la separación del medio de gradiente de densidad de las células mononucleadas, y (4) evitó el uso de tampón preenfriado que habría causado la pérdida de células de interés en los grumos.

Aunque el análisis de flujo extracelular se ha utilizado tradicionalmente para células adherentes, nuestro uso del recubrimiento PLL de pozos, seguido de la centrifugación de las células en él, facilitó la adherencia de HSCCP LSK a la superficie del pozo. Esto nos permitió medir el flujo extracelular, y por lo tanto la salud metabólica de los HSCCP LSK. Teniendo en cuenta el número limitado de células que se pueden cosechar de un ratón y la larga duración del protocolo para su aislamiento, nuestro uso del analizador con su formato de 8 pozos ha surgido como la solución más rentable y factible(Figura 1).

Las células utilizan glucólisis y respiración mitocondrial para reponer sus necesidades energéticas y producir los intermedios necesarios para su proliferación y crecimiento19. La enzima hexoquinasa convierte la glucosa en glucosa-6-fosfato y posteriormente se transforma en piruvato20. El piruvato se puede procesar en lactato y se exporta desde la célula con protones21. ECAR mide la acidificación de los medios y, por lo tanto, es un indicador de glucólisis. El piruvato también puede ser transportado a las mitocondrias y transformado en coenzima a acetil A (CoA). Acetil CoA entra en el ciclo TCA, que proporciona intermedios de energía para impulsar los movimientos de electrones de la cadena de transporte de electrones (ETC) y genera un gradiente de protones en el espacio de intermembrana mitocondrial22. El oxígeno actúa como el último aceptador de electrones, y los protones regresan a la matriz mitocondrial a través del complejo ATP sintasa mientras generan ATP23. OCR mide el consumo de oxígeno y, por lo tanto, se utiliza para cuantificar la respiración mitocondrial.

Con el fin de analizar el OCR y el ECAR en condiciones basales y estresadas, utilizamos la inyección secuencial de fármacos que interfieren con la glucólisis y la respiración mitocondrial. Utilizamos glucosa y 2-desoxiglucosa (2-DG), un análogo de glucosa, para iniciar y bloquear la glucólisis respectivamente24. Utilizamos rotenona (un inhibidor específico i complejo del ETC), antimicina A (un inhibidor específico de III complejo del ETC), oligomicina (inhibidor de ATP sintasa), y el agente de desacoplamiento carbonilo cianuro-4-(trifluorometoxi)fenilendora (FCCP) para bloquear eventos específicos del ETC25. Valoramos estos reactivos para encontrar la concentración óptima para los HSCC LKS(Figura 2A,B).

Para realizar la prueba de esfuerzo de glucólisis, cultivamos los HSCCP LSK en un medio privado de glucosa/piruvato (según lo recomendado por el fabricante), o en medios que contienen glucosa/piruvato. Como era de esperar, encontramos que el nivel basal de la ECAR era mayor para los HSPC LSK cultivados en medios de glucosa/piruvato+ en comparación con los HSPC LSK cultivados en medios de glucosa/piruvato. La primera inyección con glucosa no cambió el nivel basal de ECAR para los HSPC LSK cultivados en medios de glucosa/piruvato+, mientras que impulsó la glucólisis en los HSPC LSK cultivados en medios de glucosa/piruvato. Sin embargo, el nivel basal de la ECAR, después de la inyección con glucosa, se mantuvo más bajo en comparación con el grupo de glucosa/piruvato+. La segunda inyección con oligomicina, que podría bloquear la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa, activó la glucólisis en su nivel máximo de HSCC LSK en medios de glucosa/piruvato+, pero no afectó al grupo de glucosa/piruvato. La última inyección con el análogo de glucosa 2-DG devolvió el ECAR a su nivel no glucolítico(Figura 2C).

Para la prueba de esfuerzo mitocondrial, medimos el nivel basal de OCR de HSCCP LSK en medios de glucosa/piruvato+. Primero inyectamos oligomicina que inicialmente hiperpolarizó la membrana mitocondrial, previno más bombeo de protones a través de los complejos ETC, y así redujo la tasa de respiración mitocondrial. La segunda inyección de ionoforos FCCP empujó los niveles de ETC y OCR a su máximo a medida que las células intentaban recuperar el potencial de la membrana mitocondrial. La inyección final con otros dos inhibidores de la ETC (antimicina A y rotenona) causó la parada completa de la respiración mitocondrial y, por lo tanto, el OCR volvió a su nivel mínimo(Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Esquema que demuestra el aislamiento del linajenegSca1+c-Kit+ (LSK) células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea del ratón. La médula ósea se extrae de huesos y las células mononucleares (MNC) se aíslan a través de la separación de gradiente de densidad de gradiente medio gradiente. A continuación, las células se incuban con linaje biotinilado+ anticuerpos y cuentas magnéticas conjugadas con estreptavidina para eluir las células negativas de linaje (Lin-) después de su separación magnética. Lin- las células se incuban posteriormente con anticuerpos LSK y células LSK aisladas por clasificación celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de flujo extracelular de lineagemurino negSca1+c-Kit+ (LSK) células progenitoras hematopoyéticas. (A,B) Descripción mecanicista de los fármacos utilizados para análisis de flujo extracelular durante la glucólisis y la respiración mitocondrial. (C) Resultados representativos de la prueba de esfuerzo de glucólisis en los HSCC LSK murinos en presencia o ausencia de glucosa/piruvato en los medios. (D) Resultados representativos de la prueba de esfuerzo mitocondrial en hSCC LSK murina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Acción Concentración final Volumen de 30 ml
Medios completos 28.691 mL
P/S 100x 0.5x 150 l
L-glutamina 200 mM 2 mM 300 l
Piruvato 100 mM 1 mM 300 l
Glucosa 1 M/180.2 mg/mL 3 mg/ml 499,4 l
Tpo 100 g/ml 100 ng/mL 30 l
Scf 100 g/ml 100 ng/mL 30 l

Tabla 1: Contenido y preparación de los medios XF completos.

Basal Oligomicina (2 m) FCCP (1,5 m) R/A (0,5 m)
Repetición 3 veces 3 veces 3 veces 3 veces
Mezcla 3 min 3 min 3 min 3 min
Esperar 0 min 0 min 0 min 0 min
Medida 4 min 4 min 4 min 4 min

Tabla 2: Protocolo de inyección para la prueba de esfuerzo mitocondrial.

Basal Glucosa (10 mM) Oligomicina (2 m) 2-DG (50 mM)
Repetición 3 veces 3 veces 3 veces 3 veces
Mezcla 3 min 3 min 3 min 3 min
Esperar 0 min 0 min 0 min 0 min
Medida 7 min 7 min 7 min 7 min

Tabla 3: Protocolo de inyección para la prueba de esfuerzo de glucólisis.

Puerto Droga Concentración final del pozo (M) Volumen de la solución en stock (L) Volumen de medios (L) Solución de puerto (M) Volumen añadido al puerto (L)
Puerto A Oligomicina 2 100 181.25 16 25
Puerto B FCCP 1.5 100 270.4 13.5 25
Puerto C Rotenona/antimicina A 0.5 60 240 5 25

Tabla 4: Métricas de dilución para obtener una concentración óptima de fármacos para la prueba de esfuerzo mitocondrial en cada pocal del analizador.

Puerto Droga Concentración final de pozos Volumen de la solución en stock (L) Volumen de medios (L) Solución portuaria Volumen añadido al puerto (L)
Puerto A Glucosa 10 mM 300 75 80 mM 25
Puerto B Oligomicina 2 M 108 192 18 M 25
Puerto C 2-DG 50 mM 300 0 500 mM 25

Tabla 5: Métricas de dilución para obtener una concentración óptima de fármacos para la prueba de esfuerzo de glucólisis en cada pocal del analizador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí, demostramos el aislamiento de una cantidad máxima de población de HSCC LSK murinos puros y viables, así como la medición de su glucólisis y respiración mitocondrial con un analizador de flujo extracelular. Específicamente, el protocolo supera los siguientes problemas técnicos para el uso de HSCCP LSK : i) la baja frecuencia de HSCCP LSK en médula ósea murina14, ii) actividad metabólica basal baja de LSK HSCCP26, iii) la fragilidad de LSK HSCCP27, y iv) la no adherencia de HSK HSCCP a los vasos de cultivo15. Además, hemos optimizado las concentraciones de fármacos y la composición de medios para el rendimiento óptimo de los ensayos de flujo extracelular.

Los HSCCP derivados de la médula ósea residen en el nicho hipoxico y muestran un fenotipoglucolítico, que es crucial para el mantenimiento de su tallo2. Por el contrario, la respiración es esencial para la diferenciación de HSPC6. Como la disfunción metabólica de los HSCCP conduce a enfermedades de la sangre; aquí, hemos descrito el protocolo y tutoriales basados en vídeo para medir las características distintivas de las funciones metabólicas, como el OCR y el ECAR, para los HSC LSK derivados de la médula ósea murina.

Contrariamente a las recomendaciones del fabricante para las células adherentes, encontramos que los resultados de la prueba de esfuerzo de glucólisis en HSCCP LSK son óptimos cuando las células se cultivan en medios de glucosa/piruvato+ en comparación con los medios de glucosa/piruvato. Nos dimos cuenta de que la falta de glucosa en los medios para los HSCCP LSK da lugar a la muerte celular durante el período de equilibrio de 2 h en una incubadora no CO2. Dado que la inyección de glucosa no cambió el nivel basal de ECAR para los HSPC LSK cultivados en medios de glucosa/piruvato+, nuestra modificación del protocolo no sólo preserva la esencia de la prueba de esfuerzo glucolítico, sino que también nos permite distinguir entre la glucólisis basal (antes de cualquier inyección), la capacidad glucolítica (después de la inyección de oligomicina) y la acidificación no glucolítica (después de la inyección con 2-DG) de los HSCC LSK.

Nuestra prueba de esfuerzo mitocondrial de HSCCP LSK demostró que el ATP producido por la fosforilación oxidativa en HSCC LSK es mínimo como se ve con la pequeña reducción en el OCR después de la inyección de oligomicina. Por el contrario, la elevación en el OCR tras la inyección FCCP afirma que los HSCC LSK son capaces de responder a una mayor demanda de energía.

Juntos, el objetivo de este protocolo era proporcionar un conjunto de instrucciones claras y concisas para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo medir las funciones metabólicas, como el OCR y el ECAR, de los HSCCP. Con modificaciones clave y recomendaciones adicionales para la recolección de un mayor número de HSCCP LSK sanos, haciéndolos adherentes a la superficie del pozo, así como la optimización del tiempo de incubación y la concentración de drogas, este protocolo permitirá investigadores para analizar la glucólisis y el estado de respiración mitocondrial de los HSCCP, así como las células hematopoyéticas no adherentes durante el desarrollo de la sangre y las enfermedades.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo está en parte respaldado por el apoyo de financiación de los Institutos Nacionales de Salud (HL131645, CA016058), la Fundación St. Baldrick y la Fundación Pelotonia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

Biología del desarrollo Número 153 células progenitoras hematopoyéticas metabolismo respiración mitocondrial glucólisis análisis de flujo extracelular células no adherentes
Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter