Summary
Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) farklı metabolik plastisite var, hangi onları kan oluşumu taleplerini sürdürmek için bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş sağlar. Ancak, sınırlı sayıda ve non-adherent, kırılgan HSPCs için optimize protokollerin eksikliği nedeniyle HSPCs metabolik durumunu (mitokondriyal solunum ve glikoliz) analiz etmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunumu (oksijen tüketim oranı) ölçmek için bir dizi açık, adım adım talimatlar salıyoruz; OCR) ve glikoli (ekstrasellüler asitleşme hızı; ECAR) murine kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Bu protokol, murin kemik iliğinden daha yüksek miktarda LSK HSPC sağlar, kuluçka sırasında HSPC'lerin canlılığını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizlerini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyon ve glikolitik yolları hedefleyen ilaçlar için optimize edilmiş enjeksiyon protokolleri (konsantrasyon ve zaman) sağlar. Bu yöntem, kan gelişimi ve hastalıkları sırasında hspcs metabolik durum ve sağlık tahmin sağlar.
Introduction
En olgun kan hücrelerinin ömrü kısa olduğundan, kan homeostazı kendini yenileme ve hematopoetik kök hücrelerin uzun ömürlü ama nadir popülasyonun farklılaşması dayanır (HSPCs)1. HSPCs quiescent, ancak çoğalmak için hızlı ve kan sisteminin taleplerini sürdürmek için uyarılma üzerine farklılaşma uğrar. Her HSPC hücresel devlet benzersiz bir biyoenerjik talep gerektirir gibi, metabolik değişiklikler HSPC kader kararlarının önemli sürücüleri vardır. Bu nedenle, metabolik plastisite kaybı, quiescence arasındaki dengeyi değiştirerek, kendini yenileme, ve HSPCs farklılaşması, genellikle miyelo yol açar- veya lenfo-proliferatif bozukluklar. Birlikte, HSPC gelişiminin metabolik regülasyon anlayışı hematolojik maligniteler2,3,4,5altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Mitokondriyal solunum ve glikoliz hücre içi reaksiyonları yönlendirmek ve makromolekül sentezi için gerekli yapı taşlarını üretmek için ATP üretir. HSPC'ler farklılaşmışhücreler6 ile karşılaştırıldığında düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğundan ve hipoksik kemik iliği nişlerinde quiescence sürdürmek, HSPCs öncelikle glikoliz güveniyor. HSPCs aktivasyonu quiescence kaybı ve hücre döngüsüne sonraki giriş yol açan onların mitokondriyal metabolizmageliştirir. HSPCs bu tür metabolik plastisite yetişkinyaşam6,7,8,9,10,11,12boyunca HSPC havuzunun bakım sağlar. Bu nedenle, HSPC aktivasyonunu ve sağlık durumunu analiz etmek için oksijen tüketim hızı (OCR; oksidatif fosforilasyon indeksi) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR; glikoliz indeksi) gibi metabolik aktivitelerinin araştırılması önemlidir. Hem OCR hem de ECAR, hücre dışı akı analizörü kullanılarak gerçek zamanlı olarak aynı anda ölçülebilir. Ancak, geçerli yöntem çok sayıda hücre gerektirir ve yapışık hücreler için optimize edilir13. HSPCs fareler den büyük miktarlarda izole edilemez olduğundan14, saf bir popülasyon elde etmek için sıralama gerektiren, non-yapışık hücreler15, ve farklılaşma kaçınarak olmadan bir gecede kültürolamaz16, OCR ve HSPCs ECAR ölçmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunum ve birkaç bin murin kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs glikoliz ölçmek için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik etmek için net, adım adım talimatlar bir dizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Nationwide Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol, iki günlük bir süreye yayılan kronolojik sırada açıklanmıştır. Aşağıdaki protokolde açıklandığı gibi taze reaktifler kullanın.
1. Tsanın Dan Önceki Gün Reaktiflerin Hazırlanması
-
Sensör kartuşu nemlendirin.
- Bir gecede CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde 5 mL kalibran(Malzeme Tablosu)inkübat.
- Akı çıkış kitini(Malzeme Tablosu)açın ve sensör kartuşunu (yeşil; üst) yardımcı plakadan (saydam; alt) ayırın. Ardından, sensör kartuşu baş aşağı ve yardımcı plakaya bitişik yerleştirin.
- Steril su kullanarak, yardımcı plaka (200 μL) kuyularını ve kuyuların etrafındaki odaları (400°L) doldurun.
- Sensör kartuşu, sensörlerin tamamen suyla kaplı olduğundan emin olmak için yardımcı plakaya batırın. Kabarcıkların oluşumunu önlemek için 3x dokunun.
- Kartuşun yardımcı plakaya batırılmış bir gece boyunca CO2 37 °C olmayan bir kuluçka makinesine yerleştirin. Suyun buharlaşmasını önlemek için, kuvözün düzgün bir şekilde nemlendirildidiğinden emin olun. Özellikle normal bir fırın kullanıyorsanız, kartuş yardımcı plakasının yanına ekstra bir önlem olarak H2O içeren açık bir kabı yerleştirin.
-
Bir ataşme plakasını hazırlayın.
- %70 etanol kullanarak biyogüvenlik kabini sınıf 2 yüzeyini sterilize edin. Kaputun altındaki istinat plakasını açın.
- Kaputun altındaki istin plakasının her kuyusuna %0,01 (w/v) poli-L-l-lizin (PLL) çözeltisi ekleyin.
- Kitte belirtilen kapak ile ele ataşma plakası. Kapatılan sayisplakayı oda sıcaklığında (RT) kaputun altinda 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Kuluçka nın amacı, askı hücrelerinin asaplakasının yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için PLL'nin ar-sonuç plakasının yüzeyini kaplamasına izin vermektir. - 1 saat inkübasyon sonra, steril vakum tabanlı aspiratör ile aşırı çözelti kaldırmak ve hava kaputun altında iyi kuru.
NOT: Aspiratör kullanılarak aşırı PLL çıkarılmasını takiben, ar-saymanın kuyularını havayla kurutmak ~30−60 dakika sürer.
2. Tasniye Günü
- Kartuşunu hazırlayın.
- Sensör kartuşu kaldır. Doku kültürü başlık baş aşağı yerleştirin ve yardımcı plaka su atın.
- Yardımcı plaka kuyularını önceden ısıtılmış kalibran 200 μL ile doldurun.
- Kuyuların etrafındaki odaları 400 μL kalibr ile doldurun.
- Sensör kartuşu servis plakasına batırın, sensörlerin tamamen kalikan tarafından kaplandığından emin olun. Kabarcıkların oluşumunu önlemek için 3x dokunun.
- Sensör kartuşu, yardımcı plakaya batırılmış, CO2 37 °C olmayan bir kuluçka makinesinde 45−60 dakika boyunca dengeleyin.
- Hasat murine kemik iliği kaynaklı LSK HSKCs.
- Yeterli biyolojik kopyaları karşılamak için, bir fareden elde edilen HSPC'leri, bir fareden elde edilen gazlı plakanın her yerine kullanmayı planlayın.
NOT: Bu kemik iliği hasat yöntemi her fareden ~50.000−80.000 LSK HSK sağlar. Hücre dışı akı ölçmek için bu protokol 96 iyi plaka iyi kuyu başına ~ 70.000 LSK HSPCs için optimize edin. - Yerel IACUC onaylı yöntemleri izleyerek CO2 aşırı doz ve servikal çıkış kullanarak fareleri ötenazi.
- % 70 etanol kullanarak diseksiyon araçları ve tezgah yüzeyini sterilize.
- Her fare için, rt de% 2 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) içeren 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile önceden bir Petri kabı doldurun.
NOT: Aşağıdaki adımlarda kümeler oluşturacağı için önceden soğutulmuş PBS kullanmayın. - Tüm ötenazili fareye %70 etanol (v/v) püskürtün. Üst ve alt ekstremiteler, kalça kemikleri, göğüs kafesi, göğüs kafesi ve omurga dahil olmak üzere tüm kemikleri izole, fare17,18. LSK hücrelerini kirletebildiği için farenin omuriliğindeki beyaz maddeyi çıkarın. Tüm kemikleri 1x PBS'ye (+ %2 FBS) yerleştirin, toplandığı gibi, daha fazla kullanıma kadar bir Petri kabına koyun.
- 50 mL konik bir tüpü ters çevirin (her seferinde yeni) ve Petri kabında 1x PBS'ye (+ %2 FBS) batırılmış kemikleri triturate etmek için kullanın.
- Kemikleri ezdikten sonra 10 mL serolojik pipet kullanarak, kemikleri eşit şekilde dışarı atmak için yukarı ve aşağı pipet (~10x).
- 50 mL konik bir tüp üzerine 40 m hücreli süzgeç yerleştirin. 1 mL 1x PBS (+ %2 FBS) geçirerek süzgeç yüzeyini önceden ısla.
- Hasat kemik iliği türetilmiş hücre süspansiyon adım 2.2.7 ve kemik enkaz kaldırmak için hücre süzgeç önceden ıslak yüzeyinden geçmek.
- Tüm kemik malzemeleri 50 mL konik tüpte kemik iliği hücrelerinin çoğunun toplandığı bir belirteç olarak beyaza dönüşene kadar 2.2.6'dan 2.2.9'a kadar adımları tekrarlayın.
NOT: Genellikle tüm kemik iliği kaynaklı hücreleri toplamak için fare başına iki 50 mL konik tüpler alır. - 5 dk 500 x g ve RT için kemik iliği türetilmiş hücreleri içeren santrifüj 50 mL konik tüpler.
- Supernatant çıkarın. Kemik iliği türemiş hücreleri (her iki 50 mL tüpün içeriğini birleştirin) 5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) son hacim olarak askıya alın ve hücreleri RT'de tutun.
- Yeterli biyolojik kopyaları karşılamak için, bir fareden elde edilen HSPC'leri, bir fareden elde edilen gazlı plakanın her yerine kullanmayı planlayın.
- Hasat mononükleli murine kemik iliği hücreleri.
- 15 mL konik tüpe 5 mL yoğunluk gradyan ortamı (yani Ficoll) ekleyin. Sonra yavaş yavaş kemik iliği hücre süspansiyon 5 mL ekleyin. Hücrelerin yoğunluk degrade ortamının üzerinde bir katman olarak kaldığından emin olun.
- 500 x g ve RT 30 dk için santrifüj. Santrifüjde fren kullanmayın. Santrifüjün mümkün olan en düşük ivmede olduğundan emin olun (örn. 1 hızlanma ve 0 yavaşlama).
- Yeni bir 15 mL konik tüp içine santrifüj aşağıdaki mononükleli hücrelerin orta arayüzü (beyaz renk) hasat.
- 5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile yoğunluk gradyan ortamdan alınan hücreleri yıkayın. 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj. Supernatant çıkarın.
- Adımı tekrarlayın 2.3.4.
- Tüpün hücre içeriğini 300 μL 1x PBS 'de (+ %2 FBS) yeniden askıya alın. Aliquot 10 μL hücre süspansiyonu ile facs tüpünde lekesiz veya tek renk kontrolü için.
- Mononükleli murin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri hasat edin.
- Aşağıdaki antikorların numunesi başına 3 μL karıştırılarak biotin-antikorkokteyli yapın: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. 300 μL mononükleli kemik iliği hücrelerine 15 μL biotin-antikor kokteyli ekleyin.
NOT: Her antikor 1:100 seyreltme kullanılır. - Tüpün alt kısmında hücrelerin kümelenmesini önlemek için 4 °C'de 30 dakika boyunca biotin-antikor kokteyli ile inkübe hücreleri ajitasyon ile.
- Biotin-antikor kokteyli ile karıştırılmış hücrelere önceden soğutulmuş 1x PBS (+ %2 FBS) 10 mL ekleyin.
- Tüpü 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın ve 1x PBS (+ 2% FBS) 400 μL hücre pelet resuspend. Streptavidin-tek renk kontrolü için Aliquot 10 μL.
- Kısaca girdap anti-biotin mikroboncuklar(Tablo Malzemeler)kullanmadan önce. Her hücre örneğine (400 μL) 80 μL mikroboncuk ekleyin. Iyice karıştırın ve 4 °C'de ek 20 dakika, ajitasyon ile kuluçka.
- Hücrelere önceden soğutulmuş 1x PBS (+ %2 FBS) 10 mL ekleyin. Tüpü 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
- Supernatant atın ve 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) hücre pelet resuspend. Manyetik ayırma ünitesi kurarken 4 °C'de saklayın.
- 4 °C'de manyetik destekli hücre sıralama (MACS) ayırıcısının manyetik alanına bir sütun(Malzeme Tablosu)yerleştirin. 4 °C'deki yerçekimi akışı altında 3 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile durulayarak kolonu manyetik ayırmaya hazırlayın.
- 2.4.7 adımdaki hücre süspansiyonuna 4 °C'deki ıslak öncesi kolona ekleyin. Hücrelerin 4 °C'de sütundan geçmesine ve 15 mL konik tüpte atık toplamasına izin verin.
NOT: Bu tür atık taslanmamış hücrelere sahip fraksiyon, zenginleştirilmiş soy negatif hücreleri temsil eder. - 4 °C'de 3 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile yıkama sütunu. 3x'i tekrarlayın. Akış tantana sını toplayın ve 4 °C'de tutun. Bir hemositometre kullanarak trypan mavi dışlama tarafından eluted canlı hücreleri saymak.
- 500 x g ve 4 °C'de 5 dk boyunca akış içeren 15 mL konik tüpü santrifüj edin. Supernatant atın. Hücreleri 0,5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) olarak yeniden askıya alın ve içindekileri bir FACS tüpüne aktarın.
- Add 24 μL of the LSK antibody cocktail to each 107 cells. Antikor kokteyli 450-streptavidin antikor eşit konsantrasyon, PE-CY7-Sca1 antikor ve APC-c-Kit antikor içerir.
- 4 °C'de 1 saat boyunca karanlık altında ajitasyon ile (folyo ile kaplı) kuluçka.
- FACS tüpüne 3 mL 1x PBS (%+ 2 FBS) ekleyin. 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj. Supernatant atın.
- 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) antikor etiketli hücreleri resuspend. Sıralamadan hemen önce hücre süspansiyonuna 1 mg/mL propidium iyodür ekleyin.
- LSK hücrelerini sıralamadan hemen önce 40 μm'lik bir süzgeç kullanarak FACS tüpünün içeriğini filtreleyin.
- LSK hücrelerini, FACS sıralama yoluyla, 2 mM glutamin, 3 mg/mL glukoz, 1 mM piropoietin (TPO), 1x kök hücre faktörü (SCF), 0,5x penisilin/streptomisin (P/S), pH 7.4Tabloile desteklenen 0,5 mL tam ortam içeren 1,5 mL tüp içine toplayın.
- Aşağıdaki antikorların numunesi başına 3 μL karıştırılarak biotin-antikorkokteyli yapın: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. 300 μL mononükleli kemik iliği hücrelerine 15 μL biotin-antikor kokteyli ekleyin.
3. LSK HSPC'lerin Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tahlilleri
-
Istina plakasında LSK tohumlama
- 500 x g ve RT 5 dakika için adım 2.4.17 gelen Centrifuge LSK hücreleri.
- Hücreleri tam ortamda en az 70.000 hücre/40 μL'lik son konsantrasyona geri alın.
- Adım 1.2.4'ten itibaren PLL kaplı 8 kuyulu plakada 40 μL medianın (70.000 hücre içeren) tohum içeriği. Tüm köşe kuyularını boş bırakın.
- 450 x g ve RT 1 dakika santrifüj. Freni uygulamayın. Hücrelerin ters mikroskobu kullanarak kuyunun dibine bağlı olduğundan emin olun.
- 175 μL'lik son bir hacim için her kuyudaki hücrelere 135°L tam ortam ekleyin.
- CO2 olmayan inkübatördeki hücreleri 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Tablo 2 (mitokondriyal stres testi) ve Tablo 3'te (glikoliz stres testi) açıklanan bir metrik kullanarak analizördeki kuyu plakasının her kuyusuna ilaç eklemek için bir program ayarlayın.
NOT: Hücreler kuluçkaya yatarken aleti açın ve 37 °C'de olduğundan emin olun.
-
Mitokondriyal stres testi
- Oligomisin 45 μM stok çözeltisi, 50 μM karbonil siyanür 4-(trifluromethoxy)fenilhidrat (FCCP) ve rotenon/antimisin A 25 μM stok çözeltisi hazırlayın. 45 μM oligomisin stok çözeltisi hazırlamak için, tam ortam 280 μL'de ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini çözün. 50 μM FCCP stok çözeltisi hazırlamak için, ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini tam ortamın 288 μL'sinde çözün. 25 μM rotenone/antimycin A stok çözeltisi hazırlamak için, tam ortam 216 μL'de ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini çözün.
- Program plakasındaki sensör kartuşunu kuvözden alın ve bağlantı noktalarını (A, B ve C) her kuyuda 2 μM oligomisin, 1,5 μM FCCP ve 0,5 μM rotenone/antimycin A konsantrasyonuna sahip olacak şekilde, Tablo 4'te açıklanan seyreltme ölçümlerini (oksijen tüketim hızı için) takip ederek yükleyin.
- Kapağı, yardımcı plakada monte edilen sensör kartuşundan çıkarın ve alet tepsisinin üzerine yerleştirin. 20 dakika sürecek kalibrasyonu başlatın.
- Kalibrasyondan sonra, yardımcı plakayı çıkarın ve şimdi kuyunun dibine yapıştırılan LSK hücreleri içeren bir adak plakası ile değiştirin.
- Tablo 2'deaçıklanan programı başlatmak için Continue tuşuna basın. Programın tamamlanmasından sonra, verileri almak ve Dalga Masaüstü yazılımı kullanarak bunları analiz.
NOT: Hücre dışı akı testlerinden oluşturulan veriler Wave Desktop yazılımındaki nokta çizimi kullanılarak çizilebilir veya web tabanlı istatistik programına aktarılabilir.
-
Glikoliz stres testi
- 300 μL (100 mM), oligomisin 288 μL (50 μM), 2-D glukoz (2-DG) 300 μL (500 mM) tam ortam içinde ticari olarak kullanılabilir kese glukoz yeniden oluşturma.
- Yavaşça pipet yukarı ve aşağı (~ 10x) bileşikleri solubilize etmek. Girdap 2-DG yaklaşık 1 dk için medya içine uygun çözünme sağlamak için.
- Sensör kartuşu kuvözden çıkarın. 10 mM glikoz, 2 μM oligomisin ve 50 mM 2-DG son konsantrasyonu elde etmek için Tablo 5'te açıklanan seyreltme ölçümlerini takiben A ile C arasındaki yük bağlantı noktaları.
- 3.2.3 ve 3.2.4 adımlarını yineleyin.
- Tablo 3'teaçıklanan programı başlatmak için Continue tuşuna basın. Programın tamamlanmasından sonra, verileri almak ve Dalga Masaüstü yazılımı kullanarak bunları analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çıkarma yöntemimiz fare başına ~80.000 LSK HSPC'ye kadar hasat yapmamızı sağladı. LSK hücrelerinin canlılığı ve sayıları yöntemimizle geliştirildi, çünkü biz: (1) üst ve alt ekstremitelerden kemik iliği, kalça kemikleri, sternum, göğüs kafesi ve omurga, (2) hücre ölümü ve kümelenmeyi artıracak kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçındı, (3) mono-çekirdekli hücrelerin yoğunluk gradyan orta ayırma kullanılan ve (4) kümelerde ilgi hücrelerinin kaybına neden olurdu önceden soğutulmuş tampon kullanarak kaçınılmalıdır.
Hücre dışı akı analizi geleneksel olarak yapışık hücreler için kullanılmış olsa da, kuyuların PLL kaplamasını kullanmamız, bunun üzerindeki hücrelerin santrifüjünün ardından, LSK HSPC'lerin kuyu yüzeyine kolayyapışmasını kolaylaştırmıştır. Bu bize ekstrasellüler akı ölçmek için izin, ve böylece LSK HSPCs metabolik sağlık. Bir fare den hasat edilebilir hücrelerin sınırlı sayıda ve izolasyon için protokol uzun süre göz önüne alındığında, onun 8 iyi biçimi ile analizör kullanımı en uygun maliyetli ve uygulanabilir çözüm olarak ortaya çıkmıştır(Şekil 1).
Hücreler glikoliz ve mitokondriyal solunum uyup enerji gereksinimlerini doldurmak ve çoğalma ve büyüme için gerekli ara üretmek için kullanın19. Heksokinaz enzimi glikoz-6-fosfat glikoz dönüştürür ve daha sonra pirüvatdönüşür 20. Piruvat daha sonra laktat içine işlenebilir ve proton21ile hücreden ihraç edilir. ECAR ortamın asitleşmesini ölçer ve bu nedenle glikolilerin bir göstergesidir. Piruvat da mitokondri içine taşınır ve asetil koenzim A dönüştürülebilir (CoA). Asetil CoA, Elektron Taşıma Zinciri'nin (ETC) elektron hareketlerini yönlendirmek için enerji ara ları sağlayan ve mitokondriyal inter-membran uzayında bir proton gradyanı üreten TCA döngüsüne girer22. Oksijen son elektron kabul edici sayılsa ve protonlar ATP synthase kompleksi aracılığıyla mitokondriyal matrise geri hareket ederken ATP23üretirler. OCR oksijen tüketimini ölçer ve bu nedenle mitokondriyal solunumu ölçmek için kullanılır.
Bazal ve stresli koşullarda OCR ve ECAR'ı analiz etmek için glikoliz ve mitokondriyal solunumu engelleyen ilaçların ardışık enjeksiyonunu kullandık. Biz glikoz ve 2-deoksiglukoz (2-DG), bir glikoz analog, başlatmak ve glikoliz blok sırasıyla24kullanılır. Biz Rotenon (ETC karmaşık bir I-spesifik inhibitörü), antimisin A (ETC karmaşık bir III-spesifik inhibitörü), oligomisin (ATP synthase inhibitörü) ve uncoupling ajan karbonil siyanür-4-(trifluoromethoxy)fenilhidraz (FCCP) ETC25belirli olayları engellemek için kullanılır. LKS HSPC'ler için en uygun konsantrasyonu bulmak için bu tür reaktifleri titre ettik(Şekil 2A,B).
Glikoliz stres testini gerçekleştirmek için, LSK HSPC'leri glikoz/pirüvat yoksun ortamlarında (üretici nin önerdiği gibi) veya ortam içeren glikoz/pirüvatta kültürlendik. Beklendiği gibi, Glukoz/pirüvat+ ortamlarda kültürlenen LSK HSPC'ler için ECAR bazal düzeyinin glukoz/pirüuvat- ortamda kültürlenen LSK HSPC'lere göre daha yüksek olduğunu bulduk. Glukozlu ilk enjeksiyon, glukoz/pirüuvat+ ortamda kültürlenen LSK HSPC'ler için ECAR'ın bazal düzeyini değiştirmezken, glukoz/pirüuvat-media'da kültürlenen LSK HSPC'lerde glikoliz arttı. Ancak, ECAR bazal düzeyi, glikoz ile enjeksiyon dan sonra, glukoz / pirüvat + gruba göre daha düşük kaldı. Oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimini engelleyebilecek oligomisin içeren ikinci enjeksiyon, glikoz/pirüuvat+ ortamda maksimum LSK HSPC seviyesinde glikoliz aktive edildi, ancak glikoz/pirüvat grubunu etkilemedi. Glukoz analogu 2-DG ile yapılan son enjeksiyon ECAR'ı glikolitik olmayan seviyesine geri döndürmüştür(Şekil 2C).
Mitokondriyal stres testi için LSK HSPC'lerin OCR'sinin bazal düzeyini glukoz/pirüuvat+ ortamda ölçtük. İlk olarak mitokondriyal membranı hiperpolarize eden, ETC komplekslerinden daha fazla proton pompalanmasını engelleyen ve böylece mitokondriyal solunum oranını azaltan oligomisin enjekte ettik. FCCP iyonoforlarının ikinci enjeksiyonu, hücreler mitokondriyal membran potansiyelini kurtarmaya çalışırken ETC ve OCR düzeylerini maksimuma itti. ETC inhibitörlerinden diğer ikisi (antimisin A ve rotenon) ile yapılan son enjeksiyon mitokondriyal solunumun tamamen durmasına neden olmuş ve böylece OCR minimum seviyeye geri dönmüştür(Şekil 2D).
Şekil 1: Fare kemik iliğinden Lineageneg negSca1+c-Kit+ (LSK) hematopoetik kök progenitor hücrelerinin izolasyon gösteren şema. Kemik iliği kemiklerden çıkarılır ve mononükleer hücreler (MNC) yoğunluk gradyan orta degrade ayırma yoluyla izole edilir. Daha sonra hücreler, manyetik ayırmalarını takiben soy negatifi (Lin-) hücrelere biyotinylated Lineage+ antikorlar ve streptavidin konjuge manyetik boncuklarla kuluçkaya yatırılır. Lin- hücreler daha sonra LSK antikorları ve lsk hücreleri hücre sıralama ile izole ile kuluçkaya yatırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murine LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) hematopoetik kök progenitor hücrelerinin hücre dışı akı analizleri. (A,B) Glikoliz ve mitokondriyal solunum sırasında hücre dışı akı analizleri için kullanılan ilaçların mekanistik tanımı. (C) Medyada glukoz/pirüuvat bulunmaması durumunda murine LSK HSPC'lerde glikoliz stres testinin temsili sonuçları. (D) Murine LSK HSPCs üzerinde mitokondriyal stres testinin temsili sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Stok | Son konsantrasyon | 30 mL için hacim | |
| Tam ortam | 28.691 mL | ||
| P/S | 100x | 0.5x | 150 μL |
| L-Glutamin | 200 mM | 2 mM | 300 μL |
| Piruvat | 100mm | 1 mM | 300 μL |
| Glikoz | 1 M/180.2 mg/mL | 3 mg/mL | 499.4 μL |
| Tpo | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
| Scf | 100 μg/mL | 100 ng/mL | 30 μL |
Tablo 1: Tüm XF ortamının içeriği ve hazırlanması.
| Bazal | Oligomisin (2 μM) | FCCP (1,5 μM) | R/A (0,5 μM) | |
| Tekrarlama | 3 kez | 3 kez | 3 kez | 3 kez |
| Karışımı | 3 dk | 3 dk | 3 dk | 3 dk |
| Bekle | 0 dk | 0 dk | 0 dk | 0 dk |
| Ölçü | 4 dk | 4 dk | 4 dk | 4 dk |
Tablo 2: Mitokondriyal stres testi için enjeksiyon protokolü.
| Bazal | Glikoz (10 mM) | Oligomisin (2 μM) | 2-DG (50 mM) | |
| Tekrarlama | 3 kez | 3 kez | 3 kez | 3 kez |
| Karışımı | 3 dk | 3 dk | 3 dk | 3 dk |
| Bekle | 0 dk | 0 dk | 0 dk | 0 dk |
| Ölçü | 7 dk | 7 dk | 7 dk | 7 dk |
Tablo 3: Glikoliz stres testi için enjeksiyon protokolü.
| Bağlantı noktası | Uyuşturucu | Son kuyu konsantrasyonu (μM) | Stok çözeltisi hacmi (3L) | Ortam hacmi (3L) | Bağlantı noktası çözeltisi (3M) | Bağlantı noktasına eklenen hacim (3L) |
| Bağlantı Noktası A | Oligomisin | 2 | 100 | 181.25 | 16 | 25 |
| Bağlantı Noktası B | FCCP | 1.5 | 100 | 270.4 | 13.5 | 25 |
| Bağlantı Noktası C | Rotenone/antimisin A | 0.5 | 60 | 240 | 5 | 25 |
Tablo 4: Analizörün her kuyuda mitokondriyal stres testi için optimum ilaç konsantrasyonu elde etmek için seyreltme ölçümleri.
| Bağlantı noktası | Uyuşturucu | Son iyi konsantrasyon | Stok çözeltisi hacmi (3L) | Ortam hacmi (3L) | Bağlantı noktası çözümü | Bağlantı noktasına eklenen hacim (3L) |
| Bağlantı Noktası A | Glikoz | 10 mM | 300 | 75 | 80 mM | 25 |
| Bağlantı Noktası B | Oligomisin | 2 μM | 108 | 192 | 18 μM | 25 |
| Bağlantı Noktası C | 2-DG | 50 mM | 300 | 0 | 500 mM | 25 |
Tablo 5: Analizörün her kuyuda glikoliz stres testi için optimum ilaç konsantrasyonu elde etmek için seyreltme ölçümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, maksimum miktarda saf ve uygun murine LSK HSPC popülasyonunun izolasyonunu ve glikoliz ve mitokondriyal solunumölçümlerini hücre dışı akı analizörü ile gösteriyoruz. Özellikle, protokol LSK HSPCs kullanımı için aşağıdaki teknik sorunları aşar : i) mürin kemik iliği LSK HSPCs düşük frekanslı14, ii) LSK HSPCs düşük bazal metabolik aktivite26, iii) LSK HSPCs27kırılganlığı , ve iv) LSK HSPCs eksikliği1kültür . Buna ek olarak, ekstrasellüler akı tahlillerinin optimum performansı için ilaç konsantrasyonlarını ve ortam kompozisyonunu optimize ettik.
Kemik iliği kaynaklı HSPCs hipoksik niş ikamet ve bir glikolitik fenotip görüntülemek, onların kök bakımı için çok önemlidir28. Tersine, solunum HSPC farklılaşma için gereklidir6. HSPCs metabolik disfonksiyonu kan hastalıklarına yol açar gibi; Burada, ocr ve ECAR gibi metabolik fonksiyonların özelliklerini ölçmek için rom kemik iliği türetilmiş LSK HSPCs için protokol ve video tabanlı öğreticiler tarif ettik.
Yapışık hücreler için üretici önerilerinin aksine, lsk HSPC'lerde glikoliz stres testi sonuçlarının, hücreler glikoz/pirüuvat+ ortamlarda glikoz/pirüuvat- ortama kıyasla kültürlendiğinde optimum olduğunu bulduk. LSK HSPC'ler için medyada glikoz eksikliğinin, CO 2 olmayan bir kuluçka makinesinde ~2 saat equilibr süresi boyunca hücre ölümüyle sonuçladığını fark ettik. Glukoz enjeksiyonu, glukoz/pirüuvat+ ortamda kültürlenen LSK HSPC'ler için ECAR bazal düzeyini değiştirmediği için, protokol bizim değişiklik sadece glikolitik stres testinin özünü korur, ama aynı zamanda bize bazal glikoliz (herhangi bir enjeksiyon önce), glikolitik kapasite (oligomisin enjeksiyonu sonrası) ve non-glikolitik asitleştirme (2-DG ile enjeksiyondan sonra) LSK HSPCs ayırt sağlar.
LSK HSPCs bizim mitokondriyal stres testi LSK HSPCs oksidatif fosforilasyon tarafından üretilen ATP oligomisin enjeksiyonu sonrası OCR küçük azalma ile görüldüğü gibi minimal olduğunu gösterdi. Tersine, FCCP enjeksiyonu üzerine OCR yükseklik LSK HSPCs yüksek enerji talebine yanıt edebiliyoruz onaylar.
Bu protokolün amacı birlikte, HSP'lerin OCR ve ECAR gibi metabolik işlevlerinin nasıl ölçüleceklerine ilişkin video tabanlı öğreticilere eşlik edecek bir dizi açık ve kısa talimat vermekti. Önemli değişiklikler ve sağlıklı LSK HSPCs daha yüksek sayıda hasat için ek öneriler ile, onları kuyuyüzeyine yapışır hale, yanı sıra kuluçka süresi ve ilaç konsantrasyonu optimizasyonu, bu protokol güçlendirecektir araştırmacılar kan gelişimi ve hastalıklar sırasında glikoliz ve HSPCs yanı sıra non-yapışık hematopoetik hücrelerin glikoliz ve mitokondriyal solunum durumunu analiz etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL131645, CA016058), St. Baldrick Vakfı ve Pelotonia Vakfı'nın finansman desteği ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B.
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
