Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.
Abstract
הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות יכול לשמש כמודל לחקר התנהגות הימנעות מבעלי חיים. פרוטוקול זה מציג את התפקוד של נקודת האור כדי לחקור התנהגות של פוטוטקטיקה של זחל. הערכה הניסיונית כוללת שני חלקים עיקריים: מערכת גירוי חזותית היוצרת את נקודת האור, ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום הרושמת את תהליך ההימנעות מאור הזחל. הדבר מאפשר מעקב אחר אופן הפעולה של הזחל לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר עזיבת נקודת האור. פרטים על תנועת הזחל כולל האטה, הפסקה, הליהוק הראש, והפעלה ניתן ללכוד ולנתח באמצעות שיטה זו.
Introduction
הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות היה תחת חקירה, במיוחד בעבר 50 שנים1,2,3,4,5,6,7 ,8. בשנים האחרונות, למרות העובדה 1) נוירונים רבים מדיה הימנעות הזחל אור זוהו4,5,9,10,11,12 ו -2) החיבור המלא של מערכת הזחל ויזואלית ברזולוציה של הסינפסות הוקמה13, המנגנונים העצביים המשמשים את מוניות הזחל לא ברורים במידה רבה.
מספר התנהגות התנהגותית. שימשו ללימוד מוניות זחל הם יכולים להיות מחולקים במידה רבה לשני כיתות: אחד מעורב מעברי אור מרחבי המרחב והשני מעורבים מעברי אור זמני. עבור אור מרחבי מעבר הדרגתי, הזירה מחולקת למספר שווה של סעיפים באור ובחושך. הזירה ניתן לחלק לחצאים אור כהה2,4 או אור וכהה הרביעים14,15, או אפילו יכול להיות מופרד לאור חלופי ריבועים כהים כמו על לוח שחמט7. בדרך כלל, לוחות אגר משמשים לצורך במילוי מרחבי אור מרחבית, אבל צינורות המחולקים לאור חלופי ומקטעים אפלים יכולים לשמש גם10,14.
בגרסה ישנה יותר של הספר, תאורה אור מקורו בדרך כלל מתחת לזחלים. עם זאת, התאורה בגרסאות חדשות מקורו במידה רבה מלמעלה, מאז עיני הזחל (למשל, איברי הבולפאה הרגישים נמוך או בינוני בעוצמות האור16) כלולים בשלד cephalopharyngeal אטום עם פתחים לעבר חזית העליונה. זה הופך את הזחלים רגישים יותר לאור מכיוונים הקדמי העליון מאשר מתחת מאחורי הכיוונים7. עבור האור הזמני מעבר שאומר, עוצמת האור הוא אחיד ממדים בזירה, אבל האינטנסיביות שינויים לאורך זמן. בנוסף לאור מרובע הזמני גל (כלומר, מהבהב on/off או אור חזק/חלש3,7), אור שונים באופן זמני המתאים לשיפוע ליניארי בעוצמה משמש גם8 כדי למדוד את הרגישות של הזחלים שינוי זמני של גירוי באור.
סוג שלישי של שיטת הפוטומוניות הוא הניווט האור scape הכיוון, אשר מערבת תאורה מלמעלה בזווית של 45 °7. לפני העבודה של קיין ואח '7, רק פרמטרים גסים כגון מספר הזחלים באזורים האור והחשוך, תדירות המפנה, ואורך השבילים חושבו בזחל פוטומוניות assays. מאז עבודתה של אותה קבוצה, עם ניתוח של רקורד וידאו ברזולוציה גבוהה לזחל מוניות, דינמיקה מפורטת של תנועת זחל במהלך פוטומוניות (כלומר, מהירויות מיידיות של חלקים שונים של הזחל, כיוון הכותרת, מפנה זווית מהירות זוויתי המקביל) נותחו7. לפיכך, ניתן היה לגלות פרטים נוספים על התנהגות הזחל פוטופוטונית. באותם מספר, הזחלים נבדקים בקבוצות, כך שהשפעות הקבוצה לא ייכללו.
פרוטוקול זה מציג שיטת ספוט קלה לחקירת תגובות של זחל התנהגותי לגירוי קל בודדים. הערכה הניסיונית העיקרית מורכבת ממערכת גירוי חזותית ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום. במערכת הגירוי החזותי, מקור אור LED יוצר נקודת אור בקוטר 2 ס מ עגול על צלחת אגר, שם נבדק הזחל. ניתן לכוונן את עוצמת האור באמצעות מנהל התקן LED. מערכת ההדמיה כוללת מצלמת אינפרא אדום הלוכד את אופן הפעולה של הזחל בנוסף 3 850 הנוריות האינפרא-אדומות ננומטר לספק תאורה עבור המצלמה. העדשה של המצלמה מכוסה על ידי מסנן לעבור פס nm 850 ננומטר כדי לחסום את האור ממערכת גירוי חזותי מלהיכנס למצלמה, בעוד אור אינפרא אדום מותר להיכנס למצלמה. לפיכך, נמנעת הפרעה של גירוי חזותי בהדמיה. במסגרת זו, הפרטים ההתנהגותית של התגובות המהירות של הזחלים הבודדים בתקופה כולל לפני, במהלך, ולאחר הזנת האור מוקלטים ומנתחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הזחלים מדרוזופילה
- הכנת בינונית סטנדרטית המורכבת קמח תירס מבושל (73 g), אגר (5.6 g), ארוחה סויה (10 גרם), שמרים (17.3 g), סירופ (76 mL) ומים (1000 mL).
- מרימים את כל הזבובים ב-25 ° c על מדיום רגיל בחדר עם מחזור אור/12 h 12 שעות.
2. הכנת צלחות אגר
- להכין 1.0% הפתרון אגר. שוקלים 3 גרם של אגר בגביע 500 mL עם איזון, ואז להוסיף 300 mL של מים מזוקקים. מניחים נייר רדיד על המפסק כדי למנוע את המים מן התאדות. מחממים את הגביע במיקרוגל לרתיחה.
- קחו את הגביע ומערבבים היטב עם מוט זכוכית, ולאחר מכן החום במיקרוגל כדי לרתוח. חזור על הפעולה עד שהנוזל יהיה שקוף לחלוטין ונוזל.
הערה: הפתרון הסופי אגר חם צריך להיות חופשי של בועות אוויר; אחרת, שפיכת אגר לתוך הצלחת יגרום משטח אחיד ומחוספס של הצלחת אגר, אשר ישפיע על בדיקה נוספת התנהגות זחל. הריכוז של הפתרון אגר לא צריך להיות גבוה מדי או נמוך. אם הריכוז גבוה מדי, השתקפות האור מפוזר על הצלחת אגר יהיה חזק להכפיש את הגבול אור/כהה. , אם הריכוז נמוך מדי. הזחלים ישאירו עקבות על הצלחת שתי שגיאות אלה להפריע עיבוד וידאו מאוחר יותר protcol. - לאט לשפוך את הפתרון אגר חם לתוך צלחת פטרי (קוטר 15 ס מ) עד התחתון הוא מכוסה באופן שווה עם שכבה של אגר (~ 4 מ"מ עובי), קריר בטמפרטורת החדר (RT) עד הפתרון אגר מתחזק.
- לוחית אגר יש להשתמש כאשר הוא טרי מוכן. אם לא, יוצקים שכבה של מים על פני השטח ולאחסן אותו במקרר ב -4 ° c לשימוש מאוחר יותר.
3. הגדרת מערכת גירוי חזותי
- בחר את מקור אור ה-LED: נורית כחולה LED בשעה 470 ננומטר או אור לבן חם.
הערה: ניתן להחליף את מקור האור באור LED של כל אורך גל אחר. בניסוי זה, נורית כחולה משמשת כדוגמה. - מגלגלים פיסת נייר עבה ברדיד אלומיניום או קרטון שחור (להבטיח אטימות) כדי ליצור גליל פתוח של 12 ס מ אורך עם קוטר דומה לזה של נורית כחול LED עם קוטר של 3 ס"מ. הנח לקצה העליון של הצילינדר לכסות את הקצה הקדמי של נורית ה-LED הכחולה. לכסות את הקצה התחתון עם קרטון שחור עם חור עגול קטן (0.5 ס"מ קוטר) במרכז. זה מהווה את הגדרת מערכת מקור אור.
- תקן את מקור האור המוכן על מסגרת המגהץ באמצעות קליפ, וודא שתאורת ה-LED מוקרנת לכיוון שולחן העבודה. להטות את הצילינדר מעט. הזווית בין מישור הצילינדר למישור האנכי היא בערך 10 ° (ראה איור 1). חבר את האור הכחול 470 ננומטר לתקע "LED1" של מנהל ההתקן של נורית ההפעלה הגבוהה. הפעל את מנהל ההתקן, סובב את הידית בפינה הימנית העליונה של מנהל ההתקן כדי לבחור בערוץ 470 nmולאחר מכן לחץ על LED. לאחר מכן, כאשר המסך מציג "√", יופיע כתם אור כחול על שולחן העבודה.
הערה: אם הגליל דולף אור בנוסף לחור העגול הקטן, מומלץ להשתמש בקלטת שחורה על החלקים הדולפת כדי לוודא שרק החור יכול להעביר אור דרך. - לחץ על אישור וסובב את הידית כדי לכוונן את עוצמת האור. סובב את הכפתור לעוצמת אור גבוהה יותר של 50 mA. למדוד ולהקליט את הספקטרום של האור עם ספקטרומטר.
- הזז את מיקום מקור האור למעלה ולמטה כדי לכוונן את קוטר הנקודה הקלה ל-2 ס מ. שולחן העבודה צריך להיות שחור לאפקט ניגודיות טוב יותר.
- סובב את הכפתור כדי לבחור את עוצמת האור בהתאם לצרכים הניסיוניים. השתמש במסוף עם מד מתח קומפקטי עם חיישן כוח פוטודיודה סטנדרטי כדי למדוד את כוח האור המקסימלי והמינימלי במקום, להקליט אותו, למדוד שלוש פעמים, ולקחת את הערך הממוצע.
הערה: מומלץ להשתמש בחיישן הכוח פוטודיודה כדי למדוד את עוצמת האור לאור של אורך גל ספציפי ולהשתמש בחיישן כוח תרמי כדי למדוד את עוצמת האור לאור לבן. - לחשב את עוצמת האור במקום האור על ידי חלוקת כוח האור נמדד על ידי אזור החיישן.
הערה: לדוגמה, אם כוח האור נמדד בשלב 2.6 הוא 20 pW והאזור של החיישן הוא 0.81 mm2, עוצמת האור היא 24.69 pw/mm2 (חילוק 20 pw על ידי 0.81 mm2).
4. הגדרת מערכת ההדמיה
- הצמד מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה עם סרטון ברזל, בערך 10 ס מ מעל לנקודת האור בשולחן העבודה (איור 1).
- כוונן את כיוון עדשת המצלמה לעבר שולחן העבודה. חבר את המצלמה למחשב באמצעות ממשק USB.
- מניחים צלחת אגר על שולחן העבודה ממש מתחת למצלמה.
- פתח את התוכנה "Amcap 9.22" במחשב עם Windows 7, ואת נקודת האור יוצג באופן אוטומטי בחלון של AMcap. הזז את המצלמה מעט שמאלה או ימינה כדי לוודא שנקודת האור נמצאת ליד מרכז החלון. ודא שהמצלמה אינה חוסמת את נתיב האור. הכתם האור צריך להיות שלם ועגול.
הערה: ניתן למצוא את התוכנה ב-http://amcap.en.softonic.com/. - תקן 850 ננומטר ± 3 להקה ננומטר לעבור מסנן עם קליפ ב 5-7 מ"מ ממש מתחת למצלמה.
הערה: קוטרו של המסנן הוא כ-2.5 ס מ, ועדשת המצלמה קטנה מ-1 ס מ בקוטר, כך שהמסנן יכול לכסות את השדה החזותי של המצלמה. עם המסנן שמתחת למצלמה, אין לראות את נקודת האור בחלון AMcap. - מקום שלוש נוריות אינפרא-אדום המייצרת (מרכזי גל = 850 ננומטר) באופן שווה סביב לוחית אגר. כל LED צריך להיות במרחק של 5 ס מ מהקצה של הצלחת אגר, ואת הפנים העדשה של LED צריך להיות בזווית כלפי מטה 70 ° לכיוון הצלחת אגר. חבר את הנוריות לחשמל באמצעות ממיר AC-to-DC.
הערה: עדיף לתקן את המיקומים ואת הזוויות של נוריות האור אינפרא אדום כדי להבטיח עקביות של בהירות השדה בניסויים ניסיוני שונים ולהקל על עיבוד וידאו מאוחר יותר. - שים לוח שחור בין המחשב וההתקן. הגדר את הבהירות של מסך המחשב כדי למנוע מנורית מסך המחשב להשפיע על הניסוי.
הערה: שמור על הסביבה כהה כאשר מדידת אורך הגל או עוצמת האור.
5. קביעת פרמטרים של הדמיה
- בתפריט של תוכנת AMcap, בחרו ' אפשרויות ' | וידאו התקן | תבנית לכידה, ולהגדיר את גודל הפיקסל של וידאו שנתפסו כדי 800 x 600 ואת קצב המסגרות ל 60 fps.
- הסר את המסנן מתחת למצלמה, מקם סרגל מתחת למצלמה והתאם את מוקד המצלמה כדי להפוך את קו השינוי לבהיר ומקביל לרוחב של שדה הווידאו של התצוגה.
- לחץ על לכידת | התקין | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה, לחץ על התחל הקלטה, להקליט את המרחק בפועל המתאים ל 600 פיקסלים, ולחשב את היחס של כל פיקסל למרחק בפועל.
6. הקלטת וידאו של הימנעות מאור התנהגות
- שמרו על טמפרטורה של 25.5 ° c דרך כל הניסויים. בקרת טמפרטורת חדר עם מזגן אם נדרש. שמרו על הלחות כל הזמן ב 60% עם מכשיר לחות.
- צלם וידאו קצר של מיקום נקודת האור בשם "lightarea1". לאחר מכן, להעביר את 850 ננומטר ± 3 ננומטר מסנן בחזרה כדי לכסות את עדשת המצלמה.
הערה: בעת הקלטת התנהגות זחל, עדשת המצלמה מכוסה על-ידי 850 nm ± 3 ננומטר מסנן, כך שנקודת האור אינה מוצגת בסרטון. ניתן לחזור לנקודת האור בקטעי וידאו עם זחלים מאוחר יותר עם Matlab. אין לשנות את מיקום המצלמה, ולהימנע משינוי היחס של כל אחד מהפיקסלים למרחק הממשי הנמדד בשלב 4.3. - הדליקו אור (כלומר, אור בחדר) הרחק מהמכשיר הנסיוני. הפוך את האור לנמוך ככל האפשר, כל עוד הזחלים יכולים להיראות בבהירות עם העיניים. קחו את הזחלים מתוך מדיום התרבות עם כפית, בעדינות לבחור זחל שלישי, ולשטוף אותו נקי עם מים מזוקקים. היזהרו לשטוף זחל אחד בכל פעם כדי למנוע הפרעות מרעב. ניסוי בודד דורש. לפחות 20 זחלים
- להעביר את הזחל למרכז לוחית אגר ממוקם מתחת למצלמה במהלך שלב 3.3. להסיר בעדינות את המים העודפים מן הזחל עם מברשת או להשתמש בנייר כתמים כדי להסיר את המים מן הזחל כדי למנוע השתקפות של אור מתחת לעדשה. כבו את אור החדר והניחו לזחל להאקלים במשך 2 דקות בסביבה האפלה.
- הפעל את אור ה-LED כדי ליצור אור אינפרא-אדום, ומברשת בעדינות את הזחל למרכז הלוחית. כאשר הזחל מתחיל לזחול ישר, לסובב את הצלחת כדי להפוך את הזחל הראש לכיוון הנקודה האור. ודא שהוא זוחל היישר מההתחלה, או שהוא אינו יכול לקבל גישה לנקודת האור.
- לחץ על לכידת | התקין | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה ולאחר מכן לחץ על התחל הקלטה להקלטה. אפשר לזחל לזחול לכיוון נקודת האור, להזין את נקודת האור ולאחר מכן להשאיר את נקודת האור עד שהוא כמעט מחוץ לשדה התצוגה. לחץ על הפסק הקלטה. אם הזחל מתרחק מנקודת האור לפני שהוא מתקרב, לחץ ישירות על הפסק הקלטה.
- הזז את המסנן הרחק מהמצלמה. קח וידאו קצר של המיקום של מקום האור הקרוי "lightarea2" והשווה אותו ל-"lightarea1" כדי להבטיח שמיקום נקודת האור לא ישתנה. אם שינוי מיקום ברור נצפה, למחוק את הנתונים.
7. ניתוח נתונים
- השתמש ב-SOS17 כדי לחלץ מתאר גוף בעלי חיים ופרמטרים תנועה מסרטי וידאו באמצעות שיטות עיבוד תמונה כמתואר בעבר17.
הערה: פרמטרים לרבות headSpeed (מהירות של ראש זחל), מהירות זנב (מהירות של זחל זנב), midSpeed (מהירות של זחל האמצע של קו השלד), ו cmSpeed (מהירות של זחל סנטאיד) שימשו למדידת מהירות התנועה זחל. פרמטרים כולל headTheta (הזווית בין הקווים של ראש האמצע והאמצע זנב) ו-Headtheta (המהירות המשתנה של headTheta) שימשו למדידת כיפוף גוף זחל ואת המהירות זוויתי של כיפוף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על פי הפרוטוקול, שימש השימוש בשיטת האור כדי לחקור את התנהגות ההתחמקות הקלה של הזחל השלישי שהועלו ב -25 ° c על המדיום הסטנדרטי בחדר עם מחזור אור/כהות של 12 שעות/12 שעות. אחד w1118 זחל נבדק באמצעות שיטת ספוט האור ב 25.5 ° c. עוצמת האור הממוצעת של מקום האור שנוצר על ידי LED nm 460 היה 0.59 μW/cm2. כל תהליך הזחל הנכנס והיציאה מהנקודה האור נרשם ונותח באמצעות תוכנות SOS וסקריפטים כתובים מותאמים אישית12,17. עקומות זמן של מהירות זנב, הגוף זווית כיפוף, ומהירות זוויתית של כיפוף הגוף של זחל נציג מוצגים באיור 2 וסרט 1.
כדי לחקור את ההשפעות של הנוירונים אוקטואמנרגיים על הימנעות אור הזחל, הזחלים השלישי הרימות עם הנוירונים הניראמיכולינרגיות מעוכבים על ידי ביטוי הרעלן טטנוס (Uas-TNTG) עם מנהל התקן Tdc2-Gal4 נבדקו עם שיטת ספוט אור. כפי שמוצג באיור 3, הגודל של ראש זחל הגבס (זווית כיפוף הגוף המקסימלי) הופחת באופן משמעותי לעומת בקרת ההורים, המציינת כי Tdc2-Gal4 נוירונים הם הכרחיים עבור תגובה רגילה הזחל האור.
איור 1: הגדרת ניסיוני. (א) ייצוג סכמטי של הגדרת האור המבוסס על מהירות הזחל מהירה של מוניות הצילום. הקווים הכחולים מייצגים את נתיבי האור הגלוי המשמשים כגירוי חזותי, והקווים האדומים מייצגים את נתיבי האור האינפרא-אדום. חיצים מציינים את כיוון האור. מסנן הלהקה ה850 nm מאפשר לאור אינפרא-אדום לעבור, אך הוא חוסם את האור הנראה. (ב) תמונה של הגדרת הסדר של נקודת האור. יצוין כי התמונה צולמה בתנאים קלים להדמיה טובה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תיאור כמותי של תגובת הזחל בעת הכניסה לנקודת אור. (א) דיאגרמה המציגה את הפרמטרים המשמשים למדידת תנועת גוף הזחל. קו המתאר של זחל מוצג בקו דק. הקו העבה מראה את השלד. של מתאר גוף הזחל שני הקצוות ונקודת הקצה של קו השלד מוקצים כעמדות של זחל ראש, נקודת אמצע וזנב. הזווית בין הקו מהראש לאמצע ואת הקו מנקודת האמצע לזנב הוא זווית כיפוף הגוף. המהירות של שינוי של הגוף כיפוף זווית לאורך זמן מוגדר מהירות זוויתית של זחל ראש הגבס. מיוצגת כאן מהירות זנב (B, מהירות זנב), ראש יצוק מהירות זוויתית (C, headomega), ואת זווית כיפוף הגוף (D, headomega) של w1118 הזחל שנכנס ומשאיר נקודת אור. קווים ירוקים מסמנים את נקודת הזמן שראש הזחל נכנס והשאיר את הנקודה הקלה. חלון הזמן של תקופת האטה חזקה הוא בצהוב. ראשי חץ מצביעים על תקופות האטה ופסגות קשורות בראש הטלת מהירות זוויתי וזווית כיפוף הגוף. תהליך ההתנהגות מוצג בסרט 1. דמות זו השתנתה מגונג ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מעכב Tdc2-Gal4 שכותרתו נוירונים באמצעות רעלן טטנוס TNTG מפחית את הגודל של זחל ראש יצוקה בתגובה לכניסת ספוט אור. * *, P < 0.01, n = 81, 52, 92; מבחן קרוקל-ווליס ואחריו נעשה שימוש בבדיקת ההשוואה הכפולה של דאן. דמות זו השתנתה מגונג ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: A w1118 הזחל נכנס ומשאיר מקום אור בתוך שיטת ספוט האור. נקודת אור עם קצוות מוחלקים הוא לבן. . מסלול הזחל מוצג העקומות המתאימות של מהירות הזחל, ראש המטה ואומגה משחקים בו זמנית. הסרט הזה שונה מגונג ואח '12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציג את הגישה לנקודת האור כדי לבחון את היכולת של הזחלים של דרוזוהילה לברוח מהאור. היכולת הזאת מאפשרת מעקב אחר התנהגות הזחלים לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר השארת נקודת אור. פרטים על תנועת זחל ניתן ללכוד ולנתח. הכדאיות של נקודת האור היא פשוטה מאוד ובעלת יכולת מעשית חזקה. העלות של ההתקן כולו אינה גבוהה. בניסוי, אור LED משמש כמקור האור. ניתן להחליפו במקורות אור באורכי גל שונים, במידת הצורך. את עוצמת האור ניתן גם לכוונן על ידי כונן LED. עוצמת האור הנמוכה ביותר במקום יכולה להגיע ל-1.80 pW/mm2 (אור לבן קר). אפילו בעוצמת אור כה נמוכה, הזחלים עדיין יכולים לחוש את האור ולהראות התנהגויות אור-הימנעות11.
יצוין כי ריכוז צלחת אגר נשלטת בין 0.8% ו 1.0%. אם הריכוז גבוה מדי, פיזור של אור על הצלחת אגר יכול להיות רציני, ובגודל של כתם אור המזוהה הווידאו הוא מוגזם. לכן, הבהירות של המקום לא צריכה להיות גבוהה מדי. מאחר והזחלים בנקודת אור אינם גלויים לעין, אם האור הנראה משמש לתאורה, יש צורך להשתמש באור אינפרא-אדום כדי להאיר את הזחל ולהוסיף מסנן להעברת פס של 850 ננומטר על המצלמה כדי למנוע מאותות התאורה להיכנס למצלמה. וידאו של תגובת זחל לנקודות אור יכול להיות מסונתז מאוחר יותר בהתבסס על קטעי וידאו הזחל בלבד וברק ספוט.
שיטת האור בעלת שלוש מידות עיקריות: 1) התהליך של המנעות מאור הזחל יכול להיות מפוקח ומנותח בפרוטרוט; 2) תגובת אור הזחל נבדק רק פעם אחת, כך שניתן יהיה להוציא את המעורבות האפשרית של הסתגלות אור; ו-3) השפעות אפשריות על תגובת האור מפני זחלים אחרים ניתן לכלול. חיסרון ברור אחד של הסדר הזה הוא שזוהי תפוקה נמוכה, שכן רק זחל אחד נבדק בכל פעם. למרות שניתן להשתמש באותה שיטת פעולה זו בעיקר בעוצמות נמוכות של אור11,12, היא יכולה גם לחול על הימנעות מהזחל באור חזק שיכול להלהיב את הנוירונים בכיתה IV האריח את פני השטח של קירות הגוף16.
המכשיר הניסיוני שלנו יכול לשמש גם אלקטרואופטיקה. מסנן הלהקה ה850 ננומטר יכול לחסום את אור העירור, כפי שהוא עושה לאות הספוט האור, כך שהמצלמה יכולה להקליט התנהגויות זחל לפני, במהלך, ואחרי גירוי אור אדום באופן ברור. באופן ספציפי, כאשר 620 ננומטר אור אדום משמש בשילוב עם Chrimson עבור הגירוי אלקטרואופטיקה, החצאים הנמוכים של נוריות האור אינפרא אדום צריך להיות רעולי פנים, ואת הכיוון של אור אדום צריך להיות מבוקרת היטב כדי לצלם את הזחלים בבהירות. בינתיים, רמות בינונית של אותות רועשים שמקורם אור אדום בתמונה יכול לשמש כדי לשפוט את העיתוי של גירוי/כיבוי. בקיצור, מאפיין נקודת האור מספק שיטת הוספה לניטור וניתוח של תכונות מרחבית וזמני מפורטות של התנהגות הימנעות מהירה מאור הזחל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הטבעי של סין (31671074) וקרנות מחקר היסוד עבור האוניברסיטאות הפרובינציאלי ג'ה-ג'יאנג (2019XZZX003-12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED | Thorlabs, USA | PM100A | Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V |
| AC to DC converter | Thorlabs, USA | S120VC | Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm) |
| band-pass filter | Thorlabs, USA | DC2100 | LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary |
| Collimated LED blue light | ELP, China | USBFHD01M | Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710 |
| Compact power meter console | Ocean Optics, USA | USB2000+(RAD) | Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber |
| High-Power LED Driver | Minhongshi, China | MHS-48XY | Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm |
| high-resolution web camera | Thorlabs, USA | MWWHL4 | Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group |
| LED Warm White | Mega-9, China | BP850/22K | Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm |
| Spectrometer | Noel Danjou | Amcap9.22 | AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards. |
| Standard photodiode power sensor | Super Dragon, China | YGY-122000 | Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | M470L3-C1 | Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group |
| Thermal power sensor | Thorlabs, USA | S401C | Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5% |
References
- Grossfield, J. Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669 (1971).
- Godoy-Herrera, R. C. L. D. The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation. Animal Behaviour. 37, (1989).
- Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions. Journal of Neuroscience. 19, 3337 (1999).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. Journal of Neuroscience. 31, 6527 (2011).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends in Neurosciences. 35, (2012).
- Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868 (2013).
- Humberg, T. H., et al. Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues. Nature Communications. 9. 1260, (2018).
- Gong, Z., et al. Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference. Science. 330, (2010).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341, 1113 (2013).
- Zhao, W., et al. A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference. Nature Communications. 10, (2019).
- Gong, C., et al. A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance. Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).
- Larderet, I., et al. Organization of the Drosophila larval visual circuit. eLife. 6, (2017).
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. Journal of Neurogenetics. 10, (1995).
- Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237 (2013).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921 (2010).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, e41642 (2012).
