Summary
Dette manuskript beskriver en isfri kryopreserverings metode for store mængder rotte hepatocytter, hvor primære celler er præ-inkuberet med kryoprotective midler i en lav koncentration og vitrificeret i store dråber.
Abstract
Forvitrifikation er et lovende isfrit alternativ til klassisk langsom frysning (ved ca. 1 °C/min) Kryopreservation af biologiske prøver. Forvitrifikation kræver ekstremt hurtige afkølingshastigheder for at opnå overgang af vand til glas fasen, samtidig med at skadelig isdannelse undgås. Selvom præ-inkubation med kryoprotective-midler (CPA) kan reducere den kritiske afkølingshastighed for biologiske prøver, er der generelt behov for høje koncentrationer for at muliggøre iskold kryopræservering ved vitrifikation. Som følge heraf hæmmes vitrifikation af CPA toksicitet og begrænset til små prøver, der kan afkøles hurtigt. Det blev for nylig påvist, at disse iboende begrænsninger kan overvindes ved bulk dråbe forvitrifikation. Ved hjælp af denne nye metode, celler er først præ-inkuberet med en lav intracellulær CPA koncentration. Ved at udnytte hurtig osmotisk dehydrering er den intracellulære CPA koncentreret direkte forud for forvitringen, uden at det er nødvendigt fuldt ud at ækvibrere toksiske CPA-koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed og integreret med kontinuerlig høj gennemløb generation af store størrelser dråber, der er vitrificeret i flydende nitrogen. Denne isfri kryopreserverings metode med minimal CPA-toksicitet er velegnet til store celle mængder og resulterer i øget hepatocyt levedygtighed og metabolisk funktion i forhold til klassisk langsom frysning Kryopreservation. Dette manuskript beskriver metoderne til vellykket bulk-dråbe vitrifikation i detaljer.
Introduction
Tab af cellelevedygtighed og metabolisk funktion efter Kryopreservation af hepatocytter er stadig et stort problem, der begrænser kliniske anvendelser1,2,3. Benchmarkmetoden for hepatocyt kryopræservering er langsom frysning, som udføres ved præ-inkupering af hepatocytter med CPA (dimethylsulfoxid [DMSO], glucose og albumin) og efterfølgende kontrollerede sats frysning (ved ca. 1 °c/min) til kryogene temperaturer4,5. Trods mange rapporterede optimeringer, er CPA toksicitet sammen med skadelige osmotiske ubalancer under frysning og mekanisk belastning af isdannelse fortsat grundlæggende ulemper ved langsom frysning6,7.
Forvitrifikation giver en fordel i forhold til langsom frysning i, at skaden på grund af isdannelse er helt undgås ved en direkte fase overgang af vand i glasset tilstand6. For at nå glasovergangstemperaturen i rent vand (-137 °C) skal vandet dog afkøles med en hastighed på 1.000.000 grader Celsius pr. sekund (dvs. den kritiske afkølingshastighed) for at undgå isdannelse over glasovergangstemperaturen8 . Tilsætning af CPAs kan sænke den kritiske afkølingshastighed og øge glasovergangstemperaturen af vandige opløsninger9. Men selv med høje CPA-koncentrationer (f. eks. 40% v/v DMSO eller højere) kræves der ikke desto mindre hurtige afkølingshastigheder for at opnå en vellykket forvitrifikation på8,9.
De påkrævede afkølingshastigheder og høje CPA-koncentrationer resulterer i to store ulemper ved forvitrifikation. For det første skal prøverne have en lav termisk masse for at muliggøre hurtig afkøling. For det andet, for at nå høje CPA koncentrationer og samtidig undgå osmotisk skade, CPAs skal langsomt indføres og fuldt ud ligevægt mellem intra-og ekstracellulære rum6. Dette øger eksponeringstid af celler til giftige CPAs. Sammen, dette gør forglasning en besværlig proces, der er begrænset til et par små størrelser prøver (mikroliter) ad gangen. Droplet vitrifikation er blevet foreslået som en potentiel løsning på disse begrænsninger. Ved at udsætte de minimale celle belastede dråber (nanoliere) til flydende nitrogen øges afkølingshastigheden betydeligt, hvilket derfor giver mulighed for en betydelig reduktion af CPA-koncentrationen10,11,12 ,13,14. Selv om flere højfrekvente dråber-genererende dyser potentielt kan anvendes samtidigt, begrænser den ekstremt lille Dråbestørrelse dataoverførselshastigheden til mikroliter pr. minut10, hvilket udelukker effektiv forvitning af store celle volumener med størrelser højere forarbejdnings hastigheder på rækkefølgen af milliliter pr. minut.
For nylig blev det påvist, at disse iboende begrænsninger af forvitrifikation kan overvindes ved bulk dråbe vitrifikation15. Denne nye metode udnytter hurtig osmotisk dehydrering til at koncentrere en intracellulær CPA koncentration af 7,5% v/v ethylenglycol og DMSO umiddelbart før forvitrifikation, eliminere behovet for fuld ligevægt af toksiske CPA koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed ved en kort eksponering af hepatocytterne til en høj ekstracellulær CPA koncentration. Selv om denne eksponering forårsager hurtig osmotisk dehydrering, det er for kort til den høje CPA koncentration at diffus ind i cellerne. Umiddelbart efter dehydrering indlæses cellerne i dråber, der er direkte vitrificeret i flydende nitrogen. Denne metode eliminerer behovet for fuld intracellulær optagelse af høje CPA-koncentrationer, mens den høje ekstrellulære CPA-koncentration muliggør forvitrifikation af store små dråber, hvilket resulterer i høje gennemløb med minimal CPA-toksicitet.
Dråbe vitrifikation forbedrer direkte og langsigtet levedygtighed efter konservering, samt morfologi og metabolisk funktion af primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk Kryopreservation ved langsomt frysning15. Dette manuskript giver de metodologiske detaljer for bulk dråbe vitrifikation af primære rotte hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den primære hepatocyt isoleringer for denne protokol blev udført af cellen Resource Core (CRC) på Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA. Dyre protokollen (#2011N000111) blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Massachusetts General Hospital.
1. bulkdråbe forvitrifikation
- Klargør forvitrifikationsløsninger.
- Tilsæt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) til 17,0 ml af University of Wisconsin-opløsningen (UW) for at gøre forglasning løsning 1 (v1). Steril Filter v1-opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
Bemærk: UW er en almindeligt anvendt organ bevarings løsning. Den indeholder 50 g/L hydroxyethylstivelse, 35,83 g/L lactobionsyre, 3,4 g/L kaliumphosphat monobasic, 1,23 g/L magnesiumsulfat heptahydrat, 17,83 g/L raffinose pentahydrat, 1,34 g/L adenosin, 0,136 g/L allopurinol, 0,992 g/L total glutathion, 5,61 g /L kaliumhydroxid og natriumhydroxid til justering af pH til 7,4. - Kombiner 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml ethylenglycol (f. eks), 40 mg BSA og 5,48 g saccharose for at fremstille forglasning opløsning 2 (v2). Steril Filter v2-opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm-filter. 3,5 mL sterilfiltreret v2-opløsning indlæses i en 3 mL sprøjte og opbevares ved 4 °C.
Bemærk: for at gøre det lettere at opløse CPAs forberedes løsningerne i større mængder end krævet.
- Tilsæt 40 mg bovint serumalbumin (BSA) til 17,0 ml af University of Wisconsin-opløsningen (UW) for at gøre forglasning løsning 1 (v1). Steril Filter v1-opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
- Forbered hovedparten af dråbe vitrifikationapparatet.
- For at forberede blande nålen, først skæres langs den ene side af blande nålen ydre grå ærme, og derefter bøje ærmet åben for at fjerne det fra blande nålen.
- Skub 2 25 mm silikone slange sektioner over indløb af blande nålen og fastgør deres position med lim (figur 1A).
- Skær nålen til en længde på 20 mm (dvs. længden af den indvendige blande Helix) som vist i figur 1a.
Bemærk: blandings nålens længde er proportional med lydstyrken inde i nålen og kan derfor ændres til at styre eksponeringstid for hepatocytterne til den høje CPA-koncentrations opløsning. - Sæt den Afskærende stikkontakt af blande nålen i en 20 G kanyle (figur 1B).
Bemærk: injektionnål størrelse påvirker Dråbestørrelse. - Steriliser blandingen af kanyle ved autoklavering.
- Fyld en steril Dewar med flydende nitrogen. Steriliser yder uden for Dewar med isopropanol, før du placerer Dewar i en steril laminar flowcelle kultur hætte.
Bemærk: kontaminering er en vigtig overvejelse under direkte eksponering af dråberne til flydende nitrogen. Selv om der ikke var nogen kontaminering med ikke-steriliseret flydende nitrogen i den nuværende protokol, kan flydende nitrogen filtreres eller bestråles for at sikre sterilitet, hvis det er nødvendigt16. - Der indsættes en tragt med samme udvendige diameter som den indvendige diameter af det flydende kvælstof i et 50 ml konisk rør for at oprette dråbe opsamlings anordningen (figur 1C−E).
- Nedsænk dråbe opsamlings anordningen i det flydende nitrogen ved langsomt at trykke den ned i sin endelige lodrette position ved hjælp af store pincet. Sørg for, at det koniske rør hviler i en lodret position i bunden af Dewar (figur 1D−E).
Bemærk: tragten skal forblive indsat i og hvile på det koniske rør. Det flydende nitrogen niveau skal være 1 cm under Tragtens indløbs højde som vist i figur 1D. - Monter en sprøjtepumpe i en lodret position på væggen af cellekulturen hætte ved at binde en snor fra sprøjte pumpens fødder til skruer, der stikker ud fra cellekulturen emhætten.
- Placer den flydende kvælstof Dewar med dråbe opsamlings anordningen under den vertikalt monterede sprøjtepumpe (figur 1E).
- Pre-incubate med CPAs.
- Efter at have opnået frisk isoleret rotte hepatocytter, tælle bestanden koncentration af Trypan blå udelukkelse og tage 40.000.000 levedygtige hepatocytter.
Bemærk: blid håndtering af hepatocytter i suspension er afgørende for at forhindre celledød. - Centrifugeres ved 50 x g i 5 minutter uden bremse.
- Aspirér supernatanten, og genopsæt hepatocytterne i 3,4 mL v1-opløsning.
- Inkuber på is i 3 minutter.
- Tilsæt 150 μL DMSO og 150 μL af fx til hepatocytterne og bland forsigtigt.
- Inkuber på is i 3 minutter.
- Igen tilsættes 150 μL DMSO og 150 μL af fx til hepatocytterne og blandes forsigtigt.
- Læg 3,5 mL i en 3 mL sprøjte.
- Efter at have opnået frisk isoleret rotte hepatocytter, tælle bestanden koncentration af Trypan blå udelukkelse og tage 40.000.000 levedygtige hepatocytter.
- Udfør vitrifikation.
- Sæt sprøjten med præ-inkuberet hepatocytter og v2 injektionssprøjter på sprøjtepumpe adapteren.
- Fastgør to kvindelige luer lås slange Barb adaptere til sprøjterne og skub silikone slangen af blandingen nål montering over Barb fittings (figur 1F).
- Placer hele samlingen i sprøjtepumpen (figur 1E).
- Tre min efter den sidste tilsætning af DMSO og f. eks til hepatocytterne, starte pumpen på 2 mL/min.
- Stop pumpen, når alle hepatocytter er blevet tilsat til den flydende nitrogen.
2. kryogen opbevaring
- Der punkteres 10 små huller i låget på et 50 mL konisk rør med en 20 G nål og omslutter låget med en fleksibel film som vist i figur 1B. Dette skaber en ventil, der gør det muligt at undslippe fordampende rester af flydende nitrogen.
- For at indsamle de vitrificerede hepatocyt dråber, skal du først fjerne tragten fra den flydende kvælstof Dewar. Brug derefter lange pincet til at tage det koniske rør, der indeholder dråberne ud af det flydende nitrogen, og hæld langsomt det overskydende flydende kvælstof ud af det koniske rør.
- Luk det koniske rør med det punkterede låg og Placer direkte det lukkede koniske rør med vitrificerede hepatocyt dråber tilbage i den flydende kvælstof Dewar.
- Overfør det koniske rør fra det flydende nitrogen til en flydende nitrogen damp kryotank.
3. rewarming af de vitrificerede hepatocyt dråber
-
Forbered den rewarming løsning.
- 17,13 g saccharose opløses i 100 mL DMEM hepatocyt-kultur medier for at gøre det til en løsning. Steril Filter den rewarming opløsning ved hjælp af et 0,22 μm filter og varm til 37 °C.
-
Opvarmer hepatocytterne.
- Tag det koniske rør med forglasset hepatocytter fra cryotank og transportere det i en flydende kvælstof Dewar til cellekulturen Hood.
- Løsn hætten, og sæt det koniske rør tilbage i det flydende nitrogen.
- Tilsæt de vitrificerede hepatocyt dråber til et tomt bæger, tilsæt øjeblikkeligt den varme (37 °c) rewarming opløsning, og rør straks i 10 s.
Bemærk: det er vigtigt at arbejde hurtigt for at undgå frysning under rewarming. Afhængigt af undersøgelsens krav kan et par til alle forglasede dråber være rewarmed på én gang.
-
Aflæsse den rewarming opklaring.
- Del rewarming-opløsningen med hepatocytter over 2 50 mL koniske rør.
- De to koniske rør centrifugeres i 2 min ved 100 x g ved 4 °c uden bremse.
- Supernatanten aspirerer til at efterlade et samlet volumen på 12,5 mL ved hjælp af det koniske rørs afgangs mærke som reference og tilsæt 12,5 mL iskold DMEM pr. konisk rør for at fortynde den rewarende opløsning til 50%.
- Opstop hepatocytterne og Inkuber på is i 3 min.
- Tilsæt 25 mL iskold DMEM pr. konisk slange for at fortynde den rewarende opløsning til 25%.
- Centrifuge i 5 min ved 50 x g ved 4 °c uden bremse.
- Aspirér supernatanten, og Opsæt hepatocytterne i 2 mL af det ønskede dyrkningsmedium til brug.
Bemærk: tæthed gradient centrifugering kan bruges til at fjerne døde hepatocytter fra cellen suspension, hvis det ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyisolerede primære hepatocytter fra fem forskellige rotte lever blev anvendt til en direkte sammenligning af bulk-dråbe vitrificering til klassisk Kryopreservation ved hjælp af de fremtrædende Slow-frysning protokoller, der er rapporteret i litteraturen4, 5. kort sagt blev hepatocytterne suspenderet i UW suppleret med BSA (2,2 mg/ml), glucose (333 mm) og DMSO (10% v/v) og frosset ved hjælp af en kontrolleret hastighed fryser. Efter opbevaring ved-196 °C, blev prøverne optøet i et varmt vandbad. Efter al isen smeltede, blev DMSO direkte fortyndet, mens glukose koncentrationen gradvist blev sænket under flere trin for at reducere osmotisk skade. Den nøjagtige protokol kan findes i detaljer andetsteds15. Bevarings varigheder varierede fra 2 til 8 dage og blev matchet mellem bulkdråbe forvitrifikation og frysning Kryopreservation for hver biologisk replikat for at sikre lige sammenligning. Selv om kortere bevarings tider blev testet for praktiske overvejelser, skal det bemærkes, at primære hepatocytter kan opbevares ved-196 °C i årevis uden tab af levedygtighed5.
Bulk dråbe vitrifikation resulterer i en direkte efter bevaring hepatocytter levedygtighed på 79%, målt ved Trypan blå udelukkelse test, som bestemmer membran integritet (figur 2a). Dette er betydeligt højere end 68% levedygtighed efter klassisk optimeret Kryopreservation. Udbyttet af bulk dråbe vitrifikation er 56%, der er 10% højere, og vigtigere mere konsekvent, sammenlignet med klassiske Kryopreservation (figur 2B).
Den metaboliske aktivitet af hepatocytter, målt ved hjælp af en Presto blå metabolisering essay i langsigtede kollagen sandwich kulturer, var signifikant højere efter bulk dråbe vitrifikation end efter klassisk Kryopreservation. Albumin syntese, som er den mest udbredte parameter af syntetisk funktion af hepatocytter, var større med næsten to gange efter bulk dråbe vitrifikation i forhold til klassiske Kryopreservation (figur 3A). Urinstof produktion er den mest udbredte parameter af hepatocyt afgiftning funktion. Efter en uges kultur var urinstof produktionen af bulkdråbe vitrificerede hepatocytter signifikant højere end for klassiske kryopræserverede hepatocytter (figur 3B).
Sammenfattende forbedrer bulk dråbe vitrifikation direkte efter konservering levedygtighed og langsigtet metabolisk funktion af primære rotte hepatocytter i kollagen sandwich kulturer, sammenlignet med Kryopreservation ved langsom frysning.
Figur 1: bulk dråbe vitrifikation eksperimentel opsætning.
(A) illustration af, hvordan man forbereder blande nålen og fastgør to silikone slange sektioner til indløb af blande nålen. B) illustration af indsættelsen af den afskårne blandings nål i kanylen for at fuldføre blandings nålen. C) illustration af tragten og 50 ml konisk slange, der udgør dråbe opsamlings anordningen. D) skitse, der viser placeringen af det koniske rør, tragten og det flydende nitrogen niveau i Dewar. (E) repræsentation af den komplette eksperimentelle bulk dråbe forvitrifikation setup fra bund til top: den flydende kvælstof Dewar (grå); den dråbe samling enhed, der er placeret inde i flydende kvælstof Dewar (Clear); den blandings nål (Clear-Yellow), der er fastgjort til de sprøjter, som er anbragt i sprøjtepumpen (rød). (F) illustration af sprøjter og blande nåle samling. To 3 mL sprøjter klemmes ind i sprøjtepumpe adapteren (blå); en sprøjte skal fyldes med præ-inkuberet hepatocytter i v1-opløsning og den anden med den høje CPA-koncentrations opløsning (v2-opløsning). Blandingen nål montering er fastgjort til sprøjter af to kvindelige luer Lock slange Barb adaptere. G) illustration af, hvordan man opretter det koniske rørlåg til kryogen opbevaring, som gør det muligt at fordle det flydende kvælstof fra det koniske rør under opbevaringen af de forglasede hepatocyt dråber. Top: låg med punkterede huller. Nedenfor: den punkterede låg indpakket med fleksibel film. Skala stænger: 1 cm. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: levedygtighed for hepatocytter og udbytte efter konservering.
(A) levedygtigheden af frisk (grå), kryopræserverede (blå), og bulk dråbe forglasset (grøn) hepatocytter. B) konserverings udbytte af kryopreserved og bulkdråbe vitrificerede hepatocytter. Stjerner: p < 0,05 (Wilcoxon matchede-par signeret rang test). Whiskers: min til maks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: metabolisk aktivitet i langsigtede kollagen sandwich kulturer.
(A) albumin syntese af frisk (grå), kryopræserverede (blå), og bulk dråbe forglasset (grøn) hepatocytter på Kulturdage 3, 5 og 7. B) urinstof fremstilling af ferske, cryopreserved, og bulk dråbe forglasset hepatocytter. Stjerner: p < 0,05 (parret en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey korrektion for flere tests). Fejllinjer: standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryopreservation af hepatocytter ved langsom frysning resulterer i nedsat levedygtighed og metabolisk funktion. Vitrification tilbyder et lovende alternativ til klassisk Kryopreservation, da frostskader helt undgås9. Præinkubation med CPAs er dog påkrævet for at sænke den kritiske afkølingshastighed8. Derfor hæmmes forvitrifikation af CPA-toksicitet17 og begrænset til små stikprøve mængder. I bestræbelserne på at overvinde disse begrænsninger blev den metode til masse dråbe vitrifikation, der blev præsenteret i dette manuskript, udviklet til at muliggøre forvitrifikation af store mængder celler, mens der blev brugt en lav præ-inkuberet CPA-koncentration15. Denne bulk dråbe forvitrifikation fører til øget hepatocytter levedygtighed og metabolisk funktion i forhold til den mest optimale langsomt frysning kryopreserverings metode i litteraturen. Her gives de omfattende metoder til bulkdråbe forvitrifikation og detaljeret indsigt i de praktiske aspekter af procedurerne.
Flere trin i protokollen er kritiske og kræver yderligere opmærksomhed. Påfyldning af Dewar med ikke-steriliseret flydende nitrogen potentielt fører til semi-sterile forhold. Ved hjælp af de forholdsregler, der forklares i protokollen, ingen forurening blev afsløret under vores langsigtede kollagen sandwich kulturer. Der kan dog træffes yderligere steriliserings foranstaltninger, hvis det skønnes nødvendigt. Flydende nitrogen kan steriliseres ved stråling eller filtrering16 og systemet kan være helt lukket med et låg på den flydende kvælstof Dewar med en skorsten forbundet til blande nålen. Alternativt kan ikke-kontakt dråbe forglasning metoder udforskes, selv om dette kan begrænse større volumen gennemløb14.
Andre væsentlige dele af protokollen er den CPA før lastning og losning inkubations varigheder. Længere varighed kan resultere i toksisk CPA-skade, mens kortere varigheder kan forårsage osmotisk skade. Det er også vigtigt at sikre, at de forvilede hepatocyt dråber altid holde sig under glasovergangstemperaturen, fordi ukontrolleret makro-og mikroskopisk isnukleering ved højere temperaturer fører til svær hepatocyt skade og celledød. Fra et praktisk perspektiv, det mest kritiske skridt i bulk dråbe vitrifikation er den rewarming af forglasset hepatocyt dråber. Når de forglasede dråber fjernes fra den flydende nitrogen de kan fryse inden for få sekunder, hvis ikke hurtigt rewarmed ved øjeblikkeligt at tilføje den varme rewarming løsning.
Fremtidig optimering af bulk dråbe vitrifikation kunne yderligere forbedre bevarelsen resultater, såsom levedygtighed, udbytte, og metaboliske funktion. Både gennemtrængelig og ikke-gennemtrængelig CPAS kunne testes for at optimere den osmotiske dehydrering forud for forvitrifikation. Dette kan reducere det osmotiske chok under dehydrering og kan også gøre det muligt at nedsætte de præ-inkuberet CPA-koncentrationer. Desuden vil kontinuerlig Fluidic, i stedet for batchwise, CPA præ-inkubation teoretisk tillade forvitrifikation af ubegrænsede celle mængder. Fordi kun generelle laboratorieudstyr er nødvendig for bulk dråbe vitrifikation, det er en enkel og omkostningseffektiv konserveringsmetode, som potentielt kunne anvendes til bevaring af andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende finansielle interesser. DRs. de Vries, Weng, toner, Tessier og Uygun har midlertidige patentansøgninger, som er relevante for denne undersøgelse. Dr. Uygun har en økonomisk interesse i orgel løsninger, en virksomhed med fokus på udvikling af organ bevarings teknologi. Alle forskeres interesser forvaltes af MGH og Partners sundhedspleje i overensstemmelse med deres politik for interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering fra de amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 og R01DK114506) og det amerikanske forsvarsministerium (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er stærkt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R.
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A.
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E.
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G.
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al.
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
