Summary
Ce manuscrit décrit une méthode de cryoconservation sans glace pour de grandes quantités d'hépatocytes de rat par laquelle les cellules primaires sont pré-incubées avec des agents cryoprotecteurs à une faible concentration et vitrifiées dans de grandes gouttelettes.
Abstract
La vitrification est une solution de rechange prometteuse sans glace pour la cryoconservation classique de la congélation lente (à environ 1 oC/min) des échantillons biologiques. La vitrification nécessite des taux de refroidissement extrêmement rapides pour assurer la transition de l'eau dans la phase de verre tout en évitant la formation de glace dommageable. Bien que la pré-incubation avec des agents cryoprotecteurs (CPA) puisse réduire le taux critique de refroidissement des échantillons biologiques, des concentrations élevées sont généralement nécessaires pour permettre la cryoconservation sans glace par vitrification. En conséquence, la vitrification est entravée par la toxicité cpA et limitée aux petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Il a été récemment démontré que ces limitations inhérentes peuvent être surmontées par la vitrification en vrac des gouttelettes. Utilisant cette nouvelle méthode, les cellules sont d'abord pré-incubées avec une faible concentration intracellulaire de CPA. Tirant parti de la déshydratation osmotique rapide, l'APC intracellulaire est concentré directement avant la vitrification, sans avoir besoin d'équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide et intégrée à la génération continue à haut débit de grosses gouttelettes qui sont vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode de cryoconservation sans glace avec une toxicité minimale de CPA convient aux grandes quantités de cellules et a comme conséquence la viabilité accrue d'hépatocyte et la fonction métabolique comparée à la cryoconservation lente-congélation classique. Ce manuscrit décrit en détail les méthodes de vitrification réussie des gouttelettes en vrac.
Introduction
La perte de la viabilité cellulaire et de la fonction métabolique après la cryoconservation des hépatocytes est toujours un problème majeur qui limite les applications cliniques1,2,3. La méthode de référence de la cryoconservation des hépatocytes est la congélation lente, qui est effectuée en pré-incubant les hépatocytes avec CPA (sulfoxide de diméthyle [DMSO], glucose et albumine) et le gel contrôlé subséquent (à environ 1 oC/min) pour températures cryogéniques4,5. Malgré de nombreuses optimisations signalées, la toxicité de CPA ainsi que les déséquilibres osmotiques préjudiciables pendant le gel et le stress mécanique de la formation de glace demeurent des inconvénients fondamentaux du gel lent6,7.
Vitrification offre un avantage sur le gel lent dans cette blessure due à la formation de glace est complètement évitée par une transition de phase directe de l'eau dans l'état de verre6. Toutefois, pour atteindre la température de transition du verre de l'eau pure (-137 oC), l'eau doit être refroidie à des taux de l'ordre d'un million de degrés Celsius par seconde (c.-à-d. le taux de refroidissement critique) afin d'éviter la formation de glace au-dessus de la température de transition du verre8 . L'ajout de CPA peut abaisser le taux critique de refroidissement et augmenter la température de transition de verre des solutions aqueuses9. Cependant, même avec des concentrations élevées de CPA (par exemple, 40% v/v DMSO ou plus) des taux de refroidissement rapide sont néanmoins nécessaires pour une vitrification réussie8,9.
Les taux de refroidissement requis et les concentrations élevées de CPA entraînent deux inconvénients majeurs de la vitrification. Tout d'abord, pour permettre un refroidissement rapide, les échantillons doivent avoir une faible masse thermique. Deuxièmement, pour atteindre des concentrations élevées de CPA tout en évitant les blessures osmotiques, les CPA doivent être introduits lentement et entièrement équilibrés entre les compartiments intra- et extracellulaires6. Cela augmente le temps d'exposition des cellules aux CPA toxiques. Ensemble, cela rend la vitrification un processus lourd qui se limite à quelques échantillons de petite taille (microlitres) à la fois. La vitrification des gouttelettes a été proposée comme solution potentielle à ces restrictions. En exposant de minuscules gouttelettes chargées de cellules (nanolitres) à l'azote liquide, le taux de refroidissement est considérablement augmenté, ce qui permet par conséquent une réduction considérable de la concentration de CPA10,11,12 ,13,14. Bien que plusieurs buses à haute fréquence génératrices de gouttelettes pourraient potentiellement être utilisées simultanément, la taille extrêmement petite de gouttelette limite le débit aux microlitres par minute10,qui empêche la vitrification efficace de grandes cellules volumes avec des taux de traitement plus élevés de magnitudes de l'ordre de millilitres par minute.
Récemment, il a été démontré que ces limitations inhérentes de la vitrification peuvent être surmontées par la vitrification des gouttelettes en vrac15. Cette nouvelle méthode tire parti de la déshydratation osmotique rapide pour concentrer une concentration intracellulaire de CPA de 7,5% v/v d'éthylène glycol et DMSO immédiatement avant la vitrification, éliminant le besoin d'équilibre complet des concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide par une brève exposition des hépatocytes à une concentration extracellulaire élevée de CPA. Bien que cette exposition provoque une déshydratation osmotique rapide, il est trop court pour que la concentration élevée de CPA se diffuse dans les cellules. Immédiatement après la déshydratation, les cellules sont chargées en gouttelettes qui sont directement vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode élimine le besoin d'une pleine prise intracellulaire de fortes concentrations de CPA tandis que la concentration extracellulaire élevée de CPA permet la vitrification des gouttelettes de grande taille, ayant pour résultat des volumes de débit élevés avec la toxicité minimale de CPA.
La vitrification des gouttelettes améliore la viabilité directe et à long terme après la préservation, ainsi que la morphologie et la fonction métabolique des hépatocytes de rat primaires par rapport à la cryoconservation classique par congélation lente15. Ce manuscrit fournit les détails méthodologiques pour la vitrification en vrac des hépatocytes de rat primaire.
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Protocol
Les isolements primaires d'hépatocyte pour ce protocole ont été exécutés par le noyau de ressource de cellules (CRC) au Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, Etats-Unis. Le protocole animal (#2011N000111) a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts General Hospital.
1. Vitrification des gouttelettes en vrac
- Préparer les solutions de vitrification.
- Ajouter 40 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) à 17,0 mL de solution de l'Université du Wisconsin (UW) pour faire la solution de vitrification 1 (V1). Filtre stérile la solution V1 à l'aide d'un filtre de 0,22 m et entreposez-le à 4 oC.
REMARQUE : L'UW est une solution de conservation d'organe couramment utilisée. Il contient 50 g/L d'amidon hydroxyhyl, 35,83 g/L d'acide lactobionique, 3,4 g/L de phosphate de potassium monobasic, 1,23 g/L de sulfate de magnésium heptahydrate, 17,83 g/L de pentahydrate, 1,34 g/L d'adénosine, 0,136 g/L allopurinol, 0,992 g/L glutathitotal, 5,61 g/L /L hydroxyde de potassium, et hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,4. - Combinez 7,0 ml d'UW, 6,5 ml de DMSO, 6,5 ml d'éthylène glycol (EG), 40 mg de BSA et 5,48 g de saccharose pour faire la solution de vitrification 2 (V2). Filtre stérile de la solution V2 à l'aide d'un filtre de 0,22 m. Chargez 3,5 ml de solution V2 filtrée stérile dans une seringue de 3 ml et entreposez-la à 4 oC.
REMARQUE : Pour faciliter la dissolution des CPA, les solutions sont préparées en plus grande quantité que nécessaire.
- Ajouter 40 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) à 17,0 mL de solution de l'Université du Wisconsin (UW) pour faire la solution de vitrification 1 (V1). Filtre stérile la solution V1 à l'aide d'un filtre de 0,22 m et entreposez-le à 4 oC.
- Préparer l'appareil de vitrification des gouttelettes en vrac.
- Pour préparer l'aiguille de mélange, coupez d'abord le long d'un côté de la manche grise extérieure de l'aiguille de mélange, puis pliez la manche ouverte pour l'enlever de l'aiguille de mélange.
- Glissez deux sections de tubes en silicone de 25 mm au-dessus des entrées de l'aiguille de mélange et fixez leur position avec de la colle (Figure 1A).
- Couper l'aiguille sur une longueur de 20 mm (c.-à-d. la longueur de l'hélice de mélange interne) comme le montre la figure 1A.
REMARQUE : La longueur de l'aiguille de mélange est proportionnelle au volume à l'intérieur de l'aiguille et peut donc être modifiée pour contrôler le temps d'exposition des hépatocytes à la solution de concentration de CPA élevée. - Insérer la prise de coupure de l'aiguille de mélange dans une aiguille d'injection de 20 G (figure 1B).
REMARQUE : La taille de l'aiguille d'injection influence la taille des gouttelettes. - Stériliser l'assemblage de l'aiguille de mélange en autoclant.
- Remplissez un dewar stérile d'azote liquide. Stérilisez l'extérieur du Dewar avec l'isopropanol avant de placer le Dewar dans une hotte stérile de culture cellulaire à flux laminaire.
REMARQUE : La contamination est une considération importante lors de l'exposition directe des gouttelettes à l'azote liquide. Bien qu'il n'y ait pas eu de contamination à l'aide d'azote liquide non stérilisé dans le protocole actuel, l'azote liquide peut être filtré ou irradié pour assurer la stérilité si nécessaire16. - Insérer un entonnoir avec le même diamètre extérieur que le diamètre intérieur de l'azote liquide Dewar dans un tube conique de 50 ml pour créer le dispositif de collecte des gouttelettes (Figure 1CetE).
- Immerger le dispositif de collecte des gouttelettes dans l'azote liquide en le pressant lentement dans sa position verticale finale à l'aide de gros forceps. Assurez-vous que le tube conique repose en position verticale au bas du Dewar(Figure 1DetE).
REMARQUE : L'entonnoir doit rester inséré et reposer sur le tube conique. Le niveau d'azote liquide doit être de 1 cm au-dessous de la hauteur de l'entrée de l'entonnoir, comme le montre la figure 1D. - Montez une pompe à seringues en position verticale sur le mur du capot de culture cellulaire en attachant une ficelle des pieds de la pompe à seringues aux vis dépassant du mur du capot de culture cellulaire.
- Placez l'azote liquide Dewar avec le dispositif de collecte des gouttelettes sous la pompe à seringues montée verticalement (figure 1E).
- Pré-incubation avec CPA.
- Après avoir obtenu des hépatocytes de rat fraîchement isolés, comptez la concentration de stock par exclusion bleue de Trypan et prenez 40 millions d'hépatocytes viables.
REMARQUE : La manipulation douce des hépatocytes en suspension est essentielle pour empêcher la mort cellulaire. - Centrifugeuse à 50 x g pendant 5 min sans frein.
- Aspirer le supernatant et resuspendre les hépatocytes dans 3,4 ml de solution V1.
- Incuber sur glace pendant 3 min.
- Ajouter 150 L de DMSO et 150 OL d'EG aux hépatocytes et mélanger délicatement.
- Incuber sur glace pendant 3 min.
- Encore une fois, ajouter 150 L de DMSO et 150 OL d'EG aux hépatocytes et mélanger délicatement.
- Chargez 3,5 ml dans une seringue de 3 ml.
- Après avoir obtenu des hépatocytes de rat fraîchement isolés, comptez la concentration de stock par exclusion bleue de Trypan et prenez 40 millions d'hépatocytes viables.
- Effectuer la vitrification.
- Insérez la seringue avec des hépatocytes pré-incubés et les seringues de solution V2 sur l'adaptateur de pompe à seringues.
- Fixez deux adaptateurs de barbe de verrouillage Luer femelles aux seringues et faites glisser le tube en silicone de l'assemblage de l'aiguille de mélange sur les raccords de barbe(Figure 1F).
- Placez l'ensemble de l'assemblage dans la pompe à seringues (Figure 1E).
- Trois min après la dernière addition de DMSO et EG aux hépatocytes, démarrez la pompe à 2 mL/min.
- Arrêtez la pompe après que tous les hépatocytes ont été ajoutés à l'azote liquide.
2. Stockage cryogénique
- Perforer 10 petits trous dans le couvercle d'un tube conique de 50 ml à l'aide d'une aiguille de 20 G et envelopper l'extérieur du couvercle avec un film flexible, comme le montre la figure 1B. Cela crée une valve qui permet d'échapper à l'évaporation des restes d'azote liquide.
- Pour recueillir les gouttelettes d'hépatocyte vitrifié, retirez d'abord l'entonnoir de l'azote liquide Dewar. Ensuite, utilisez de longs forceps pour prendre le tube conique qui contient les gouttelettes de l'azote liquide et versez lentement l'excès d'azote liquide du tube conique.
- Fermez le tube conique avec le couvercle perforé et placez directement le tube conique fermé avec des gouttelettes d'hépatocyte vitrifiédans de nouveau dans l'azote liquide Dewar.
- Transférer le tube conique de l'azote liquide dans un cryotank à vapeur d'azote liquide.
3. Réchauffement des gouttelettes d'hépatocytevits
-
Préparer la solution de réchauffement.
- Dissoudre 17,13 g de saccharose dans 100 ml de médias de culture d'hépatocytes DMEM pour faire la solution de réchauffement. Filtre stérile la solution de réchauffement à l'aide d'un filtre de 0,22 m et chaude à 37 oC.
-
Réchauffez les hépatocytes.
- Prenez le tube conique avec des hépatocytes vitrifiés du cryotank et transportez-le dans un dewar d'azote liquide au capot de culture cellulaire.
- Desserrer légèrement le bouchon et remettre le tube conique dans l'azote liquide.
- Ajouter les gouttelettes d'hépatocyte vitrifiées à un bécher vide, ajouter instantanément la solution de réchauffement chaude (37 oC) et remuer immédiatement pendant 10 s.
REMARQUE : Il est essentiel de travailler rapidement pour éviter le gel pendant leréchauffement. Selon les exigences de l'étude, quelques gouttelettes vitrifiées peuvent être réchauffées à la fois.
-
Déchargez la solution de réchauffement.
- Diviser la solution de réchauffement avec des hépatocytes sur deux tubes coniques de 50 ml.
- Centrifuger les deux tubes coniques pendant 2 min à 100 x g à 4 oC sans frein.
- Aspirez le supernatant pour laisser un volume total de 12,5 ml en utilisant la marque de graduation du tube conique comme référence et ajoutez 12,5 mL de DMEM glacé par tube conique pour diluer la solution de réchauffement à 50%.
- Resuspendre les hépatocytes et incuber sur la glace pendant 3 min.
- Ajouter 25 ml de DMEM glacé par tube conique pour diluer la solution de réchauffement à 25%.
- Centrifugeuse de 5 min à 50 x g à 4 oC sans frein.
- Aspirer le supernatant et resuspendre les hépatocytes en 2 ml du milieu de culture désiré pour une utilisation.
REMARQUE : La centrifugation de gradient de densité peut être employée pour enlever les hépatocytes morts de la suspension de cellules si désiré.
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Representative Results
Des hépatocytes primaires fraîchement isolés de cinq foies de rat différents ont été utilisés pour une comparaison directe de la vitrification des gouttelettes en vrac à la cryoconservation classique en utilisant les protocoles prééminents de congélation lente rapportés dans la littérature4, 5. En bref, les hépatocytes ont été suspendus dans UW complétés avec BSA (2.2 mg/mL), glucose (333 mM), et DMSO (10% v/v) et congelés à l'aide d'un congélateur à taux contrôlé. Après l'entreposage à -196 oC, les échantillons ont été décongelés dans un bain d'eau chaude. Après que toute la glace ait fondu, le DMSO a été directement dilué tandis que la concentration de glucose a été graduellement abaissée pendant plusieurs étapes pour réduire des dommages osmotiques. Le protocole exact peut être trouvé en détail ailleurs15. Les durées de conservation variaient de 2 à 8 jours et étaient appariées entre la vitrification des gouttelettes en vrac et la cryoconservation de congélation pour chaque réplique biologique afin d'assurer une comparaison égale. Bien que des temps de conservation plus courts aient été testés pour des considérations pratiques, il convient de noter que les hépatocytes primaires peuvent être stockés à -196 oC pendant des années sans perte de viabilité5.
La vitrification des gouttelettes en vrac entraîne une viabilité directe de 79 % des hépatocytes après la préservation, mesurée par les essais d'exclusion bleue de Trypan, qui déterminent l'intégrité de la membrane (figure 2A). C'est nettement plus élevé que la viabilité de 68% après la cryoconservation optimisée classique. Le rendement de la vitrification des gouttelettes en vrac est de 56 % supérieur à 10 % et, ce qui est beaucoup plus constant, par rapport à la cryoconservation classique(figure 2B).
L'activité métabolique des hépatocytes, mesurée à l'aide d'un essai de métabolisation Presto Blue dans les cultures sandwich au collagène à long terme, était significativement plus élevée après la vitrification des gouttelettes en vrac qu'après la cryoconservation classique. La synthèse de l'albumine, qui est le paramètre le plus largement utilisé de la fonction synthétique des hépatocytes, a été multipliée par près de deux après la vitrification des gouttelettes en vrac par rapport à la cryoconservation classique (Figure 3A). La production d'urée est le paramètre le plus largement utilisé de la fonction de désintoxication des hépatocytes. Après une culture d'une semaine, la production d'urée d'hépatocytes vitrifiés en vrac était significativement plus élevée que celle des hépatocytes cryoconservés classiques(figure 3B).
En résumé, la vitrification en vrac de gouttelette améliore la viabilité directe de poteau-préservation et la fonction métabolique à long terme des hépatocytes primaires de rat dans les cultures de sandwich de collagène, par rapport à la cryoconservation par congélation lente.
Figure 1 : Configuration expérimentale de vitrification de goutteletteenne en vrac.
(A) Illustration de la façon de préparer l'aiguille de mélange et d'attacher deux sections de tubes en silicone aux entrées de l'aiguille de mélange. (B) Illustration de l'insertion de l'aiguille de mélange de coupe dans l'aiguille d'injection pour compléter l'assemblage de l'aiguille de mélange. (C) Illustration de l'entonnoir et du tube conique de 50 ml qui constituent le dispositif de collecte des gouttelettes. (D) Croquis montrant la position du tube conique, l'entonnoir et le niveau d'azote liquide dans le Dewar. (E) Représentation de la vitrification expérimentale complète des gouttelettes en vrac de bas en haut : l'azote liquide Dewar (gris); le dispositif de collecte des gouttelettes qui est placé à l'intérieur de l'azote liquide Dewar (clair); l'assemblage de l'aiguille de mélange (jaune clair) fixé aux seringues qui sont placées dans la pompe à seringues (rouge). (F) Illustration des seringues et mélange de l'assemblage de l'aiguille. Deux seringues de 3 ml sont fixées dans l'adaptateur de pompe à seringues (bleu); une seringue doit être remplie d'hépatocytes pré-incubés dans la solution V1 et l'autre avec la solution de concentration de CPA élevée (solution V2). L'assemblage de l'aiguille de mélange est fixé aux seringues par deux adaptateurs de barbe à serrure Luer femelles. (G) Illustration de la façon de créer le couvercle du tube conique pour le stockage cryogénique qui permet aux restes d'azote liquide évaporant de s'échapper du tube conique pendant le stockage des gouttelettes d'hépatocyte vitrifié. Haut : couvercle avec trous perforés. Ci-dessous: le couvercle perforé enveloppé de film flexible. Barres d'échelle : 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : viabilité et rendement des hépatocytes après conservation.
(A) Viabilité des hépatocytes frais (gris), cryoconservés (bleus) et en vrac. (B) Rendement de conservation des hépatocytes vitrifiés cryoconservés et en vrac. Étoiles: p 'lt; 0.05 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Moustaches: min à max. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Activité métabolique dans les cultures sandwich au collagène à long terme.
(A) Synthèse d'albumine des hépatocytes frais (gris), cryoconservés (bleus) et en vrac de gouttelettes vitrifiées (vertes) les jours de culture 3, 5, et 7. (B) Production d'urée d'hépatocytes vitrifiés frais, cryoconservés et en vrac. Étoiles: p 'lt; 0.05 (appariement à sens unique ANOVA suivie de la correction Tukey pour plusieurs tests). Barres d'erreur : déviation standard. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La cryoconservation des hépatocytes par congélation lente entraîne une viabilité réduite et une fonction métabolique. Vitrification offre une alternative prometteuse pour la cryoconservation classique, comme les dommages de congélation est complètement évité9. Cependant, la pré-incubation avec les CPA est nécessaire pour abaisser le taux de refroidissement critique8. Par conséquent, la vitrification est entravée par la toxicitécpA 17 et limitée à de petits volumes d'échantillons. Dans les efforts pour surmonter ces limitations, la méthode de vitrification des gouttelettes en vrac présentée dans ce manuscrit a été développée pour permettre la vitrification de grandes quantités de cellules tout en utilisant une faible concentration de CPA pré-incubée15. Cette vitrification en vrac de gouttelette mène à la viabilité et à la fonction métabolique accrues d'hépatocyte par rapport à la méthode de cryoconservation lente-congélation la plus optimale dans la littérature. Ici, les méthodes complètes de vitrification des gouttelettes en vrac et des aperçus détaillés dans les aspects pratiques des procédures sont fournis.
Plusieurs étapes du protocole sont essentielles et nécessitent une attention supplémentaire. Le remplissage du Dewar avec de l'azote liquide non stérilisé conduit potentiellement à des conditions semi-stériles. En utilisant les précautions expliquées dans le protocole, aucune contamination n'a été révélée pendant nos cultures à long terme de sandwich de collagène. Toutefois, des mesures de stérilisation supplémentaires peuvent être prises si cela est jugé nécessaire. L'azote liquide peut être stérilisé par rayonnement ou filtrage16 et le système peut être complètement fermé avec un couvercle sur l'azote liquide Dewar avec une cheminée reliée à l'aiguille de mélange. Alternativement, des méthodes de vitrification de gouttelettes sans contact peuvent être explorées, bien que ceci puisse limiter le débit plus grand de volume14.
D'autres parties essentielles du protocole sont la durée de préchargement et de déchargement des cpA. Des durées plus longues pourraient entraîner des lésions toxiques de l'ACP, tandis que des durées plus courtes peuvent causer des lésions osmotiques. En outre, il est important de s'assurer que les gouttelettes d'hépatocyte vitrifiées restent toujours en dessous de la température de transition de verre parce que la nucléation macro- et microscopique incontrôlée de glace à des températures plus élevées mènent aux dommages graves d'hépatocyte et à la mort de cellules. D'un point de vue pratique, l'étape la plus critique dans la vitrification des gouttelettes en vrac est le réchauffement des gouttelettes d'hépatocytes vitrifiés. Lorsque les gouttelettes vitrifiées sont retirées de l'azote liquide, elles peuvent geler en quelques secondes si elles ne se réchauffent pas rapidement en ajoutant instantanément la solution de réchauffement chaud.
L'optimisation future de la vitrification en vrac de gouttelette pourrait encore améliorer les résultats de conservation, tels que la viabilité, le rendement, et la fonction métabolique. Les CPA perméables et non perméables pourraient être testés pour optimiser la déshydratation osmotique avant la vitrification. Cela pourrait réduire le choc osmotique pendant la déshydratation et pourrait également permettre de diminuer les concentrations de CPA pré-incubées. En outre, fluide continu, au lieu de batchwise, CPA pré-incubation permettrait théoriquement la vitrification des quantités cellulaires illimitées. Étant donné que seul l'équipement général de laboratoire est nécessaire pour la vitrification des gouttelettes en vrac, il s'agit d'une méthode de conservation simple et rentable qui pourrait potentiellement être utilisée pour la préservation d'autres types de cellules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent des intérêts financiers concurrents. Mm. de Vries, Weng, Toner, Tessier et Uygun ont des demandes de brevet provisoires pertinentes à cette étude. M. Uygun a un intérêt financier dans Organ Solutions, une entreprise axée sur le développement de technologies de préservation d'organes. Tous les intérêts des chercheurs sont gérés par l'HGM et Partners HealthCare conformément à leurs politiques en matière de conflitds d'intérêts.
Acknowledgments
Le financement des National Institutes of Health des États-Unis (R01DK096075, R01DK107875 et R01DK114506) et du département américain de la Défense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) est grandement reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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