Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine eisfreie Kryokonservierungsmethode für große Mengen von Rattenhepatozyten, bei der Primärzellen mit kryoprotektiven Mitteln in geringer Konzentration vorinkubiert und in großen Tröpfchen verglast werden.
Abstract
Die Vitrifizierung ist eine vielversprechende eisfreie Alternative zur klassischen Slow-Freezing (bei ca. 1 °C/min) Kryokonservierung biologischer Proben. Die Vitrifizierung erfordert extrem schnelle Kühlraten, um den Übergang von Wasser in die Glasphase zu erreichen und gleichzeitig eine schädliche Eisbildung zu vermeiden. Obwohl die Vorinkubation mit kryoprotektiveN (CPA) die kritische Abkühlrate biologischer Proben reduzieren kann, sind in der Regel hohe Konzentrationen erforderlich, um eine eisfreie Kryokonservierung durch Verglasung zu ermöglichen. Infolgedessen wird die Verglasung durch CPA-Toxizität behindert und auf kleine Proben beschränkt, die schnell gekühlt werden können. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen durch die Verglasung von Tröpfchen überwunden werden können. Mit dieser neuartigen Methode werden Zellen zunächst mit einer niedrigen intrazellulären CPA-Konzentration vorinkubiert. Durch die Nutzung einer schnellen osmotischen Dehydrierung konzentriert sich das intrazelluläre CPA direkt vor der Vitrifizierung, ohne dass toxische CPA-Konzentrationen vollständig ausgeglichen werden müssen. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durchgeführt und mit kontinuierlicher hoher Durchsatzerzeugung von großen Tröpfchen integriert, die in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese eisfreie Kryokonservierungsmethode mit minimaler CPA-Toxizität eignet sich für große Zellmengen und führt zu einer erhöhten Hepatozytenlebensfähigkeit und Metabolisierungsfunktion im Vergleich zur klassischen langsam gefrierenden Kryokonservierung. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für eine erfolgreiche Bulk-Droplet-Verglasung im Detail.
Introduction
Verlust der Zelllebensfähigkeit und metabolische Funktion nach Kryokonservierung von Hepatozyten ist immer noch ein großes Problem, das klinische Anwendungen begrenzt1,2,3. Die Benchmark-Methode der Hepatozyten-Kryokonservierung ist das langsame Einfrieren, das durch Vorinkubation der Hepatozyten mit CPA (Dimethylsulfoxid [DMSO], Glucose und Albumin) und anschließender kontrollierter Rate gefriert (bei ca. 1 °C/min) kryogene Temperaturen4,5. Trotz vieler gemeldeter Optimierungen bleiben CPA-Toxizität zusammen mit schädlichen osmotischen Ungleichgewichten beim Einfrieren und mechanischer Belastung der Eisbildung grundlegende Nachteile des langsamen Einfrierens6,7.
Vitrifizierung bietet einen Vorteil gegenüber langsamem Einfrieren, da Verletzungen durch Eisbildung durch einen direkten Phasenübergang des Wassers in den Glaszustand6vollständig vermieden werden. Um jedoch die Glasübergangstemperatur von reinem Wasser (-137 °C) zu erreichen, muss das Wasser in einer Größenordnung von einer Million Grad Celsius pro Sekunde (d. h. der kritischen Abkühlrate) gekühlt werden, um eine Eisbildung über der Glasübergangstemperatur 8 zu vermeiden. . Die Zugabe von CPAs kann die kritische Kühlrate senken und die Glasübergangstemperatur wässriger Lösungenerhöhen 9. Doch auch bei hohen CPA-Konzentrationen (z.B. 40% v/v DMSO oder höher) sind für eine erfolgreiche Verglasung8,9dennoch schnelle Abkühlraten erforderlich.
Die erforderlichen Kühlraten und hohen CPA-Konzentrationen führen zu zwei großen Nachteilen der Verglasung. Um eine schnelle Kühlung zu ermöglichen, müssen die Proben zunächst eine geringe thermische Masse haben. Zweitens müssen CPAs langsam eingeführt und vollständig zwischen den intra- und extrazellulären Kompartimenten6ausgeglichen werden, um hohe CPA-Konzentrationen zu erreichen und gleichzeitig osmotische Verletzungen zu vermeiden. Dies erhöht die Expositionszeit von Zellen gegenüber toxischen CPAs. Zusammen macht dies die Verglasung zu einem umständlichen Prozess, der auf ein paar kleine Proben (Mikroliter) gleichzeitig beschränkt ist. Als mögliche Lösung für diese Beschränkungen wurde die Tröpfchenverglasung vorgeschlagen. Durch die Exposition von winzigen zellbeladenen Tröpfchen (Nanolitern) gegenüber flüssigem Stickstoff wird die Kühlrate deutlich erhöht, was eine erhebliche Reduktion der CPA-Konzentration10,11,12 ermöglicht. ,13,14. Obwohl mehrere hochfrequente Tröpfchen-erzeugungserzeugende Düsen potenziell gleichzeitig verwendet werden könnten, begrenzt die extrem kleine Tröpfchengröße den Durchsatz auf Mikroliter pro Minute10, was eine effiziente Verglasung großer Zellen verhindert. Volumen mit um Magnituden höheren Verarbeitungsraten in der Größenordnung von Millilitern pro Minute.
Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen der Vitrifizierung durch Bulk-Droplet-Vitrifizierung15überwunden werden können. Diese neuartige Methode nutzt eine schnelle osmotische Dehydrierung, um eine intrazelluläre CPA-Konzentration von 7,5 % v/v Ethylenglykol und DMSO unmittelbar vor der Vitrifizierung zu konzentrieren, wodurch die vollständige Ausgleichung toxischer CPA-Konzentrationen entfällt. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durch eine kurze Exposition der Hepatozyten bei einer hohen extrazellulären CPA-Konzentration durchgeführt. Obwohl diese Exposition eine schnelle osmotische Dehydrierung verursacht, ist es zu kurz, als dass die hohe CPA-Konzentration in die Zellen diffundieren könnte. Unmittelbar nach der Dehydrierung werden die Zellen in Tröpfchen geladen, die direkt in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese Methode eliminiert die Notwendigkeit einer vollständigen intrazellulären Aufnahme hoher CPA-Konzentrationen, während die hohe extrazelluläre CPA-Konzentration die Verglasung großer Tröpfchen ermöglicht, was zu hohen Durchsatzvolumina mit minimaler CPA-Toxizität führt.
Tröpfchenverglasung verbessert die direkte und langfristige Lebensfähigkeit nach der Konservierung, sowie Morphologie und metabolische Funktion der primären Rattenhepatozyten im Vergleich zur klassischen Kryokonservierung durch langsames Einfrieren15. Dieses Manuskript enthält die methodischen Details für die Massentropfenverglasung von primären Rattenhepatozyten.
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Protocol
Die primären Hepatozytenisolationen für dieses Protokoll wurden vom Cell Resource Core (CRC) am Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, USA durchgeführt. Das Tierprotokoll (#2011N000111) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital genehmigt.
1. Bulk-Droplet-Vitrifikation
- Bereiten Sie die Verglasungslösungen vor.
- Fügen Sie 40 mg Rinderserumalbumin (BSA) zu 17,0 ml der Lösung der University of Wisconsin (UW) hinzu, um Vitrifizierungslösung 1 (V1) herzustellen. Sterilfilter der V1-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und lagern bei 4 °C.
HINWEIS: UW ist eine häufig verwendete Organkonservierungslösung. Es enthält 50 g/L Hydroxyethylstärke, 35,83 g/L Lactobionsäure, 3,4 g/L Kaliumphosphat monobasic, 1,23 g/L Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 17,83 g/L-Raffinose-Pentahydrat, 1,34 g/L Adenosin, 0,136 g/L Allopurinol, 0,992 g/L Totalglutathion, 5,61 g /L Kaliumhydroxid und Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. - Kombinieren Sie 7,0 ml UW, 6,5 ml DMSO, 6,5 ml Ethylenglykol (EG), 40 mg BSA und 5,48 g Saccharose zur Verglasungslösung 2 (V2). Sterilfilter der V2-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter. 3,5 ml steril gefilterte V2-Lösung in eine 3 ml Spritze geben und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Um die Auflösung der CPAs zu erleichtern, werden Lösungen in größeren Mengen als erforderlich vorbereitet.
- Fügen Sie 40 mg Rinderserumalbumin (BSA) zu 17,0 ml der Lösung der University of Wisconsin (UW) hinzu, um Vitrifizierungslösung 1 (V1) herzustellen. Sterilfilter der V1-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und lagern bei 4 °C.
- Bereiten Sie die Bulk-Droplet-Verglasungsapparat.
- Um die Mischnadel vorzubereiten, schneiden Sie zuerst entlang einer Seite der äußeren grauen Hülse der Mischnadel und biegen Sie dann die Hülse auf, um sie von der Mischnadel zu entfernen.
- Schieben Sie zwei 25 mm Silikonschläuche über die Einlässe der Mischnadel und sichern Sie ihre Position mit Kleber (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 20 mm (d. h. die Länge der inneren Mischhelix) wie in Abbildung 1Adargestellt.
HINWEIS: Die Mischnadellänge ist proportional zum Volumen innerhalb der Nadel und kann daher geändert werden, um die Belichtungszeit der Hepatozyten gegenüber der Lösung mit hoher CPA-Konzentration zu steuern. - Setzen Sie den Trennausgang der Mischnadel in eine 20 G Injektionsnadel ein (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Größe der Injektionsnadel beeinflusst die Tröpfchengröße. - Sterilisieren Sie die Mischnadelbaugruppe durch Autoklavieren.
- Füllen Sie einen sterilen Dewar mit flüssigem Stickstoff. Sterilisieren Sie die Außenseite des Dewar mit Isopropanol, bevor Sie den Dewar in eine sterile laminare Flusszellkulturhaube legen.
HINWEIS: Eine Kontamination ist ein wichtiger Aspekt bei der direkten Exposition der Tröpfchen gegenüber flüssigem Stickstoff. Obwohl im aktuellen Protokoll keine Kontamination mit nicht sterilisiertem flüssigem Stickstoff vorlag, kann flüssiger Stickstoff gefiltert oder bestrahlt werden, um bei Bedarf die Sterilität zu gewährleisten16. - Legen Sie einen Trichter mit dem gleichen Außendurchmesser wie der Innendurchmesser des flüssigen Stickstoffs Dewar in ein 50 ml konisches Rohr ein, um die Tröpfchensammelvorrichtung zu erstellen (Abbildung 1C-E).
- Tauchen Sie die Tröpfchensammelvorrichtung in den flüssigen Stickstoff ein, indem Sie sie langsam in ihrer endgültigen vertikalen Position mit großen Zangen nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass das konische Rohr in einer vertikalen Position am unteren Rand des Dewar stagniert (Abbildung 1D-E).
HINWEIS: Der Trichter sollte in das konische Rohr eingelegt bleiben und auf dem konischen Rohr ruhen. Der Flüssigstickstoffgehalt sollte 1 cm unter der Einlasshöhe des Trichters liegen, wie in Abbildung 1Ddargestellt. - Montieren Sie eine Spritzenpumpe in einer vertikalen Position an der Wand der Zellkulturhaube, indem Sie eine Schnur von den Füßen der Spritzenpumpe an Schrauben binden, die aus der Zellkultur-Haubenwand herausragen.
- Legen Sie den flüssigen Stickstoff Dewar mit der Tröpfchensammelvorrichtung unter die vertikal montierte Spritzenpumpe (Abbildung 1E).
- Vorinkubation mit CPAs.
- Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Trypan blauen Ausschluss und nehmen 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten.
HINWEIS: Der sanfte Umgang mit Hepatozyten in suspension ist entscheidend, um den Zelltod zu verhindern. - Zentrifuge bei 50 x g für 5 min ohne Bremse.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Hepatozyten in 3,4 ml V1-Lösung wieder aus.
- 3 min auf Eis bebrüten.
- Fügen Sie den Hepatozyten 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.
- 3 min auf Eis bebrüten.
- Fügen Sie die Hepatozyten nochmals 150 l DMSO und 150 L EG hinzu und mischen Sie sie vorsichtig.
- 3,5 ml in eine 3 ml Spritze geben.
- Nach Erhalt frisch isolierter Rattenhepatozyten, zählen Sie die Lagerkonzentration durch Trypan blauen Ausschluss und nehmen 40 Millionen lebensfähige Hepatozyten.
- Vitrifizierung durchführen.
- Setzen Sie die Spritze mit vorbebrühten Hepatozyten und die V2-Lösungsspritzen auf den Spritzenpumpenadapter.
- Befestigen Sie zwei weibliche Luer-Verriegelungs-Rohr-Widerhaken-Adapter an den Spritzen und schieben Sie die Silikonschläuche der Mischnadel-Baugruppe über die Widerhakenarmaturen(Abbildung 1F).
- Legen Sie die gesamte Baugruppe in die Spritzenpumpe (Abbildung 1E).
- Drei Min. nach der letzten Zugabe von DMSO und EG zu den Hepatozyten starten Sie die Pumpe bei 2 ml/min.
- Stoppen Sie die Pumpe, nachdem dem flüssigen Stickstoff alle Hepatozyten zugesetzt wurden.
2. Kryogene Lagerung
- Punktieren Sie 10 kleine Löcher im Deckel eines 50 ml konischen Rohres mit einer 20 G Nadel und wickeln Sie die Außenseite des Deckels mit einem flexiblen Film, wie in Abbildung 1Bdargestellt. Dadurch entsteht ein Ventil, das das Entweichen von verdampfendem flüssigem Stickstoff ermöglicht.
- Um die verglasten Hepatozytentröpfchen zu sammeln, entfernen Sie zuerst den Trichter aus dem flüssigen Stickstoff Dewar. Als nächstes verwenden Sie lange Zangen, um das konische Rohr zu nehmen, das die Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff enthält, und gießen Sie langsam den überschüssigen flüssigen Stickstoff aus dem konischen Rohr aus.
- Schließen Sie das konische Rohr mit dem durchlöcherten Deckel und legen Sie das geschlossene konische Rohr mit verglasten Hepatozytentröpfchen direkt wieder in den flüssigen Stickstoff Dewar.
- Übertragen Sie das konische Rohr aus dem flüssigen Stickstoff in einen flüssigen Stickstoffdampf-Kryotank.
3. Wiedererwärmung der verglasten Hepatozytentröpfchen
-
Bereiten Sie die Rewarming-Lösung vor.
- 17,13 g Saccharose in 100 ml DMEM Hepatozytenkulturmedien auflösen, um die Rewarminglösung zu finden. Steriler Filter der Rewarming-Lösung mit einem 0,22-mm-Filter und warm auf 37 °C.
-
Die Hepatozyten aufwärmen.
- Nehmen Sie die konische Röhre mit verglasten Hepatozyten aus dem Kryotank und transportieren Sie sie in einem flüssigen Stickstoff Dewar zur Zellkulturhaube.
- Lösen Sie die Kappe leicht und legen Sie das konische Rohr wieder in den flüssigen Stickstoff.
- Die verglasten Hepatozytentröpfchen in ein leeres Becherglas geben, sofort die warme (37 °C) Aufwärmlösung hinzufügen und sofort 10 s rühren.
HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um das Einfrieren während des Erneuten Aufwärmens zuvermeiden. Je nach Studienbedarf können einige bis alle verglasten Tröpfchen auf einmal wieder aufgewärmt werden.
-
Entladen Sie die Wiederaufwärmlösung.
- Teilen Sie die Rewarminglösung mit Hepatozyten über zwei 50 ml konische Rohre.
- Zentrifugieren Sie die beiden konischen Rohre für 2 min bei 100 x g bei 4 °C ohne Bremse.
- Saugen Sie den Überstand an, um ein Gesamtvolumen von 12,5 ml unter Verwendung der Graduierungsmarke des konischen Rohrs als Referenz zu lassen, und fügen Sie 12,5 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 50 % zu verdünnen.
- Die Hepatozyten wieder aufsetzen und 3 min auf Eis brüten.
- Fügen Sie 25 ml eiskaltes DMEM pro konischem Rohr hinzu, um die Rewarminglösung auf 25% zu verdünnen.
- Zentrifuge für 5 min bei 50 x g bei 4 °C ohne Bremse.
- Den Überstand ansaugen und die Hepatozyten in 2 ml des gewünschten Kulturmediums für den Einsatz wieder aussetzen.
HINWEIS: Die Zentrifugation des Dichtegradienten kann verwendet werden, um tote Hepatozyten auf Wunsch aus der Zellsuspension zu entfernen.
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Representative Results
Frisch isolierte primäre Hepatozyten aus fünf verschiedenen Rattenlebern wurden für einen direkten Vergleich der Massentropfenverglasung mit der klassischen Kryokonservierung unter Verwendung der in derLiteratur 4 berichteten herausragenden Slow-Freezing-Protokolle verwendet. 5. Kurz gesagt, die Hepatozyten wurden in UW mit BSA (2,2 mg/ml), Glukose (333 mM) und DMSO (10% v/v) ergänzt und mit einem kontrollierten Gefrierschrank eingefroren. Nach der Lagerung bei -196 °C wurden die Proben in einem warmen Wasserbad aufgetaut. Nachdem das eisgeschmolzene Eis geschmolzen war, wurde das DMSO direkt verdünnt, während die Glukosekonzentration in mehreren Schritten schrittweise gesenkt wurde, um osmotische Verletzungen zu reduzieren. Das genaue Protokoll kann an anderer Stelle im Detail gefunden werden15. Die Konservierungsdauer variierte zwischen 2 bis 8 Tagen und wurde zwischen Bulk-Droplet-Verglasung und Gefrierkryokonservierung für jede biologische Replik abgestimmt, um einen gleichen Vergleich zu gewährleisten. Obwohl kürzere Konservierungszeiten aus praktischen Erwägungen getestet wurden, ist zu beachten, dass primäre Hepatozyten jahrelang bei -196 °C gelagert werden können, ohne die Lebensfähigkeit zu verlieren5.
Die Verglasung von Bulk-Tröpfchen führt zu einer direkten Hepatozyten-Lebensfähigkeit nach der Konservierung von 79 %, gemessen durch Trypan Blue Exclusion Testing, das die Membranintegrität bestimmt (Abbildung 2A). Dies ist deutlich höher als die 68% Lebensfähigkeit nach klassischer optimierter Kryokonservierung. Die Ausbeute der Bulk-Droplet-Vitrifizierung ist 56%, die 10% höher ist, und vor allem konsistenter, im Vergleich zu klassischen Kryokonservierung (Abbildung 2B).
Die metabolische Aktivität von Hepatozyten, gemessen mit einem Presto Blue Metabolisierungsaufsatz in langfristigen Kollagen-Sandwichkulturen, war nach der Bulk-Droplet-Vitrifizierung signifikant höher als nach der klassischen Kryokonservierung. Die Albumin-Synthese, die der am weitesten verbreitete Parameter der synthetischen Funktion von Hepatozyten ist, war nach der Massentröpfchenverglasung um fast das Zweifache größer als die klassische Kryokonservierung (Abbildung 3A). Die Harnstoffproduktion ist der am weitesten verbreitete Parameter der Hepatozytenentgiftungsfunktion. Nach einer einwöchigen Kultur war die Harnstoffproduktion von Bulk-Droplet verglaste Hepatozyten deutlich höher als die von klassischen kryokonservierten Hepatozyten (Abbildung 3B).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Massentropfenverglasung die direkte Lebensfähigkeit nach der Konservierung und die langfristige metabolische Funktion von primären Rattenhepatozyten in Kollagen-Sandwichkulturen verbessert, im Vergleich zur Kryokonservierung durch langsames Einfrieren.
Abbildung 1: Bulk-Droplet-Verglasung Versuchsaufbau.
(A) Abbildung, wie die Mischnadel vorbereitet wird und zwei Silikonrohrabschnitte an den Einlässe der Mischnadel befestigt werden. (B) Abbildung des Einsetzens der geschnittenen Mischnadel in die Injektionsnadel, um die Mischnadelbaugruppe zu vervollständigen. (C) Abbildung des Trichters und des 50 ml kegelförmigen Rohres, aus denen die Tröpfchensammelvorrichtung besteht. (D) Skizze, die die Position des konischen Rohres, des Trichters und des flüssigen Stickstoffgehalts im Dewar zeigt. (E) Darstellung des vollständigen experimentellen Massentröpfchenverglasungsaufbaus von unten nach oben: der flüssige Stickstoff Dewar (grau); die Tröpfchensammelvorrichtung, die im flüssigen Stickstoff Dewar platziert wird (klar); die Mischnadelbaugruppe (klargelb), die an den Spritzen befestigt ist, die in der Spritzenpumpe (rot) platziert sind. (F) Abbildung der Spritzen und Mischnadelbau. Zwei 3 ml Spritzen werden in den Spritzenpumpenadapter (blau) eingespannt; eine Spritze sollte mit vorbebrüten Hepatozyten in V1-Lösung und die andere mit der Lösung mit hoher CPA-Konzentration (V2-Lösung) gefüllt werden. Die Mischnadelbaugruppe wird von zwei weiblichen Luer-Verriegelungsschlauch-Barbehaltern an den Spritzen befestigt. (G) Abbildung, wie der konische Rohrdeckel für die kryogene Lagerung erstellt wird, der es ermöglicht, dass übrig gebliebener verdampfender flüssiger Stickstoff während der Lagerung der verglasten Hepatozytentröpfchen aus dem konischen Rohr entweichen kann. Oben: Deckel mit durchlöcherten Löchern. Unten: der punktierte Deckel mit flexibler Folie gewickelt. Maßstabsbalken: 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Hepatozyten-Lebensfähigkeit und Ausbeute nach Konservierung.
(A) Lebensfähigkeit von frischen (grauen), kryokonservierten (blauen) und bulk tropfend verglasten (grünen) Hepatozyten. (B) Erhaltungsleistung von kryokonservierten und bulk letlet verglasten Hepatozyten. Sterne: p < 0.05 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Whiskers: min bis max. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Metabolische Aktivität in langfristigen Kollagen-Sandwichkulturen.
(A) Albumin-Synthese von frischen (grauen), kryokonservierten (blauen) und Bulk-Tropfen verglasten (grünen) Hepatozyten an kulturtagen 3, 5 und 7. (B) Harnstoffproduktion von frischen, kryokonservierten und bulk tropfend verglasten Hepatozyten. Sterne: p < 0.05 (gekoppelte einwegige ANOVA gefolgt von der Tukey-Korrektur für mehrfache Tests). Fehlerbalken: Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Kryokonservierung von Hepatozyten durch langsames Einfrieren führt zu verminderter Lebensfähigkeit und metabolischer Funktion. Vitrifikation bietet eine vielversprechende Alternative für die klassische Kryokonservierung, da Gefrierverletzungen vollständig vermieden werden9. Eine Vorinkubation mit CPAs ist jedoch erforderlich, um die kritische Kühlrate8zu senken. Folglich wird die Verglasung durch die CPA-Toxizität17 behindert und auf kleine Probenvolumina beschränkt. In den Bemühungen, diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die in diesem Manuskript vorgestellte Methode zur Verglasung von Massentröpfchen entwickelt, um die Verglasung großer Zellmengen unter Verwendung einer niedrigen vorbebrüten CPA-Konzentration15zu ermöglichen. Diese Bulk-Tropfen-Vitrifizierung führt zu erhöhter Hepatozyten-Lebensfähigkeit und metabolische Funktion im Vergleich zu der optimalen langsam gefrierenden Kryokonservierungsmethode in der Literatur. Hier werden die umfassenden Methoden der Massentropfenverglasung und detaillierte Einblicke in die praktischen Aspekte der Verfahren gegeben.
Mehrere Schritte im Protokoll sind von entscheidender Bedeutung und erfordern zusätzliche Aufmerksamkeit. Die Befüllung des Dewar mit nicht sterilisiertem flüssigem Stickstoff führt potenziell zu halbsterilen Bedingungen. Mit den im Protokoll erläuterten Vorsichtsmaßnahmen wurde während unserer langfristigen Kollagen-Sandwichkulturen keine Kontamination festgestellt. Bei Bedarf können jedoch zusätzliche Sterilisationsmaßnahmen ergriffen werden. Flüssigstickstoff kann durch Strahlung oder Filterung16 sterilisiert werden und das System kann mit einem Deckel auf dem flüssigen Stickstoff Dewar mit einem Mitihm, der mit der Mischnadel verbunden ist, vollständig geschlossen werden. Alternativ können berührungslose Tropfenverglasungsmethoden untersucht werden, obwohl dies einen größeren Volumendurchsatz14begrenzen kann.
Weitere wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die CPA-Vor- und Entladeinkubationsdauern. Längere Dauern können zu toxischen CPA-Verletzungen führen, während kürzere Dauern zu osmotischen Verletzungen führen können. Außerdem ist es wichtig sicherzustellen, dass die verglasten Hepatozytentröpfchen immer unter der Glasübergangstemperatur bleiben, da eine unkontrollierte makro- und mikroskopische Eiskernbildung bei höheren Temperaturen zu schweren Hepatozytenverletzungen und Zelltod führt. Aus praktischer Sicht ist der wichtigste Schritt bei der Verglasung von Bulk-Tröpfchen die Wiedererwärmung der verglasten Hepatozytentröpfchen. Wenn die verglasten Tröpfchen aus dem flüssigen Stickstoff entfernt werden, können sie innerhalb von Sekunden einfrieren, wenn sie nicht schnell durch sofortigeZugabe der Warmwärmelösung wieder aufgewärmt werden.
Zukünftige Optimierung der Bulk-Droplet-Verglasung könnte die Erhaltungsergebnisse weiter verbessern, wie die Lebensfähigkeit, Ertrag und metabolische Funktion. Sowohl durchlässige als auch nicht durchlässige CPAs könnten getestet werden, um die osmotische Dehydrierung vor der Vitrifizierung zu optimieren. Dies könnte den osmotischen Schock während der Dehydrierung reduzieren und auch die vorbebrütenten CPA-Konzentrationen verringern. Darüber hinaus würde eine kontinuierliche Fluidisierung, anstatt batchweise, CPA-Vorinkubation theoretisch die Verglasung unbegrenzter Zellmengen ermöglichen. Da nur allgemeine Laborgeräte für die Massentropfenverglasung benötigt werden, handelt es sich um eine einfache und kostengünstige Konservierungsmethode, die möglicherweise zur Konservierung anderer Zelltypen verwendet werden könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Drs. de Vries, Weng, Toner, Tessier und Uygun haben vorläufige Patentanmeldungen, die für diese Studie relevant sind. Dr. Uygun hat ein finanzielles Interesse an Organ Solutions, einem Unternehmen, das sich auf die Entwicklung von Organkonservierungstechnologie konzentriert. Alle Interessen von Forschern werden von der MGH und Partners HealthCare in Übereinstimmung mit ihrer Interessenkonfliktpolitik verwaltet.
Acknowledgments
Die Finanzierung durch die US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 und R01DK114506) und das US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wird sehr anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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