Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कारोठ निकायों में लेप्टिन सिग्नलिंग की जांच करने के लिए प्रायोगिक दृष्टिकोण और श्वास के नियंत्रण पर इसके प्रभाव

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60298
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Summary

हमारा अध्ययन हाइपोक्सि वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया (एचवीआर) पर कैरोटीड बॉडी (सीबी) में लेप्टिन सिग्नलिंग के प्रभाव पर केंद्रित है। हमने सीबी डेनेरवाटियन और सीबी में लेप्टिन रिसेप्टर के ओवरएक्सप्रेशन के बाद एचवीआर को मापने वाले 'फंक्शन के नुकसान' प्रयोगों का प्रदर्शन किया।

Abstract

एक एडिपोसाइट-उत्पादित हार्मोन लेप्टिन एक शक्तिशाली श्वसन उत्तेजक है, जो मोटापे में श्वसन समारोह की रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। ग्रीवा निकायों (सीबी), परिधीय hypoxic संवेदनशीलता का एक प्रमुख अंग, लेप्टिन रिसेप्टर के लंबे कार्यात्मक आइसोफॉर्म व्यक्त (LepRख) लेकिन सांस लेने के नियंत्रण में लेप्टिन संकेतन की भूमिका पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। हम पहले और आधार रेखा पर लेप्टिन जलसेक के बाद और सीबी denervation के बाद C57BL/6J चूहों में hypoxic वेंटीलेटर प्रतिक्रिया (HVR) (1) की जांच की; (2) लेपरबीमें कमी मोटापे से ग्रस्त db/db चूहों आधार रेखा पर और CBs में LepRबी overexpression के बाद. C57BL/6J चूहों में, लेप्टिन ने एचवीआर में वृद्धि की और एचवीआर पर लेप्टिन के प्रभाव को सीबी डेनरवटन द्वारा समाप्त कर दिया गया। db/db चूहों में, सीबी में LepRबी अभिव्यक्ति HVR संवर्धित. इसलिए, हम निष्कर्ष है कि leptin सीबी में कार्य करता है hypoxia के लिए प्रतिक्रियाओं में वृद्धि.

Introduction

एक एडिपोसाइट का उत्पादन हार्मोन लेप्टिन भोजन के सेवन को दबाने और चयापचय दर बढ़ाने के लिए हाइपोथैलेमस में कार्य करता है। हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन कियाअध्ययन 1,2 और अन्य जांचकर्ताओं द्वारा3,4 से पता चला कि leptin hypercapnic वेंटीलेटर प्रतिक्रिया बढ़ जाती है (HVR) leptin में मोटापा hypoventilation को रोकने मोटापा कम है. तथापि, अधिकांश मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों में उच्च प्लाज्मा लेप्टिन स्तर होते हैं और हार्मोन5,6,7,8के चयापचय और श्वसन प्रभावों के प्रति प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं . लेप्टिन के लिए प्रतिरोध बहुकारक है, लेकिन लेप्टिन के लिए रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की सीमित पारगम्यता एक प्रमुख भूमिका निभाता है। हम प्रस्ताव है कि लेप्टिन परिधीय hypoxic संवेदनशीलता का एक प्रमुख अंग में BBB के नीचे कार्य करता है, carotid निकायों (सीबी), मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों में सांस लेने की रक्षा के लिए. सीबी एलप्टिन रिसेप्टर, लेप्आरखके लंबे कार्यात्मक समरूप को व्यक्त करता है, लेकिन लेप्टिन के श्वसन प्रभाव में सीबी की भूमिका पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं की गई है9,10.

हमारी विधि का लक्ष्य HVR पर सीबी में लेप्टिन संकेतन के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था। हमारा तर्क प्रदर्शन करने के लिए किया गया था (क) कार्य प्रयोगों की हानि बरकरार carotid निकायों और denervated carotid निकायों HVR माप के बाद के साथ चूहों में leptin infusing; (ख) डीबी/डी बी चूहों में एलईपीआरखकी कमी वाले कार्य प्रयोगों का लाभ, जिसमें हमने एचवीआर को आधार रेखा पर और लेपआरख की अभिव्यक्ति के बाद विशेष रूप से सीबी में मापा। हमारी तकनीक का लाभ यह था कि हम नींद और जागना के दौरान अनियंत्रित unanesthetized चूहों में हमारे सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया. पिछले जांचकर्ताओं ने या तो संज्ञाहरण9 के तहत अपने प्रयोगों का प्रदर्शन किया या नींद10के दौरान लेप्टिन के प्रभाव को मापता नहीं था . इसके अलावा, हमारे अध्ययन के ऊपर वर्णित सीबी में चयनात्मक LepRबी अभिव्यक्ति के साथ समारोह दृष्टिकोण का एक अनूठा लाभ का उपयोग करने के लिए पहली बार है।

व्यापक संदर्भ में, हमारे दृष्टिकोण अन्य सीबी में व्यक्त रिसेप्टर्स और hypoxic संवेदनशीलता में उनकी भूमिका के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है. जांचकर्ताओं ब्याज की एक रिसेप्टर के लिए एक ligand infuse और आधार रेखा पर और सीबी denervation के बाद HVR उपाय कर सकते हैं. एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, ब्याज की एक रिसेप्टर सीबी और HVR माप में overexpressed किया जा सकता है पहले और overexpression के बाद हमारी इस पांडुलिपि में वर्णित प्रौद्योगिकी का उपयोग कर.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (MO18M211) द्वारा सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अनुमोदित कर दिया गया है।

1. लेप्टिन इन्फ्यूजन

नोट: आदेश में सांस लेने पर लेप्टिन के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम एक परासरणी पंप द्वारा दुबला C57BL/6J चूहों में leptin subcutaneously संचार उन मोटापे से ग्रस्त चूहों में मनाया उन लोगों के लिए लेप्टिन के स्तर को बढ़ाने के लिए.

  1. परासरणी पंप तैयार करना
    1. भरी हुई समाधान के शुद्ध वजन की जांच करने के लिए खाली पंप वजन।
    2. परासरणी पंप (1 डिग्री एल/ज 3 दिनों के लिए) में लेप्टिन (5 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें। एक छोटे सिरिंज (1 एमएल) के साथ पंप भरें। भरने के बाद, प्रदान की कुंद टिप 27 गेज भरने ट्यूब के साथ पंप बंद करो.
      नोट: सिरिंज और संलग्न ट्यूब हवा के बुलबुले से मुक्त होना चाहिए।
    3. भरने के बाद, समाधान के शुद्ध वजन की जांच करने के लिए पंप को फिर से तौलें।
    4. लेप्टिन पंप को इंटरस्कापुलर क्षेत्र में सम्मिलित करें।
      नोट:       यदि आप जलसेक को तुरंत शुरू करना चाहते हैं, तो कम से कम 4 से 6 एच (अधिमानतः रात भर) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ नमकीन में पहले से भरे हुए पंप को इनक्यूबेट करें।

2. Hypoxic वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया (HVR)

नोट: थर्मोन्यूट्रल स्थितियां शांत परिवेश के तापमान द्वारा लगाए गए तनावपूर्ण कारकों को खत्म करते हैं और चूहों में चयापचय को काफी संशोधित करते हैं। अतः सभी श्वसन मापन ताप-न्यूट्रल स्थितियों (ट र् 30 डिग्री सेल्सियस) पर नवजात इनक्यूबेटर12 (चित्र 1क)का उपयोग करते हुए निष्पादित किए जाने चाहिए। पूरे शरीर plethysmography कक्ष (WBP) सभी माप के लिए इस्तेमाल किया गया है. सभी जानवरों को बारोमेट्रिक plethysmography कक्ष के लिए और बाद में पल्स oximetry रिकॉर्डिंग के लिए एक शर्म गर्दन कॉलर के लिए अनुकूल होना चाहिए 3-5 दिन HVR माप से पहले. HVR सुबह 10 बजे से शाम 5 बजे के बीच दर्ज किया जाता है HVR नींद के दौरान दबा दिया जाता है, इसलिए यह नींद और शांत जागना13के दौरान अलग से मापा जा सकता है। HVR माप के दौरान जानवर की विशिष्ट नींद-जाग चरण सुनिश्चित करने के लिए, ईईजी/ईएमजी इलेक्ट्रोड को ईईजी/ईएमजी हेडमाउंट के रूप में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए जैसा कि पहले वर्णित14। पशुओं को हेडमाउंट के बाद कम से कम 72 एच के लिए ठीक होने की अनुमति दी जानी चाहिए। नींद मचान 5 s युगों में किया जाना चाहिए. NREM नींद धीमी लहर ईईजी गतिविधि युग के 50% से अधिक कब्जा द्वारा मान्यता प्राप्त है. शांत जागना आंदोलनों के अभाव में अल्फा ईईजी गतिविधि द्वारा प्रकट होता है। रेम नींद EMG पर कम मांसपेशी टोन की उपस्थिति में प्रमुख अल्फा और थीटा ईईजी गतिविधि द्वारा की पहचान की है. आमतौर पर, रेम नींद HVR गैस चुनौतियों के दौरान मनाया नहीं है.

  1. HVR रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल
    1. निम्न आकार के WBP कक्ष का उपयोग करें: 80 मिमी के आंतरिक व्यास, 50.5 मिमी की ऊंचाई, और 0.4 एल की मात्रा. डब्ल्यूबीपी कक्ष में दो कक्ष, सील और संदर्भ कक्ष होते हैं, और माउस14 (चित्र 1ठ)रखने के लिए एक वृत्ताकार मंच होता है। कक्ष के अंदर अंतर्वाह और बहिर्वाह वायुमंडलीय दबाव को बनाए रखने के सकारात्मक और नकारात्मक दबाव स्रोतों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं। यह नियंत्रण कक्ष में एक स्थिर पूर्वाग्रह प्रवाह बनाता है और सीओ2 प्रतिधारण रोकता है. WBP सेट अप के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Hernandez और सहकर्मियों15देखें.
    2. कक्ष के अंदर तापमान और WBP में माउस रखने से पहले कमरे में सापेक्ष आर्द्रता को मापने.
    3. शरीर के वजन और गुदा तापमान को मापने।
    4. माउस की गर्दन के चारों ओर oximeter कॉलर रखो (क्षेत्र पहले मुंडा किया जाना चाहिए).
    5. WBP के अंदर माउस प्लेस और सुनिश्चित करें कि कक्ष पूरी तरह से हवा के रिसाव से बचने के लिए बंद कर दिया है.
    6. माउस शांत है और कक्ष एक निरंतर मात्रा में है जब तक लगभग 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
    7. Normoxia: 30 मिनट के बाद, अगर माउस शांत है, श्वसन संकेतों और परिधीय ऑक्सीजन संतृप्ति रिकॉर्डिंग शुरू (SPO2) normoxia चरण पर (21% FiO2 दबाव के 1 बजे) के लिए 20 मिनट, LabChart 7 प्रो (संस्करण 7.2) का उपयोग कर.
    8. Hypoxia: शांत normoxia के 20 मिनट के बाद, तीव्र hypoxia और SPO2के पहले चक्र रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं. hypoxia चरण के लिए, एक निरंतर मिश्रित गैस प्रवाह 10% ओ2 और 3% सीओ2 द्वारा 5 मिनट के लिए बना करने के लिए जानवरों को बेनकाब.
      1. hypoxia के पहले 30 सेकंड के दौरान, मिश्रित गैस के आधार पर 2 छोटे पक्ष बंदरगाहों के माध्यम से कक्ष के माध्यम से बहती है FiO2 से ड्रॉप करने के लिए अनुमति 21% (दाब के 1 atm पर) 10% करने के लिए.
      2. प्रारंभिक 30 s के बाद, WBP कक्ष के छोटे पक्ष बंदरगाहों में से एक बंद करें और 10% FiO2 पर 5 मिनट के लिए निरंतर hypoxia पर रिकॉर्डिंग रखने के लिए.
        नोट: hypoxia पर 10% हे2 और 3% सीओ2 का मिश्रण यूकेपनेया11को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    9. hypoxia के 5 मिनट के बाद, कमरे में हवा के लिए माउस को फिर से बेनकाब (21% FiO2 दबाव के 1 atm पर) प्रवाह स्रोत स्विचन द्वारा.
    10. वेंटीलेटर रोल-ऑफ घटना से बचने के लिए पिछले hypoxic जोखिम से उबरने के लिए अगले normoxia रिकॉर्डिंग तक कम से कम 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें (यानी, hypoxia16के दौरान सांस लेने के केंद्रीय दमन )।
      नोट: माप की पुनरुक्ति को आश्वस्त करने के लिए प्रत्येक माउस में तीन बार नॉर्मोक्सिया/हाइपोक्सिया चक्र दोहराएँ। हमारे अनुभव में, अतिरिक्त (एक दिन पर 3 बार से अधिक) hypoxic जोखिम से बचा जाना चाहिए, वेंटीलेटरी अनुकूलन की वजह से (रोल-ऑफ घटना).
    11. प्रयोग के अंत में, कक्ष के आधार पर छोटे पक्ष बंदरगाहों में से एक में खामियों को दूर एक सिरिंज के साथ कमरे हवा के 1 एमएल इंजेक्शन द्वारा WBP कक्ष (माउस के साथ अभी भी अंदर है) जांचना.
    12. इसके अंदर जानवर के साथ फिर से कक्ष में तापमान को मापने।
    13. कक्ष खोलें और इसे अपने घर पिंजरे में वापस रखने से पहले माउस के गुदा तापमान को मापने।
  2. HVR गणना
    1. 1,000 हर्ट्ज (प्रति चैनल नमूना आवृत्ति) पर HVR गणना के लिए सभी संकेतों Digitize.
      नोट: WBP ज्वारीय मात्रा विश्लेषण प्रयोगशाला चार्ट 7 में Drorbaugh और फेन समीकरण17के आधार पर किया जाता है. आवश्यक चर माउस गुदा तापमान और कक्ष तापमान (पहले और HVR माप के बाद), सापेक्ष आर्द्रता, और कक्ष गैस स्थिरांक शामिल हैं. यह स्थिरांक अंशांकन चरण में हवा के 1 एमएल इंजेक्शन के बाद WBP दबाव विक्षेप से परिणामी है। अधिक जानकारी के लिए, Hernandez और सहकर्मियों15देखें.
    2. Drorbaugh और फेन समीकरण की गणना करने के बाद, स्थिरांक से ज्वारीय आयतन (Vt) कक्ष चैनल गुणा.
    3. विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग का चयन
      1. Normoxia: लगातार ज्वारीय मात्रा के साथ स्थिर साँस लेने के केवल वर्गों का चयन करें. माउस के आंदोलनों के करीब निकटता में वर्गों से बचें.
      2. Hypoxia: पहले 30 s छोड़ें जब ओ2 के स्तर 21% से 10% तक गिर रहे हैं, 30 s से 2 मिनट के लिए 10% हे2 जोखिम (एक 90 s अंतराल) से वर्गों का चयन करें. इस अंतराल के भीतर, स्थिर ज्वारीय आयतन के साथ स्थिर श्वास के साथ केवल अनुभागों का चयन करें। माउस के आंदोलनों के करीब निकटता में वर्गों से बचें. विश्लेषण विश्वसनीय है अगर hypoxia के कम से कम 10 s प्रत्येक चक्र में चुना जाता है.
        नोट: सीबी द्वारा शासित कीमोरेफ्लेक्स का परिधीय घटकजोखिम 16,18,19के पहले 1-2 मिनट के दौरान प्रबल होता है . दूसरे चरण के दौरान, के बीच 2 मिनट और hypoxic जोखिम के 5 मिनट, दोनों परिधीय और केंद्रीय घटक एक भूमिका निभाते हैं. अंत में, तीसरे चरण, और 5 मिनट, hypoventilation (रोल-ऑफ घटना) मुख्य रूप से केंद्रीय chemoceptors द्वारा नियंत्रित की विशेषता है. हमारे अनुभव से पता चलता है कि चूहों अक्सर airflow स्रोत में मैनुअल स्विच की वजह से hypoxic प्रदर्शनी के दौरान जाग रहे हैं.
    4. चयन के बाद, सूत्र टम् - श्वसन दर X ज्वारीय आयतन का उपयोग करते हुए नॉर्मोक्सिक और हाइपोक्सिक स्थितियों में माध्य सूक्ष्म वेंटिलेशन (VE) की गणना करें।
    5. नॉर्मोक्सिया तथा हाइपोक्सिया स्थितियों में माध्य स्पो2 की गणना कीजिए।
    6. HVR की गणना मैन्युअल रूप से सूत्र HVR का उपयोग कर ( VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) - SPO2 (21% O2))।
      नोट: C57BL/6J चूहों में, लेप्टिन जलसेक के लिए परासरणी पंप गर्दन कॉलर द्वारा सटीक SpO2 संकेत का पता लगाने ख़राब कर सकते हैं। इस स्थिति में, एचवीआर की गणना नोमोक्सिक तथा हाइपोक्सिक स्थितियों पर FiO2 मानों के आधार पर की जाती है क्योंकि HVR]V E / ]FiO211.

3. ग्रीवा शारीरिक Denervation या Carotid साइनस तंत्रिका विच्छेदन (CSND)

नोट: हम संयुक्त शल्य चिकित्सा और रासायनिक denervation एक सप्ताह के अलावा प्रदर्शन किया, क्योंकि शल्य चिकित्सा denervation अकेले hypoxic chemoreflex को समाप्त नहीं करता है.

  1. सर्जिकल तैयारी
    1. वयस्क पुरुष C57BL/6J चूहों पर सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें। सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों बाँझ. बाँझ सर्जिकल दस्ताने, सिरिंज और कपास टिप applicators का प्रयोग करें।
    2. एक नाक शंकु का उपयोग कर 1-2% isoflurane के साथ पुरुष C57BL/6J चूहों एनेस्थेटाइज और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक गर्म कंबल जगह है। आइसोफ्लुरेन को 1 हर्ट्ज (60 सांसों/मिनट) पर श्वसन दर बनाए रखने के लिए सावधानी से अनुचित किया जाता है। सर्जरी शुरू करने से पहले संज्ञाहरण की पर्याप्तता का मूल्यांकन सांस लेने की आवृत्ति, आंदोलनों और श्रव्य शोर की अनुपस्थिति, स्पर्श उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया के अभाव और फोरलिम्ब या हिंडलिम्ब पेडल वापसी पलटा द्वारा किया जाएगा।
    3. दर्द की परेशानी को रोकने के लिए बुप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम/किग्रा) को आंतरिक रूप से प्रशासित करें। गर्दन के अधर क्षेत्र में बालों को निकालें और betadine और शराब के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित.
    4. कॉर्निया शुष्कता को रोकने के लिए, संज्ञाहरण के दौरान बाँझ नेत्र मरहम के साथ चूहों की आंखों को चिकना करना।
  2. CSND प्रक्रियाएं
    चरण 1: सर्जिकल denervation
    1. मिडलाइन चीरा के बाद, संयोजी ऊतकों और वसा ऊतकों को हटाने के द्वारा आम ग्रीवा धमनियों के विभाजन का पर्दाफाश.
    2. हाइपोग्लोसियल तंत्रिका की पहचान करें, जो आमतौर पर बहुत प्रमुख है, और फिर इसे उठाकर तुरंत नीचे ग्लॉसोफैरिन्शनल तंत्रिका को उजागर करें। सूक्ष्म स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके ग्रीवा साइनस नसों को द्विपक्षीय रूप से अलग करें।
    3. 6-0 रेशम सीवन के साथ चीरा बंद करो.
    4. निर्जलीकरण को रोकने के लिए सामान्य लवण के 1 एमएल को व्यवस्थित करें।
    5. एक वसूली कक्ष में चूहों घर और उनके व्यवहार की निगरानी हर 15 मिनट के लिए प्रारंभिक 1 एच जब तक चूहों चेतना हासिल करने के लिए कठोर recumbency बनाए रखने के लिए. चूहों को पूरी तरह से ठीक होने के बाद उनके घर के पिंजरों में वापस लौटें। अगले 3 दिनों के लिए प्रति दिन दो बार चूहों की निगरानी रखें। यदि चूहे दर्द के किसी भी लक्षण दिखाते हैं (जैसे, कम भूख, बेचैनी)।
      चरण 2: रासायनिक denervation
    6. सर्जरी के एक सप्ताह बाद, सीबी के कपाल पोल के लिए ग्लॉसोफैरिनल तंत्रिका से शाखाओं के बिंदुओं पर इथेनॉल में पतला 2% फीनॉल के समाधान के साथ ग्रीवा धमनी को पेंट करें। शल्य चिकित्सा denervation अनुभाग में ऊपर वर्णित के रूप में रासायनिक denervation के बाद एक ही पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल प्रदान की जानी चाहिए।
      नोट: एक शर्म सर्जरी समूह के लिए, एक ही प्रक्रियाcarotid साइनस तंत्रिका विच्छेदन को छोड़कर प्रदर्शन कर रहे हैं.
    7. जानवरों HVR माप से पहले 5-7 दिनों के लिए ठीक हो.

4. सीबी में लेपरख की अभिव्यक्ति एक एडेनोवायरल वेक्टर का उपयोग करते हुए (विज्ञापन-लेपरख) बनाम नियंत्रण (विज्ञापन-लाख )

  1. विज्ञापन-LepRबी और विज्ञापन-Lac$ निलंबन
    1. डीनोवायरस के साथ चूहों को ट्रांसफेक्ट करें(विज्ञापन-लेपआरबी-जीएफपी, 2-5x1010 pfu/mL overexpression के लिए, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/
    2. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में बर्फ में शीशी को डुबोकर मैट्रिगेल मैट्रिक्स को थपथपाओ।
    3. तरल मैट्रिगेल मैट्रिक्स में एडेनोवायरस को 1:5 (1 $L की मैट्रिगेल मैट्रिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर लागू किया गया द्विपक्षीय रूप से) निलंबित करें।
    4. हमेशा बर्फ पर वायरल निलंबन रखने के लिए जब तक यह सीबी में लागू किया जाता है.
  2. सर्जिकल तैयारी
    1. CSND प्रोटोकॉल के रूप में एक ही शल्य चिकित्सा उपकरणों का प्रयोग करें.
    2. एनेस्थेटाइज लेपआरबी-डेभलपमट डी बी/डीबी चूहों के साथ 2-2.5% आइसोफ्लुरेन नाक शंकु का उपयोग करते हुए और जानवरों को हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए गर्म कंबल पर रखें। आइसोफ्लुरेन को 1 हर्ट्ज (60 सांसों/मिनट) पर श्वसन दर बनाए रखने के लिए सावधानी से अनुचित किया जाता है। संज्ञाहरण की पर्याप्तता का मूल्यांकन श्वास आवृत्ति, आंदोलनों और श्रव्य शोर ों की अनुपस्थिति, स्पर्श उत्तेजनाओं के प्रति प्रतिक्रिया के अभाव और फोरलिम्ब या हिंदलिम्ब पेडल वापसी पलटा द्वारा किया जाएगा।
    3. प्रशासन buprenorphine (0.05 मिलीग्राम/kg) intraperitoneally.
    4. गर्दन के अधर क्षेत्र में बालों को निकालें और CSND प्रोटोकॉल के रूप में betadine और शराब के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित.
    5. कॉर्निया शुष्कता को रोकने के लिए, संज्ञाहरण के दौरान बाँझ नेत्र मरहम के साथ चूहों की आंखों को चिकना करना।
  3. सीबी के एडिनोवायरस उपचार
    1. सीएसएनडी प्रोटोकॉल में वर्णित सीबी को उजागर करें और द्विपक्षीय रूप से सीबी क्षेत्र में वायरल निलंबन के 5 डिग्री सेल्सियस लागू करें।
    2. 2-3 मिनट रुको जब तक तरल Matrigel मैट्रिक्स एक जेल हो जाता है. इस बात की पुष्टि करने के बाद कि वायरल निलंबन congealed था, 6.0 रेशम सीवन के साथ चीरा बंद करें।
  4. सर्जरी के बाद
    1. एक वसूली कक्ष में चूहों घर और उनके व्यवहार की निगरानी हर 15 मिनट के लिए प्रारंभिक 1 एच जब तक चूहों चेतना हासिल करने के लिए कठोर recumbency बनाए रखने के लिए. चूहों को पूरी तरह से ठीक होने के बाद उनके घर के पिंजरों में वापस लौटें। अगले 3 दिनों के लिए प्रति दिन दो बार चूहों की निगरानी रखें। यदि चूहे दर्द के किसी भी लक्षण दिखाते हैं (जैसे, कम भूख, बेचैनी)।
    2. बाद की अवधि के दौरान दर्द की परेशानी को रोकने के लिए आवश्यक के रूप में Buprenorphine (0.05 मिलीग्राम/kg) इंट्राperitoneally प्रशासन।
    3. एडेनोवायरस ट्रांसफेक्शन के 9 दिनों के बाद एचवीआर को मापें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

लेप्टिन के निरंतर जलसेक में काफी वृद्धि हुई HVR दुबला C57BL/6J चूहों में 0.23 से 0.31 mL/min/g/[FiO2 (P और lt; 0.001, चित्रा 2)11. CSND HVR में लेप्टिन प्रेरित वृद्धि को समाप्त कर दिया (चित्र 2),जबकि HVR पर CSND का कोई क्षीण प्रभाव leptin जलसेक के बाद शर्म सर्जरी समूह में मनाया गया.

लेपRबीके सीबी में लेपरबी अभिव्यक्ति - कमी मोटापे से ग्रस्त db/db चूहों HVR में एक महत्वपूर्ण वृद्धि से प्रेरित 0.05 से 0.06 mL/min/g/[SpO2 (चित्र 3). सीबी में नियंत्रण विज्ञापन-Lac$ के साथ transfected जानवरों में, HVR नहीं बदला.

Figure 1
चित्रा 1: HVR माप. प्रयोग थर्मोन्यूट्रल परिस्थितियों में किया जाना चाहिए (ए) एक नवजात इनक्यूबेटर 30 डिग्री सेल्सियस पर और एक (बी) पूरे शरीर plethysmography कक्ष में दर्ज कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लेप्टिन ने हाइपोक्सिक वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया (एचवीआर) को संवर्धित किया और C57BL/6J चूहों में कैरोटीड साइनस तंत्रिका विच्छेदन (CSND) द्वारा प्रभाव को समाप्त कर दिया गया। यह आंकड़ा Caballero-Eraso एट अल11से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र3: LepRb अभिव्यक्ति carotid निकायों में (सीबी) LepRb-कमी db/db चूहों hypoxic वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया (HVR) में वृद्धि हुई. यह आंकड़ा Caballero-Eraso एट अल11से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमारे अध्ययन का मुख्य ध्यान सीबी में लेप्टिन संकेतन के श्वसन प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था। एक मशीनी फैशन में लेप्टिन की भूमिका का आकलन करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। सबसे पहले, HVR के लिए सीबी के विशिष्ट योगदान hypoxic जोखिम के पहले 2 मिनट के दौरान HVR के सावधान परिमाणीकरण द्वारा विश्लेषण किया गया था. दूसरा, लेप्टिन-मध्यस्थ में सीबी की प्रासंगिकता की दो पूरक दृष्टिकोणों द्वारा श्वास नियंत्रण के विनियमन की जांच की गई। कम लेप्टिन के स्तर के साथ दुबला जंगली प्रकार चूहों में, HVR आधार रेखा पर और लेप्टिन के निरंतर जलसेक के बाद मापा गया था; यह प्रयोग सीबी-डेनेर्शन के बाद दोहराया गया था। LepRb-कमी db/db चूहों में, HVR आधार रेखा पर और सीबी में LepRबी अभिव्यक्ति के बाद मापा गया था.

कई प्रोटोकॉल कृन्तकों में HVR को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, hypoxic गैसों के लिए जानवरों को उजागर. हम परिधीय chemoreflex में सीबी की भूमिका और सांस लेने के नियंत्रण पर सीबी में लेप्टिन के प्रभाव की जांच करने के लिए एक HVR प्रोटोकॉल विकसित किया है। सीबी chemoreflex एक अपेक्षाकृत कम समय डोमेन है. हाइपोक्सिया के पहले 1-2 मिनट वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया की तीव्र वृद्धि की विशेषता है जिसके बाद कैरोटीड साइनस तंत्रिका उत्तेजना16,18,19के 2 मिनट के बाद बेसलाइन वेंटिलेशन के लिए धीमी गति से वापसी की जाती है . इस प्रकार, हमारे HVR प्रोटोकॉल में, विश्लेषण hypoxia के पहले 30 s और 10% हे2 जोखिम के 2 मिनट के बीच एक 90 s अंतराल के भीतर आयोजित कर रहे हैं, परिधीय chemoreflex सीबी द्वारा नियंत्रित के वर्चस्व के लिए इसी. यह कम समय विश्लेषण जानवरों में hypoxic वेंटीलेटरी अवसाद से बचा जाता है. हमारे HVR प्रोटोकॉल में, हम भी एक निश्चित 3% सीओ2 हाइपोक्सिया में तनाव का इस्तेमाल किया ताकि तीव्र hypoxic जोखिम11के दौरान hyperventilation द्वारा प्रेरित hypocapnia को दरकिनार करने के लिए. अंत में, हमने चूहों को लगभग 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर रखते हुए निरंतर थर्मोन्यूट्रल परिस्थितियों में एचवीआर प्रोटोकॉल विकसित किया है। हमारे अनुभव से पता चलता है कि हाइपोक्सिया के कम जोखिम चूहों में मलाशय के तापमान को कम कर सकते हैं यदि कमरे के तापमान11पर जोखिम होता है , जबकि तापन्यून्यूसिस में हाइपोक्सिया महत्वपूर्ण चयापचय परिवर्तन12को प्रेरित नहीं करता है .

चूहों में CSND तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि जानवरों और उनके CBs के छोटे आकार की. हम अपने प्रोटोकॉल के सख्त पालन से लगभग 100% जीवित रहने की दर के साथ एक लगातार सफल दृष्टिकोण विकसित किया है. हमारे प्रोटोकॉल में नियंत्रित शर्तों thermoneutral वातावरण, ध्यान से नियंत्रित संज्ञाहरण और दर्द के साथ सतर्क पोस्ट ऑपरेटिव प्रबंधन के रूप में glossopharyngeal तंत्रिका के दृश्य के साथ मानक बाँझ microsurgical तकनीक भी शामिल है नियंत्रण. हमारे अनुभव से पता चलता है कि अकेले शल्य चिकित्सा denervation hypoxic chemoreflex को समाप्त नहीं करता है. दूसरा कदम, रासायनिक denervation, भी सावधान बाद ऑपरेटिव प्रबंधन द्वारा अस्तित्व में सुधार करने के लिए पीछा किया जाता है.

हमारी सबसे नवीन तकनीक सीबी क्षेत्र में चयनात्मक जीन अधिक अभिव्यक्ति है. इस दृष्टिकोण को पहले लागू नहीं किया गया है, क्योंकि CBs के छोटे आकार और विशिष्ट ड्राइवरों की कमी के लिए एक विशेष सेल प्रकार में ब्याज की एक जीन व्यक्त करने की अनुमति. वास्तव में, प्रकार I सीबी कोशिकाओं बहुत सहानुभूति न्यूरॉन्स या अधिवृक्क मेडुला की कोशिकाओं के समान हैं, जबकि प्रकार द्वितीय कोशिकाओं astrocytes20,21के समान हैं. हम db/db चूहों का लाभ उठाया, जो LepRबी जीन की कमी, लगभग विशेष रूप से सीबी क्षेत्र के लिए एडेनोवायरल निलंबन लागू करने की हमारी क्षमता, और Matrigel मैट्रिक्स के गुण, जो तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर solidifies. हमारे उपन्यास दृष्टिकोण भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है किसी भी जीन की एक भूमिका का अध्ययन करने के लिए पूरे शरीर tyrosine hydroxylase विशिष्ट (प्रकार मैं कोशिकाओं) या GFAP विशिष्ट (प्रकार द्वितीय कोशिकाओं) knockouts के साथ चूहों का उपयोग सीबी में व्यक्त की एक भूमिका का अध्ययन.

हमारे प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, हम 3% सीओ2 का इस्तेमाल किया HVR निर्धारित करने के लिए और सवाल खुला रहता है अगर HVR के अंश वास्तव में hypercapnic प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. आदेश में इस सीमा को संबोधित करने के लिए, जांचकर्ताओं को एक साथ 3% सीओ2 hyperoxic गैस में संतुलित प्रतिक्रियाओं को मापने कर सकते हैं, जो सीबी बंद हो जाएगा. दूसरा, HVR पूरी तरह से CSND22द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है. इस घटना neuroplasticity के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो चूहों में विशेष रूप से प्रमुख है. इसलिए, यह CSND के बाद जितनी जल्दी हो सके HVR का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है और हमेशा शर्म सर्जरी नियंत्रण का उपयोग करें। तीसरा, हमारे सीबी जीन अभिव्यक्ति दृष्टिकोण सेल प्रकार और अंग विशिष्टता का अभाव था. अधिक चयनात्मक प्रमोटरों के भविष्य के उपयोग के साथ आणविक तकनीक इस सीमा का मुकाबला करने में मदद कर सकती है।

अंत में, ऊपर सीमाओं का वर्णन करने के बावजूद, संयोजन में हमारे प्रोटोकॉल hypoxia के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट सीबी जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों कोई परस्पर विरोधी हितों या प्रकटीकरण है.

Acknowledgments

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Insulin Syringes BD Biosciences 309311
1x PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023 500 ml
Ad-Lacz Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) 1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP Vector Biolabs ADV-263380 2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart Atlantic Biomedical
Betadine Purdue Products Ltd. 12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 0.3 mg/mL
C57Bl/6J Jackson laboratory 000664 Mice Strain
Cotton Gauze Sponges Fisherbrand 22-362-178
db/db Jackson laboratory 000697 Mice Strain
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Isoflurane Vetone 502017
Lab Chart Data Science International (DSI) Software
Matrigel Matrix BD Biosciences 356234
Micro Spring Scissors World Precision Instruments (WPI) 14124
Mouse Ox Plus STARR Life Sciences Corp. Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor STARR Life Sciences Corp. 015022-2 Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber Data Science International (DSI) PLY3211
Ohio Care Plus Incubator Ohmeda HCHD000173
Operating Scissors World Precision Instruments (WPI) 501753-G Straight
Osmotic Pump Alzet 1003D 1 μL/h, 3 days
Phenol Sigma-Aldrich P4557
Recombinant Mouse Leptin protein R&D systems 498-OB-05M 5 mg
Saline RICCA Chemical 7210-16 0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture DemeTech DT-639-1 Silk, size 6-0
Thermometer Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) EW 20250-91

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'donnell, C. P., et al. Leptin prevents respiratory depression in obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).
  2. Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
  3. Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
  4. Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
  5. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
  6. Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
  7. Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
  8. Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
  9. Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
  10. Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
  11. Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
  12. Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
  13. Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
  14. Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
  15. Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
  16. Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
  17. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
  18. Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
  19. Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
  20. Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
  21. Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
  22. Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).

Tags

जीव विज्ञान अंक 152 लेप्टिन ग्रीवा शरीर हाइपोक्सिक वेंटीलेटरी प्रतिक्रिया ग्रीवा साइनस तंत्रिका वायरल वेक्टर मोटापा
कारोठ निकायों में लेप्टिन सिग्नलिंग की जांच करने के लिए प्रायोगिक दृष्टिकोण और श्वास के नियंत्रण पर इसके प्रभाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shin, M. K., Kim, L. J.,… More

Shin, M. K., Kim, L. J., Caballero-Eraso, C., Polotsky, V. Y. Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing. J. Vis. Exp. (152), e60298, doi:10.3791/60298 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter