Summary
Målet med denne protokol var at udvikle en murine model af lav-niveau toksin eksponering, der ikke forårsager åbenlys leverskade, men snarere forværrer præ-eksisterende leverskader. Dette paradigme bedre rekapitulerer menneskelig eksponering og de subtile ændringer, der opstår ved udsættelse for toksin koncentrationer, der betragtes som sikre.
Abstract
Vinylchlorid (VC), et rigeligt miljøforurenende stof, forårsager steatohepatitis på højt niveau, men betragtes som sikkert på lavere niveauer. Selv om flere undersøgelser har undersøgt rollen som VC som en direkte hepatotokgift, konceptet, at VC ændrer følsomhed af leveren til andre faktorer, såsom ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD) forårsaget af højt fedtindhold kost (HFD) er roman. Denne protokol beskriver et eksponerings paradigme til at evaluere virkningerne af kronisk, lavt niveau eksponering for VC. Mus akklieres til fedtfattig eller fedtfattig diæt en uge før begyndelsen af inhalations eksponeringen og forbliver på disse diæter i hele eksperimentet. Mus er udsat for VC (sub-OSHA niveau: < 1 ppm) eller rum luft i inhalations kamre i 6 timer/dag, 5 dage/uge, i op til 12 uger. Dyrene overvåges ugentligt for kropsvægt øgning og fødeindtagelse. Denne model af VC eksponering forårsager ingen åbenlys leverskade med VC indånding alene. Men, kombinationen af VC og HFD betydeligt forbedrer leversygdom. En teknisk fordel ved denne Co-eksponering model er hele kroppen eksponering, uden tilbageholdenhed. Desuden ligner betingelserne nærmere en meget almindelig menneskelig situation for en kombineret eksponering for VC med underliggende ikke-alkoholiske fedt leversygdom og støtter derfor den nye hypotese, at VC er en miljømæssig risikofaktor for udviklingen af leverskader som en komplikation af fedme (dvs., NAFLD). Dette arbejde udfordrer paradigmet om, at de nuværende eksponeringsgrænser for VC (erhvervsmæssig og miljømæssig) er sikre. Brugen af denne model kan kaste nyt lys og bekymring på risiciene ved VC eksponering. Denne model af toksisk stof induceret leverskade kan anvendes til andre flygtige organiske forbindelser og til at studere andre interaktioner, der kan påvirke leveren og andre organ systemer.
Introduction
Talrige giftstoffer er til stede i den luft, vi indånder på meget lave niveauer. Vinylchlorid (VC) er monomerisk gas, der anvendes af industrien til at skabe polyvinylchlorid (PVC) plastprodukter1. Det er en fremherskende miljømæssig hepatotoktoksisk, kendt carcinogen, og er rangeret #4 på ATSDR farligt stof prioriteret liste2. For bedre at forstå de toksiske virkninger på menneskers sundhed og samspillet med eksisterende Co-morbiditeter er det afgørende at fastsætte modeller for eksponering, der efterligner menneskers eksponering. Den primære interesse for denne gruppe er at studere de hepatiske virkninger af kronisk VC eksponering ved lave koncentrationer. VC udøver sine vigtigste virkninger på leveren, hvor det er blevet påvist (ved høje koncentrationer) at forårsage steatosis, og toksisk-associeret steatohepatitis (TASH) med nekrose, fibrose, cirrhose3,4, samt hepatocellulært karcinom (HCC) og den ellers ekstremt sjældne hepatiske hemangiosarcoma5. TASH har sandsynligvis eksisteret i befolkningen i årtier, men forblev ukarakteriseret og undervurderet af forskerne4,6. Som et resultat af forskning, der påviser de direkte toksicitets problemer for VC-eksponeringen, sænkede Arbejdsmiljøstyrelsen (OSHA) den acceptable eksponerings tærskel til 1 ppm over en 8 h arbejdsdag7. Selv om eksponerings tærsklen er blevet sænket, er virkningen af denne koncentration af VC på menneskers sundhed uklar7. Desuden, virkningen af VC eksponering på eksisterende komorbiditeter, såsom leversygdom, er stort set ukendt8. Denne videnkløft er især vigtig i dag på grund af den stigende globale udbredelse af ikke-alkoholiske fedt leversygdom (nalfd)4,6,7,9,10,11,12. Vigtigere, VC har for nylig vist sig at være en uafhængig risikofaktor for leversygdom fra andre årsager13. Formålet med denne protokol var derfor at udvikle en relevant inhalations model for eksponering for det flygtige miljø toksisk stof, VC i forbindelse med underliggende leverskade, at efterligne menneskelig eksponering og identificere potentielle, nye mekanismer af VC-induceret eller VC-forbedret leverskade.
Den vigtigste eksponeringsvej for mange miljøgifte og forurenende stoffer er via inhalation. Når inhaleret, stoffet kan indtaste systemisk cirkulation gennem lungerne, rejse til leveren, og blive metabolisk aktiveret af hepatiske enzymer forud for at blive udskilt14,15,16. Det er ofte disse aktive metabolitter, der forårsager toksicitet og skader i kroppen. Tidligere undersøgelser af denne gruppe og andre har brugt VC metabolitter som surrogater for udsættelse for VC gas17,18. Andre grupper har brugt inhalations modeller af VC; imidlertid blev der gennemført ekstremt høje eksponeringsniveauer (> 50 ppm) for at inducere akut toksicitet, svær leverskade og tumor udvikling19. Selv om disse undersøgelser har givet afgørende oplysninger og mekanismer af VC-induceret carcinogenicitet, de ikke rekapitulere de subtile virkninger og komplekse interaktioner med andre medvirkende faktorer og derfor er mindre relevante for menneskers eksponering.
Modellen VC-inhalation plus High fat Diet (HFD), der er beskrevet her (Se figur 1 for tidslinje), er den første model af kronisk, LAVDOSIS VC-eksponering (dvs. sub-OSHA-koncentration), hvor mus udsættes for toksin under forhold, der efterligner den humane eksponering meget nøjere. Faktisk, data fra denne model rekapitulerede resultater observeret hos mennesker eksponeret for VC, såsom virkningen på metaboliske veje20, oxidativt stress og mitokondriel dysfunktion4. Andre musemodeller af indånding, såsom hoved-og næse-only modeller21, kræver, at dyret være tilbageholdende, hvilket forårsager stress for dyret. Her, denne helkrops eksponering metode kræver ikke injektion eller unødvendige stress for dyrene. Dyrene har ad libitum adgang til mad og vand og anbringes i det større inhalations kammer i et bestemt antal timer pr. dag og dage pr. uge. Desuden er det begreb, at VC modificerer følsomhed over for et andet hepatotoksicitet, et nyt fund, der først demonstreres af denne gruppe12 og har konsekvenser for VC-eksponeringen ved koncentrationer, der ligger langt under de behov, som er nødvendige for direkte hepatotoktoksicitet.
Denne metode til indånding eksponering kan anvendes til at efterligne udsættelse for en række gasformige giftstoffer, herunder andre flygtige organiske forbindelser, der findes i vores miljø. Flygtige organiske forbindelser er faktisk en stor gruppe af miljø toksiske stoffer og mere udbredte i industriområder, hvilket medfører, at visse populationer har en højere risiko for kronisk eksponering22. Denne protokol kan ændres, så den passer til forskellige eksperimentelle spørgsmål. Længden af tid og koncentration af sammensat administreret kan varieres. Selv om de oprindeligt er udviklet til bestemmelse af leverskade, andre organ systemer kan og er blevet undersøgt med denne model23. Efterforskere, der har til formål at studere kroniske eksponeringer med dyr, men ønsker at minimere dyrs stress, bør overveje at bruge denne model.
Protocol
Alle dyr/VC eksperimenter blev godkendt af Department of Environmental Health, sikkerheds foreningen for vurdering og akkreditering af laboratoriedyr pleje og procedurer blev godkendt af den lokale institutionelle Animal Care og brug udvalg.
1. eksperimentel set-up og akklimatisering til renset, eksperimentel kost
- Bestem det samlede antal C56Bl/6J mus (minimalt 6 − 8 mus pr. gruppe).
Bemærk: dyrene i hver diæt gruppe vil blive yderligere underinddelt i eksponeringsgrupper. Vær sikker på at højde for det samlede antal dyr, der er nødvendige, når du planlægger studiet. - Identificere og afveje dyrene. Registrere disse data.
- Skift diæter fra almindelig Chow til renset fedtfattig (LFD) eller fedtfattig kost (HFD) en uge før starten af inhalations forsøgene for at acclimere musene til den nye kost (Se figur 1 for tidslinje).
- Giv mad og vand ad libitum. Overvåge fødevareforbruget ved vejning og registrering af de fødevarer, der skal gives pr. bur, og vejning og registrering af resten af fødevarer på hver fodrings dag. Hvis boliger 4 mus pr bur, give ~ 50 g mad to gange om ugen. Hvis boliger 5 mus pr bur, give ~ 60 g mad to gange om ugen.
Bemærk: under fodring af de rensede diæter bør mængden af fødevarer kontrolleres hver dag for at sikre, at musene har tilstrækkelige pellets. Hvis der er utilstrækkelige pellets musene har tendens til at ' hamstre ' mad og øge indtag. Desuden, især HFD tendens til at smuldre meget mere end LFD, forårsager en lignende effekt. - Overvåge dyrene gennem hele forsøget for at sikre, at dyresundheden opretholdes.
Bemærk: ugentlig vægtøgning og fødevareforbrug, sammen med metabolisk overvågning kan gøres for at give et indeks over den samlede dyresundhed.
2. vinyl klorid indånding eksponerings system
Bemærk: der findes flere forskellige inhalations systemer, som spænder fra "næse-only" til "helkrops eksponering" og manual til automatiserede systemer. Data, der tidligere blev offentliggjort af denne gruppe, stammer fra et helkrops manuelt system12,23,24. Figur 2viser et diagram, der beskriver det automatiserede inhalations eksponerings system.
- Sørg for, at fortyndingsluften i både forsøgs-og kontrol kamrene er højeffektiv partikel luft (HEPA) og aktiveret Carbon-filtreret, tørret og trykreguleret, før de kommer ind i deres respektive flow målings anordninger (masse strømningsregulator [MFC ] – eksperimentel kammer, rotameter – kontrol kammer).
Bemærk: i kontrol kammeret regulerer rotameter luftstrømmen til musene. Luften kommer ind i toppen af kammeret, passerer ved musene, så er udmattet under musene og passeret gennem et HEPA filter, før de kommer ind i den kemiske hætte. Temperatur og relativ luftfugtighed (RH) måles i kammeret. I det eksperimentelle kammer blandes fortyndingsluften med luft fra en VC-tank. Begge flows reguleres med MFC'er. Forholdet mellem de to blandinger bestemmer koncentrationen af VC i forsøgs kammeret. VC kommer ind i toppen af eksponerings kammeret gennem en dispergerings med syv jetfly, der peger i forskellige retninger. VC passerer ved musene og er derefter opbrugt gennem 12 separate porte, der er placeret under buret rack. Dette kammer design har vist sig at give homogene giftstoffer koncentrationer tidligere25. - Sørg for, at trykket, temperaturen og RF overvåges indefra forsøgs-og kontrol kamrene.
- Bekræft, at kammer udstødningen passerer gennem et HEPA-filter, en CO2 -sonde og et aktivt kulfilter, før det kommer ind i udstødnings området af den kemiske hætte, og at co2 -niveauet overvåges for at sikre, at musene modtager acceptabel ventilation.
- Brug den brugerdefinerede software til at ændre, overvåge og registrere miljøvariabler under inhalations eksponeringer.
Bemærk: Hvis der anvendes et manuelt system, bør de variabler, der er beskrevet i trin 2.1 − 2.4, overvåges og kalibreres, når det er nødvendigt regelmæssigt i hele eksponeringsperioden.
3. opsætning før eksponering
- Sluk alle luft strømme i forsøgs-og kontrol kamrene for teknikerens sikkerhed.
- Åbn kammer døren for hvert kammer, og Anbring absorberende strøelse (absorberende side opad) oven på ekskrementer-gryden. Fugt det absorberende materiale for at give et behageligt fugtighedsniveau (40 − 60% RH) i hele eksponeringsperioden.
- Indstil det ønskede eksponeringsniveau for VC i kammeret. For sub-OSHA grænse koncentrationer brug 0,85 ppm af VC. Brug enten den softwarestyrede, detektor baserede feedback kontrol af VC-levering til kammeret, eller brug manuelle justeringer af systemet.
Bemærk: sidstnævnte fremgangsmåde kræver kendskab til kammervolumen, kammer opdateringshastighed, luftstrøm og leveringshastighed af VC-gassen fra lager forsyningen; disse beregninger skal efterfølgende valideres og kalibreres ved målinger af VC-koncentrationerne i kammeret ved Steady State12,24. Den mest almindeligt forekommende teknik til måling af VC i kammeret er via gaskromatografisk analyse af prøve luft12,24. Fordelene ved den software-drevne tilgang med hensyn til nøjagtighed og præcision af VC levering er klar. Det har imidlertid vist sig, at den manuelle fremgangsmåde også er nøjagtig og konsistent12,24.
Forsigtig: VC er et kendt toksisk stof og kræftfremkaldende på højt niveau. Brug passende personlige værnemidler og håndtering af gassen, mens du tænder og slukker for kamrene.
4. eksponerings bur og tilberedning af dyr
- Fjern musene fra deres bolig kamre, og Placer dem i de enkelte bure i inhalations kammeret burrack (et burrack til kontrol musene, en til de udsatte mus). Randomiserer hver muse placering inden i burstativet dagligt for at sikre, at hver mus eksponeres ensartet i eksponerings kammeret. Marker hvert dyrs nummer og placering af bås i laboratorie notesbogen.
- Anbring hvert bur rack i dets respektive kammer og luk kammer dørene.
5. gennemførelse af en eksponering
- Sørg for, at ventilen til VC-gastanken er i åben position. Sørg for, at fortyndings strømmen til forsøgs kammeret er indstillet til 25 L/min.
- Start fortyndings strømmen i det eksperimentelle kammer. Sørg for, at rotameter på kontrol kammeret er indstillet til 25 L/min.
- Sørg for, at alle sensorer (strømme, temperatur, fugtighed, kammer tryk, CO2 niveau) fungerer korrekt og viser forventede resultater i både forsøgs-og kontrol kamre.
Bemærk: VC-flowet beregnes og indstilles ud fra fortyndings strømmen og den ønskede VC-koncentration. - Sørg for, at eksponeringstiden, fortyndings strømmen, VC-flowet, temperaturen, luftfugtigheden, kammer trykket, CO2 -niveauet og den teoretiske VC-koncentration vises, tegnes og registreres under hele eksponeringen i forsøgs kammeret. Bekræft, at temperatur og fugtighed for kontrol kammeret også vises, tegnes og optages.
Bemærk: Hvis der anvendes et manuelt system, skal VC-strømmen kontrolleres og justeres, når det er nødvendigt, i hele eksponeringsperioden. - Hvis der opstår problemer under eksponeringen, skal VC-flowet indstilles til nul, og fortyndings strømmen forøges til maksimumværdien, så kammeret hurtigt renses.
- Når eksponeringsvarigheden (dvs. 6 timer/dag) er nået, slukker softwaren automatisk VC-flowet. Den 15 min sikkerhedstimer derefter begynder for tiden efter varigheden for den eksperimentelle kammer til at rydde VC. Når det er sikkert at fjerne dyrene, skal du klikke på OK knappen i dialogboksen. Systemet vil stoppe optagelsen af målinger i filen, og eksponeringen er overstået.
Bemærk: Hvis der anvendes et manuelt system, skal brugeren manuelt slukke for VC-flowet ved slutningen af eksponeringens varighed og tid for VC-clearance ved udgangen af eksponeringen skal beregnes.
6. efter eksponering
- Drej stophane på ventilen til VC-gastanken til den lukkede position, og sluk for alle luft strømme i eksponerings kammeret. Drej rotameter, indtil der ikke flyder luftstrømmen gennem kontrol kammeret.
- Fjern dørene fra hvert kammer for at give ventilation til musene. Fjern burstativerne fra kamrene. Under en hætte, fjerne musene fra deres eksponerings bure og placere dem tilbage i deres bolig bure. Transporter alle mus tilbage i deres bolig lokale til overnatning i almindelige bure.
- Bortskaffelse af alt affald fra ekskrementer pan til en afdeling for miljø sundheds-& sikkerhed (dehs)-godkendt Biohazard container, da disse kan betragtes som en kemisk fare af institutionelle miljø sundhedstjenester. Rengør kammerets døre, ekskrementer pan, eksponeringsbur rack og eksponerings kammer til forsøgs-og kontrolsystemer.
7. validering af VC-koncentrationen i kamrene under eksponeringen
- Foretage en måling af VC-koncentrationen i forsøgs kammeret halvvejs gennem hver eksponering (3 timer).
- Bryd glas spidserne på et VC-detektor rør og et forbehandlerrør. Fastgør strømudgangen på VC-detektor røret til detektor rørpumpen. Fastgør strømnings-i-enden af VC-detektor røret til udstrømnings enden af Forbehandl røret med et kort stykke slange. Fastgør et kort stykke slange til strømmen-i slutningen af forbehandling røret.
- Fjern et stik fra en af de prøvetagnings porte, der ligger tæt på muternes indåndingszone. Fastgør slangen fra strømnings enden af forbehandlerrøret til prøvetagnings porten.
- Fra den fulde i position, udvide håndtaget på stemplet af detektor røret pumpe til fuld ud position. Dette vil trække 100 mL af den udtagne gas fra kammeret til VC-detektor røret over en periode på 90 s. Efter at have ventet 90 s, skubbe håndtaget tilbage i.
- Gentag trin 7,4 tre gange, så i alt 400 mL trækkes ind i VC-detektor røret.
- Fjern røret fra prøveudtagnings porten i kammeret, og sæt stikket i porten igen. Undersøg farveændringen af VC-detektor røret for at fastslå VC-koncentrationen i kammeret.
- Optag VC detektor røret læsning i laboratoriet notesbog og sammenligne med den teoretiske værdi. Kassér VC-detektor røret og Forbehandl røret i en egnet beholder.
8. afslutning af forsøg med inhalationseksponering
Bemærk: efter det ønskede eksponerings tidspunkt, for eksempel 6, 8 og/eller 12 uger efter påbegyndelse af inhalations eksponeringen, afsluttes forsøgene, og dyrene vil blive aflives (Se figur 1 for tidslinje).
- Hurtig mus 4 h før tidspunktet for eutanasi.
Bemærk: denne procedure tillader bestemmelse af fastende blodglukose og insulin niveauer for metabolisk analyse. - Brug en eutanasi tilgang i overensstemmelse med den amerikanske veterinærmedicinske Association (avma) retningslinjer, såsom anæstesi efterfulgt af exsanguination.
- Administrere ketamin/xylazin (100/15 mg/kg) ved intraperitoneal injektion til hver mus for at fremkalde anæstesi.
Bemærk: undgå natriumpentobarbital som en præ-euthanasia bedøvelsesmiddel, da vinylchlorid eksponering kan hæmme dens effektivitet. - Blod fra den mindreværdige Vena cava opsamles i natriumcitrat opløsning (Final, 0,38%), for at forebygge blod koagulation og for prøve konservering.
- Fjern leveren og/eller ethvert andet ønsket organ. Dissekere leveren og snap-fryse dele i flydende nitrogen, indlejre i frosset prøvemedium, og Fix i 10% Buffered formalin for histologi.
- Separat plasma fra blod via centrifugering og overfør den citvurderede plasma til et egnet rør og opbevares ved-80 °C, indtil det er nødvendigt til analyse.
- For at evaluere histologiske indekser for leverskade, udføre hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning med 5 μM formalin fast paraffin indlejrede lever sektioner og få billeder med et lysfelt mikroskop.
- For at opnå aminotransferaseniveauer i plasma skal du udføre både alaninaminotransferase (ALAT) og aspartat aminotransferase (AST) kinetiske assays på den citvurderede plasma ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.
Bemærk: til kvalitetskontrol skal plasma-transaminaser for C57Bl/6J-mus være i normalområdet (35 − 45 IE/L) for LFD + VC-gruppen, mens værdierne skal være forhøjede (~ 150 IU/L) for HFD + VC-gruppen (figur 3C).
Representative Results
I løbet af eksperimentet blev dyrenes legemsvægt og fødeindtagelse overvåget ugentligt for at sikre dyrenes sundhed og evaluere in vivo metabolisme. Figur 3a skildrer legemsvægt og fødeindtagelse for et 12 ugers eksperiment. Legemsvægten blev målt en gang om ugen, og fødevareforbruget blev målt to gange om ugen for alle grupper. Alle mus fik vægt i løbet af studiet. Mens mus i HFD-grupperne som forventet fik mere vægt som musene i LFD-grupperne, fik de mus, som blev eksponeret for VC, ikke mere vægt end musene i den pågældende kontrolgruppe. Fødevareforbruget var ikke forskelligt fra gruppe12til24.
Figur 3B skildrer repræsentative fotomicrografer af lever sektioner farvet med H & E til analyse af generel morfologi. I LFD-koncernen forårsagede VC ingen åbenlys patologiske ændringer. HFD-fodring signifikant øget steatose (fedt ophobning) og VC eksponering øget denne effekt. Desuden resulterede VC-eksponeringen i HFD-gruppen i nogle inflammatoriske Foci12,24.
Plasma transaminase (ALAT og AST) blev målt som indikatorer for leverskader og et forhøjet transaminase niveau er en indikator for leverskader. I LFD-koncernen forhøjede VC ikke transaminaseniveauerne. HFD alene lidt øget transaminase niveauer og vigtigere VC signifikant forbedret denne effekt (figur 3C)12,24.
Der blev beregnet levervægt til legemsvægt forhold for hver gruppe. HFD forhøjede leveren signifikant i forhold til legemsvægten. VC øgede imidlertid ikke denne effekt signifikant (figur 3D)12.
Figur 1: oversigt over inhalations model proceduren. Mus fodres de respektive lavt fedtindhold (13% mættet fedt) eller højt fedtindhold (42% mættet fedt) kostvaner ad libitum i 1 uge for at akklimatisere dem til den rensede kost. Efter en uge introduceres mus til inhalations regimet. For at, mus er placeret i State-of-the-art hele kroppen indånding kamre for udsættelse for en sub-OSHA niveau VC koncentration af < 1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) eller Room Air (Control) for 6 h/dag, 5 dage/uge, for 12 uger. Under inhalations proceduren er musene tilladt fri adgang til mad og vand. Ved 12 uger, er mus aflives om morgenen. Denne model kan udvides til længere perioder med kronisk eksponering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: design af inhalations kammer. Der vises et diagram over et automatiseret inhalations eksponerings system, som giver homogene toksin koncentrationer. Brugerdefineret software giver brugeren mulighed for at ændre, overvåge og registrere miljøvariabler under inhalations eksponeringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: vinyl klorid alene forårsager ikke åbenlys leverskade, men forbedrer diæt-induceret leversygdom. (A) legemsvægt og fødevareforbrug blev overvåget ugentligt. B) repræsentative fotomicrografer over almindelig lever morfologi ved H & E farvning vises (forstørrelse = 200x). (C) citrated plasma blev indsamlet ved udgangen af eksponeringsperioden og analyseret for transaminaseenzymatisk aktivitet som et indeks for leverskader. D) levervægten blev bestemt ved forskellige eksperimentelle tidspunkter og sammenlignet med hele legemsvægten. Resultaterne præsenteres som middelværdien ± SEM.a, p < 0,05 sammenlignet med den respektive LFD-kontrol. b, p < 0,05 sammenlignet med fravær af VC. Prøvernes størrelse pr. gruppe n = 8 − 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne model af VC-Enhanced NAFLD er en ny metode til at evaluere effekten af sub-OSHA grænse VC eksponering i en helkrops inhalations paradigme. Denne model gør det muligt for undersøgere at studere sub-hepatotoksiske og sensibiliserende virkninger ved lave niveauer af VC alene. Faktisk, denne Co-eksponering model opnår øget leverskade, elevation af plasma ALAT og AST og moderat inflammation, mens stort set ikke påvirker andre organ systemer, såsom hjerte, på denne koncentration23. Denne kroniske model kræver helkrops inhalations kamre, men minimerer stress og eksponeringskoncentrationer. Selv om protokollen præsenteres her er en software-drevet tilgang, vores erfaring har vist, at den manuelle tilgang er også en nøjagtig og konsekvent metode til eksponering12,24. Desuden er det let anvendelig på flere forskningsområder, herunder andre organskader23 forårsaget af flygtige organiske sammensatte eksponering22. Denne model kan især i højere grad ligne patogenesen af humane Co-eksponeringer mod miljøkemikalier og underliggende sygdom5.
For at opnå lignende resultater skal visse kritiske trin i protokol optimering opnås. For eksempel skal investigatorerne fastslå, at koncentrationen af VC eller andet giftstof inden for kamrene ligger inden for det ønskede eksponeringsområde (dvs. lavt niveau, sub-OSHA eller akut niveau). Optimering af dette trin i inhalations kammeret er afgørende for en vellykket model af den menneskelige eksponering af interesse. For det andet kan justering af eksponeringstid pr. dag og varighed af eksperimentet også ændres. Af hensyn til denne gruppes interesser blev en erhvervsmæssig eksponeringsindstilling opnået, og en ekstra parameter for diæt blev også undersøgt. Miljø-og akutte eksponeringer kan dog også modelleret med denne protokol.
Dette arbejde udfordrer paradigmet om, at de nuværende eksponeringsgrænser for VC (erhvervsmæssig og miljømæssig) er sikre. Faktisk, selv om den nuværende OSHA eksponeringsgrænse for VC er 1 ppm, denne model har vist, at koncentrationer af VC under denne grænse er tilstrækkelige til at forbedre leverskade forårsaget af HFD i mus. Denne protokol gør det muligt for efterforskere at studere og karakterisere en ny toksisk stof eksponering paradigme og model TASH.
Dette er den første model af kronisk, lav-dosis VC eksponering. Tidligere arbejde brugte meget høje bolte koncentrationer, akut eksponering eller aktive metabolitter som surrogater for VC eksponering. Alle disse tilgange mindsker relevansen af resultaterne for menneskers eksponering. Derfor er denne nye model af TASH-NAFLD interaktion giver den nødvendige platform for undersøgere til at undersøge komplekse interaktioner af lav-niveau VC eksponering.
Denne model af toksisk stof-induceret leverskade kan anvendes til andre flygtige organiske forbindelser og også til at studere andre interaktioner, der kan påvirke leveren og andre organ systemer8,22,23. Desuden har denne model været og kan blive yderligere anvendt til at undersøge interventions terapier og dybtgående Mekanistiske undersøgelser af virkningsmåden for dette fremherskende giftstof24. Da VC er et kendt kræftfremkaldende26,27,28, kan dette eksponerings paradigme også modificeres til studiet af VC-induceret cancer. Andre Co-morbiditeter som alkoholisk leversygdom kan også forstærkes af VC Co-eksponering. Desuden ville det være af interesse at studere forskellige typer af fedt, såsom flerumættede fedt18,29,30, eller forskellige typer af kulhydrater31 og deres Co-eksponering med VC i denne model. Faktisk, alle disse faktorer er kendt for at have differentierede virkninger på udviklingen af leverskade og kan spille en rolle i VC-induceret leversygdom.
Afslutningsvis, dette er en roman indånding model af miljø toksisk stof-induceret leverskade og etablerer en eksponering paradigme for kronisk, lav-niveau VC eksponering. Koncentrationen af VC anvendes i denne model er sub-hepatotoksiske af sig selv, mens det forbedrer leverskade forårsaget af en anden faktor (HFD) i mus. Denne model vil gøre det muligt for undersøgere at studere mekanismer og interventioner for kronisk VC-toksicitet og kan være nyttige for translationelle undersøgelser, der ser på udsatte forsøgspersoner og med den højeste risiko for eksponering.
Disclosures
WT Goldsmith har økonomisk interesse i IEStechno, som er den skabelon for det beskrevne system. De resterende forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af Awards fra National Institutes of Health (K01 DK096042 og R03 DK107912) til Juliane Beier. Forskningen blev også støttet af en institutionel Udviklingspris (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskudsnummer P20GM113226 og det nationale Institut for alkoholmisbrug og alkoholisme i Nationale institutter for sundhed under tildeling nummer P50AA024337. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
| C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
| CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
| Eosin | Sigma | E6003 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
| Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
| Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
| Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |
References
- Sass, J. B., Castleman, B., Wallinga, D. Vinyl chloride: a case study of data suppression and misrepresentation. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 809-812 (2005).
- ATSDR. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR): Toxicological profile for Vinyl Chloride. , (2006).
- Wahlang, B., et al.
- Cave, M., et al. Toxicant-associated steatohepatitis in vinyl chloride workers. Hepatology. 51 (2), 474-481 (2010).
- Cave, M., Falkner, K. C., McClain, C. J. Occupational and Environmental Hepatotoxicity. Zakim and Boyer's Hepatology. Boyer, D. T., Manns, M. P., Sanyal, A. J. , Saunders. Philadelphia, PA. 476-492 (2012).
- Tamburro, C. H., Makk, L., Popper, H. Early hepatic histologic alterations among chemical (vinyl monomer) workers. Hepatology. 4 (3), 413-418 (1984).
- EPA. Toxicological review of vinyl chloride in support of summary information on the Integrated Risk Information System. EPA. , (2000).
- Lang, A. L., Beier, J. I. Interaction of volatile organic compounds and underlying liver disease: a new paradigm for risk. Biological Chemistry. 399 (11), 1237-1248 (2018).
- Abplanalp, W., et al. Benzene exposure is associated with cardiovascular disease risk. PLoS ONE. 12 (9), 0183602 (2017).
- Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - A global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Lang, A. L., et al. Vinyl chloride dysregulates metabolic homeostasis and enhances diet-induced liver injury in mice. Hepatology Communications. 2 (3), 270-284 (2018).
- Lotti, M. Do occupational exposures to vinyl chloride cause hepatocellular carcinoma and cirrhosis. Liver International. 37 (5), 630-633 (2017).
- Antweiler, H. Studies on the metabolism of vinyl chloride. Environmental Health Perspectives. 17, 217-219 (1976).
- Bolt, H. M. Metabolic activation of vinyl chloride, formation of nucleic acid adducts and relevance to carcinogenesis. IARC Scientific Publications. (70), 261-268 (1986).
- Guengerich, F. P., Crawford, W. M., Watanabe, P. G. Activation of vinyl chloride to covalently bound metabolites: roles of 2-chloroethylene oxide and 2-chloroacetaldehyde. Biochemistry. 18 (23), 5177-5182 (1979).
- Anders, L. C., et al. Vinyl Chloride Metabolites Potentiate Inflammatory Liver Injury Caused by LPS in Mice. Toxicological Sciences. 151 (2), 312-323 (2016).
- Anders, L. C., et al. Role of dietary fatty acids in liver injury caused by vinyl chloride metabolites in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 311, 34-41 (2016).
- Morinello, E. J., Koc, H., Ranasinghe, A., Swenberg, J. A. Differential induction of N(2),3-ethenoguanine in rat brain and liver after exposure to vinyl chloride. Cancer Research. 62 (2), 5183-5188 (2002).
- Guardiola, J. J., et al. Occupational exposures at a polyvinyl chloride production facility are associated with significant changes to the plasma metabolome. Toxicology and Applied Pharmacology. 313, 47-56 (2016).
- Chen, L. C., Lippmann, M. Inhalation toxicology methods: the generation and characterization of exposure atmospheres and inhalational exposures. Current Protocols in Toxicology. 63 (1), 1-24 (2015).
- Wahlang, B., et al. Mechanisms of Environmental Contributions to Fatty Liver Disease. Current Environmental Health Reports. 6 (3), 80-94 (2019).
- Liang, Y., et al. Exposure to Vinyl Chloride and Its Influence on Western Diet-Induced Cardiac Remodeling. Chemical Research in Toxicology. 31 (6), 482-493 (2018).
- Chen, L., Lang, A. L., Poff, G. D., Ding, W. X., Beier, J. I. Vinyl chloride-induced interaction of nonalcoholic and toxicant-associated steatohepatitis: Protection by the ALDH2 activator Alda-1. Redox Biology. 24, 101205 (2019).
- Goldsmith, W. T., et al. A computer-controlled whole-body inhalation exposure system for the oil dispersant COREXIT EC9500A. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A. 74 (21), 1368-1380 (2011).
- IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer. , Lyon, France. (2008).
- IARC. Chemical agents and related occupations. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 100, Pt F 9 (2012).
- Fedeli, U., et al. Mortality from liver angiosarcoma, hepatocellular carcinoma, and cirrhosis among vinyl chloride workers. American Journal of Industrial Medicine. 62 (1), 14-20 (2019).
- Kirpich, I. A., et al. Ethanol and dietary unsaturated fat (corn oil/linoleic acid enriched) cause intestinal inflammation and impaired intestinal barrier defense in mice chronically fed alcohol. Alcohol. 47 (3), 257-264 (2013).
- Kirpich, I. A., et al. Saturated and Unsaturated Dietary Fats Differentially Modulate Ethanol-Induced Changes in Gut Microbiome and Metabolome in a Mouse Model of Alcoholic Liver Disease. American Journal of Pathology. 186 (4), 765-776 (2016).
- Spruss, A., Bergheim, I. Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).
