Summary
Le colture di fette organotipiche sono un potente strumento per studiare i processi neurosviluppo o degenerativi/rigenerativi. Qui, descriviamo un protocollo che modella la morte del neurosviluppo delle cellule Purkinje nelle colture di fette di cerebellar di topo. Questo metodo può beneficiare la ricerca nella scoperta di farmaci neuroprotettivi.
Abstract
La coltura delle fette organotipiche è un potente modello in vitro che imita le condizioni in vivo più da vicino rispetto alle colture cellulari primarie dissociate. Nello sviluppo postnatale, le cellule cerebellari Purkinje sono note per passare attraverso un periodo vulnerabile, durante il quale subiscono la morte cellulare programmata. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per eseguire la coltura della fetta di cerebellar organotypic del topo durante questo momento critico. Le fette sono ulteriormente etichettate per valutare la sopravvivenza delle cellule Purkinje e l'efficacia dei trattamenti neuroprotettivi. Questo metodo può essere estremamente prezioso per lo screening per nuove molecole neuroattive.
Introduction
La modellazione in vitro è uno strumento essenziale nella ricerca biomedica. Consente agli sperimentatori di studiare e controllare strettamente meccanismi specifici in tipi di cellule limitate o in sistemi/organi isolati. La coltura delle fette organotipiche è una tecnica in vitro ampiamente utilizzata, specialmente nel campo delle neuroscienze1. Il metodo è stato inizialmente stabilito da Gàhwiler, che coltiva fette di cervello utilizzando la tecnica del tubo a rulli2e successivamente modificato da Yamamoto et al., che ha introdotto l'uso di una membrana microporosa per eseguire colture di fette corticali3. Rispetto alle colture cellulari primarie, le colture di fette organotipiche presentano il vantaggio di preservare la citoarchitettura del tessuto, così come le connessioni cellulari native nel piano della sezione dei tessuti.
Le fette organotipiche sono state coltivate da molte parti del sistema nervoso centrale, come l'ippocampo4, la corteccia5, lo striato6, il cervelletto4,7e il midollo spinale8,9, tra gli altri. Essi hanno dimostrato di essere un potente strumento negli studi di scoperta di farmaci10. Gli effetti delle molecole neuroattive possono essere valutati in molti modi: sopravvivenza e neurodegenerazione utilizzando analisi immunostaining e biochimiche, formazione di circuiti neuronali o interruzione mediante elettrofisiologia e live-imaging.
L'obiettivo di questo lavoro è quello di descrivere un metodo semplice per eseguire la coltura della sezione cerebellar organotipica, che è noto per essere un modello rilevante per imitare lo sviluppo cerebellar in vitro. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio della morte per lo sviluppo cellulare di Purkinje. In vivo, le cellule Purkinje subiscono l'apoptosi durante la prima settimana postnatale, con un picco al giorno postnatale 3 (P3)11. Lo stesso modello si osserva nella coltura della fetta cerebellare, con i neuroni Purkinje che muoiono per apoptosi quando la cerebella viene prelevata da animali tra P1 e P8, con un picco al P34,12. L'uso delle colture di fette di cerebellare organotipiche ha permesso di identificare diverse molecole neuroprotettive7,13, oltre a comprendere parte dei meccanismi coinvolti in questa morte cellulare programmata14,15,16. Qui, descriviamo un protocollo basato sullo studio di Stoppini et al.17 in ippocampo, e adattato al cerrebelum da Dusart et al.4 Include una rapida dissezione e taglio della cerebella postnatale; affettare la coltura su un inserto di coltura cellulare contenente una membrana microporosa, con o senza trattamento neuroprotettivo; e l'immunofluorescenza per valutare la sopravvivenza neuronale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati effettuati in conformità con il comitato di studi sugli animali della Northwestern University.
1. Preparazione prima delle colture di fette organotipiche di cerebellar
- In un cappuccio cellulare spruzzato con 70% etanolo in anticipo, preparare 200 mL di mezzo di coltura in un filtro sottovuoto da 250 mL a portata di mano collegato a un ricevitore sterile. Aggiungere 100 mL di Basal Medium Eagle (BME), 50 mL di soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS), 50 mL di siero di cavallo inattivato dal calore, 1 mL di 200 mM L-Glutamine (concentrazione finale 1 mM) e 5 mL di 200 g/L di glucosio (concentrazione finale 5 mg/mL). Filtrare sottovuoto il mezzo di coltura e tenerlo a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese.
- Nell'armadio sterilizzato per la biosicurezza, estrarre una piastra di coltura a 6 pozzetti dal suo pacco. Riempire ogni pozzo con 1 mL di mezzo di coltura. Se un trattamento viene testato, aggiungere l'agente farmacologico al pozzo trattato e lo stesso volume di soluzione del veicolo per il pozzo di controllo. Nel presente studio, abbiamo aggiunto 1 /L di sterile 3 M KCl soluzione al pozzo trattato (30 mM finale) e 1 L di acqua sterile per i pozzi di controllo.
- Portare all'interno della cappa di coltura cellulare il numero necessario di inserti di coltura cellulare avvolti individualmente con membrana idrofila politetrafluoroetilene (PTFE) (dimensione del poro s 0,4 m). Srotolare con cura e togliere gli inserti di coltura cellulare con pinze sterili. Lasciali uno ad uno in un pozzo di una piastra di 6 pozze, evitando le bolle all'interfaccia tra la membrana di inserto e il mezzo di coltura cellulare. Lasciare gli inserti equilibrati nel mezzo in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per almeno 2 h prima della coltura.
NOTA: L'elicottero dei tessuti risiede permanentemente nella cappa di coltura cellulare. - Preparare due becher da 200 mL, uno riempito con 150 mL di acqua sterile, e l'altro riempito con 150 mL 70% di etanolo. Immergere gli strumenti chirurgici nel bagno di etanolo 70% e poi in acqua prima di utilizzarli.
NOTA: Non utilizzare strumenti chirurgici immediatamente dopo il contatto con l'etanolo. - Disinfettare la lama a doppio taglio nel becher di etanolo 70%. Posizionarlo sul supporto della lama utilizzando pinze sterili e tenerlo in posizione utilizzando la chiave di morsetto della lama. Lasciare asciugare fino all'uso.
- Disinfettare il disco di plastica fornito con l'elicottero tissutale nel becher di etanolo 70%. Spruzzare il tavolo di taglio con 70% di etanolo prima di posizionare il disco su di esso. Lasciare asciugare fino all'uso.
2. Dissezione e Cerebellar Organotypic Slice Cultures
- Portare il cucciolo di topo all'interno della cappa di coltura cellulare per eseguire la dissezione.
- Decapitare rapidamente il cucciolo utilizzando forbici operative dritte (Figura 1A).
- Tenendo la testa del cucciolo per il naso con pinze adesive dritte, tagliare il cuoio capelluto utilizzando forbici dritte per gli occhi, partendo dall'estremità posteriore e andando laterale a linea mediana.
- Procedere in modo identico per il cranio.
NOTA: Assicurarsi di puntare le punte della forbice verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto durante la dissezione. - Estrarre il cervello e trasferirlo in un piatto di 60 mm pieno di HBSS freddo - 5 mg/mL di glucosio.
- Sezionare con cura il cervelletto utilizzando pinze sottili e dritte sterili (Figura 1B). Trasferirlo sul disco di plastica posto sul tavolo di taglio dell'elicottero dei tessuti utilizzando pinze sottili curve sterili.
- Orientare il tessuto ruotando il tavolo di taglio per eseguire sezioni parasagittali.
- Spostare il tavolo di taglio tirando la manopola di rilascio del tavolo a destra, in modo che la lama sia posizionata sul bordo del tessuto.
- Regolare lo spessore della fetta a 350 m e la velocità della lama a media.
- Accelera l'elicottero. Una volta che l'intero cervelletto è stato tagliato (Figura 1C), spegnere l'elicottero.
- Rimuovere il disco di plastica con pinze sterili.
- Portare con cura il disco di plastica vicino a un piatto di 60 mm contenente HBSS - 5 mg/mL di glucosio. Pipetta fredda HBSS 5 mg/mL di glucosio sul tessuto utilizzando una pipetta di trasferimento sterile per consentire la raccolta di fette di cerebellar nel piatto riempito tampone.
- Separare le fette cerebellari l'una dall'altra utilizzando una microsonda. Estrarre sezioni di buona qualità con la pipetta di trasferimento (si consiglia di utilizzare sezioni di tessuto che sono vicine al vermis) e lasciarle in un inserto di coltura cellulare pre-equilibrato (Figura 1D).
- Posizionare le fette di cerebellar sull'inserto di coltura cellulare utilizzando la microssonda, quindi rimuovere con attenzione l'eccesso di HBSS - 5 mg/mL di glucosio con la pipetta di trasferimento.
NOTA: In questa fase il tessuto è estremamente tenero e soggetto a danni fisici. Il numero massimo di fette di cerebellari per inserto di coltura cellulare dipende dall'età dell'animale donatore. 6-8 fette possono essere coltivate per un animale P0-P4-vecchio, e 4-6 fette per gli animali di età superiore a P5. - Mettere il piatto di coltura nell'incubatrice, cambiando completamente il mezzo ogni 2-3 giorni.
- Per valutare la sopravvivenza delle cellule Purkinje, le fette possono essere raccolte già 5 giorni in vitro. Per altri scopi, possono essere mantenuti nella cultura per diverse settimane (Figura 1F).
NOTA: Nel caso di esperimenti di sopravvivenza cellulare Purkinje, non è necessario rinnovare il trattamento farmacologico quando si cambia il mezzo di coltura cellulare (Figura 1F).
3. Immunofluorescenza
- Estrarre la piastra 6-bene dall'incubatrice. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare, lavare l'inserto di coltura cellulare con 1x PBS e fissare le fette con soluzione di paraformaldeide fredda 4% per 1 h, con 1 mL sotto l'inserto di coltura cellulare e 500 L sopra l'inserto di coltura cellulare.
- Lavare gli inserti 4x 10 min con 1x PBS, con 1 mL sotto e 500 l sopra l'inserto, su uno shaker orbitale.
- Con un pennello, trasferire le fette del cerebellar da 1 inserto di coltura cellulare a 1 pozzetto di un 24-well pre-riempito con 1x PBS, 0.25% Triton X-100, e 3% BSA (PBS-TB), 500 l/po.
- Permeabilizzare e bloccare le fette per incubazione in PBS-TB per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare con anticorpi primari diluiti nella soluzione PBS-TB, durante la notte a 4 gradi centigradi, su uno shaker orbitale, 200 gradi centigradi/pozzo.
- Il giorno seguente, eseguire quattro lavamenti di 10 min con 1x PBS, su uno shaker orbitale, 500 l/po.
- Incubare con anticorpi secondari diluiti nella soluzione PBS-TB, due ore a temperatura ambiente, su uno shaker orbitale, e protetto dalla luce, 200 .
- Eseguire quattro lavamenti di 10 min con 1x PBS, su uno shaker orbitale, 500 l/po.
- Controstate le fette utilizzando Hoechst 33342, diluite in 1x PBS (2 g/mL), per 10 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce, 500 gradi/pozzo.
- Montare le fette di cerebellar su un vetrino di microscopia con una pipetta di trasferimento. Lasciateli asciugare completamente l'aria, protetti dalla luce. Ri-umiliarli con 1x PBS e applicare un coverslip coperto coperto coperto con poche gocce di supporto di montaggio (80 dollari l). Evitare di fare bolle.
- Una volta che il supporto di montaggio è guarito, le sezioni cerebellari sono pronte per essere imagete.
4. Imaging e quantificazione della sopravvivenza cellulare
- Accendere il microscopio e i laser in base alle istruzioni del produttore e/o del nucleo di imaging.
- Avviare il software di acquisizione.
- Utilizzando un obiettivo 10X, individuare le fette di cerebellar non alterate che presentano 9-10 lobuli (di solito sezioni cerebellar vicino al vermis).
- Attivare l'acquisizione dello stack z. Definire l'intervallo dello z-stack per includere tutte le celle Purkinje presenti nella sezione cerebellar. Impostare una dimensione di passo di 2 m e avviare l'acquisizione. Salvare l'immagine acquisita nel formato del produttore del software di acquisizione per conservare i metadati associati.
- Aprire il file acquisito in ImageJ utilizzando ilplug-inBioformati 18 .
- Passare a Immagine > Stack > Progetto z... (Figura 2A).
- Scegliere Intensità massima nel menu a discesa Tipo di proiezione e fare clic su OK (Figura 2B).
- Verrà generata un'immagine 2D appiattita. Fare doppio clic sullo strumento Multipunto per visualizzare la finestra Strumento Punto. Deselezionare l'opzione Punti etichetta per semplificare la visualizzazione delle celle conteggiate. Quindi, fare clic direttamente su un soma di una cella Purkinje per iniziare a contare (Figura 1E). Il numero totale di celle conteggiate verrà indicato nella parte inferiore della finestra dello strumento Punto (Figura 3).
NOTA: Di solito, è possibile quantificare almeno 3 sezioni non danneggiate contenenti 9-10 lobuli per inserto di coltura cellulare. Per valutare l'effetto neuroprotettivo di un agente farmacologico, devono essere eseguiti almeno 3 esperimenti indipendenti.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 4, questo protocollo produce colture di fette di cerebellar organotipiche in cui la sopravvivenza delle cellule Purkinje può essere valutata seguendo i passaggi di immunofluorescenza e acquisizione di immagini. Le cellule Purkinje sono state etichettate con una combinazione di anticorpi antito-tono (diluizione 1/200) anti-tono anti-Calbindin (diluizione 1/200) e Alexa594 anti-tono (diluizione 1/300). La cucitura dell'immagine è stata eseguita automaticamente dal software di acquisizione del microscopio (NIS-Elements) per ottenere un'immagine dell'intera fetta cerebellare. I numeri di cella Purkinje per fetta sono stati inseriti nel software Prism 8 per generare il grafico ed eseguire analisi statistiche. A P6, la sopravvivenza delle cellule Purkinje era bassa nel controllo, coerente con la loronotafinestra di vulnerabilità4 ( Figura 4A,E). La sopravvivenza è aumentata con l'invecchiamento dell'animale donatore ed è uscito da questo periodo critico (Figura 4C,E). Le fette di cerebellar sono state trattate con un'alta concentrazione di KCl per indurre con successo la loro depolarizzazione e sopravvivenza14 (Figura 4B,D,E).
Figura 1: Illustrazione del protocollo dalla dissezione alla quantificazione della sopravvivenza delle cellule di Purkinje.
Il cucciolo di topo viene rapidamente decapitato (A). In seguito alla dissezione cerebrale, il cervelletto viene isolato (B) e quindi tagliato in 350 fette di larghezza m (C). Le sezioni cerebellari sono poste su un controllo o in un inserto di coltura cellulare trattata (D) e mantenute in coltura per almeno 5 giorni in vitro. Il tessuto viene quindi fissato nel 4% di paraformaldeide, viene eseguita l'immunostaining e le immagini vengono acquisite con un microscopio confocale. Infine, il numero di cella Purkinje viene quantificato in ogni sezione utilizzando lo strumento Multipunto in ImageJ (E). (F) Schematico del corso temporale del trattamento KCl durante la coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazioni ImageJ utilizzate per appiattire lo stack 3D prima della quantificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Impostazioni utilizzate per contare il numero di cella Purkinje utilizzando lo strumento Multipunto in ImageJ con un esempio di quantificato una fetta cerebellar. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sopravvivenza delle cellule Purkinje nella coltura di fette organotipiche cerebellari dopo un trattamento elevato del KCl.
Immagine rappresentativa delle fette di cerebellari scattate al giorno postnatale 6 (A, B) o 8 (C, C ', D'),non trattate (A, C, C') o trattate con 30 mM KCl (B, D, D'). (C' e D') Vista di ingrandimento più alta delle regioni bianche inscatolate in C e D. Le fette sono state tenute 5 giorni in vitro prima della fissazione. Le cellule Purkinje sono etichettate con Calbindin D-28K in rosso. Barra della scala: 500 m (A–D) e 100 m (C' e D'). (E) Quantificazione della sopravvivenza delle cellule Purkinje dalle colture P6 e P8, in controllo o trattate con 30 mM KCl, mostra una maggiore sopravvivenza con il trattamento (test Mann-Whitney, n - da 3 a 5 fette). I dati sono espressi come media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La coltura della fetta Cerebellar è un potente strumento per studiare la morte programmata delle cellule Purkinje durante lo sviluppo postnatale. Questa tecnica può essere utilizzata per vagliare rapidamente le molecole candidate per il loro potenziale neuroprotettivo. Il vantaggio principale è che l'impostazione è semplice e molto conveniente, e richiede solo un modesto investimento in attrezzature (un vibratome può costare fino a 3 volte più di un elicottero di tessuto). Inoltre, da 10 a 15 fette sane possono essere generate da un cucciolo di topo, consentendo l'esecuzione di diversi saggi in parallelo utilizzando un solo animale.
Al fine di ottenere risultati coerenti e riproducibili, è fondamentale eseguire la cultura nel modo più efficiente possibile e scegliere sezioni cerebellari sane da coltire. Questo metodo è adatto anche per la cultura a lungo termine (fino a diversi mesi). Quindi, è essenziale utilizzare una buona tecnica asettica durante il processo di dissezione e taglio per evitare contaminazioni e la necessità di integrare le colture con antibiotici.
Il modello di coltura della fetta cerebellar mantiene le interazioni tra cellule e cellule esistenti nel piano della sezione dei tessuti e nella regione coltivata. Questo viene fornito con un avvertimento: le connessioni con obiettivi al di fuori della regione coltivata potrebbero essere interrotte. L'offerta di fattori neurotrofici forniti da fibre afferenti potrebbe essere interrotto e compromettere la sopravvivenza neuronale. Questo può essere parzialmente aggirato eseguendo co-culture di fette organotipiche. È stato dimostrato che le fibre rampicanti possono penetrare le colture di fette di cerebellare postnatali quando co-coltivate con colture inferiori di fette di olive14,19. Più interessante, le cellule Purkinje contattate da fibre rampicanti sopravvissute14.
Qui, ci siamo concentrati sull'uso della coltura delle fette organotipiche per la ricerca di molecole neuroprotettive nel cervelletto in via di sviluppo. Tuttavia, questo metodo è ugualmente adatto per altre condizioni come la neurodegenerazione20, la rigenerazione assonale21e il monitoraggio dell'attività del circuito neuronale22,23. Le applicazioni post-cultura vanno oltre l'immunofluorescenza. Le fette possono essere utilizzate per studi biochimici o di espressione genica, al fine di studiare i meccanismi biologici coinvolti nell'effetto neuroprotettivo di un dato composto. Complessivamente, questo modello può gettare le basi per trovare nuove molecole neuroattive prima del test in vivo ed essere un integratore efficace e affidabile agli studi meccanicistici in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro di imaging è stato eseguito presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente supportato da NCI CCSG P30 CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo Sean McDermott per l'assistenza tecnica e il supporto e Maya Epstein per le illustrazioni disegnate a mano illustrate nella Figura 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
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