Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Abstract

C. elegans è il sistema principale per l'analisi sistematica delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici durante lo sviluppo embrionale. Una sfida è che l'embriogenesi si sviluppa dinamicamente in un periodo di circa 13 h; questa scala cronologica di mezza giornata ha limitato la portata degli esperimenti limitando il numero di embrioni che possono essere immagine. Qui, descriviamo un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging time-lapse 3D simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni a risoluzione temporale moderata, da un massimo di 14 condizioni diverse, in una singola esecuzione notturna. Il protocollo è semplice e può essere implementato da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di visita del punto. L'utilità di questo protocollo è dimostrata usandola per immaginare due ceppi personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave della specifica e della morfogenesi dello strato germinale. Per analizzare i dati, è stato costruito un programma personalizzato che ritaglia singoli embrioni da un campo visivo più ampio in tutti i canali, i passi z e i punti temporali e salva le sequenze per ogni embrione in una pila tiff separata. Il programma, che include un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva, semplifica l'elaborazione dei dati isolando, pre-elaborazione e orientando uniformemente i singoli embrioni in preparazione per la visualizzazione o l'analisi automatizzata. Viene fornita anche una macro ImageJ che compila i dati dei singoli embrioni in un file multi-pannello che visualizza la proiezione della fluorescenza massima e immagini del campo luminoso per ogni embrione in ogni punto di tempo. I protocolli e gli strumenti descritti nel presente file sono stati convalidati utilizzandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale a seguito di 40 geni dello sviluppo descritti in precedenza; questa analisi ha visualizzato fenotipi dello sviluppo precedentemente annotati e ne ha rivelato di nuovi. In sintesi, questo lavoro descrive in dettaglio un metodo di imaging semi-alto-velocità accoppiato con un programma di ritaglio e uno strumento di visualizzazione ImageJ che, se combinato con ceppi che esprimono marcatori fluorescenti informativi, accelera notevolmente gli esperimenti da analizzare sviluppo embrionale.

Introduction

L'embrione di C. elegans è un importante sistema modello per la biologia delle cellule meccanicistiche e l'analisi delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici che guidano lo sviluppo embrionale^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Fino ad oggi, gran parte della caratterizzazione sia degli eventi a livello cellulare che delle specifiche del destino cellulare nell'embrione è stata ottenuta utilizzando esperimenti di imaging uno alla volta relativamente ad alta risoluzione temporale (cioè acquisizioni ogni 10-100 s) di embrioni che esprimono fluorescenti. Anche se adatto per eventi in ordine da secondi a decine di minuti, questo approccio diventa tecnicamente limitante per la caratterizzazione di processi più lunghi, nell'ordine di ore a giorni. Lo sviluppo embrionale dalla prima scissione fino alla fine dell'allungamento richiede circa 10 h. A questo ritmo temporale, metodi semi-alti che consentirebbero l'imaging simultaneo a risoluzione temporale più bassa (cioè l'acquisizione a intervalli di tempo di 5-20 min) di coorti di embrioni più grandi, a diverse condizioni, avrebbero aperto una nuova serie di esperimenti; ad esempio, consentendo sforzi sistematici di screening su larga scala e l'analisi di un numero sufficiente di embrioni per confrontare le conseguenze delle perturbazioni molecolari.

Qui, descriviamo un metodo semi-alto per il monitoraggio dell'embriogenesi C. elegans che consente l'imaging time-lapse simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni, da un massimo di 14 condizioni diverse, in un'unica esecuzione notturna. Il protocollo è semplice da implementare e può essere eseguito da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di point visiting. I passaggi principali di questo protocollo sono descritti nella Figura 1. In breve, gli embrioni vengono sezionati da adulti gravidi a predare che esprimono marcatori fluorescenti di interesse e trasferiscono embrioni giovani (stadio cellulare 2-8) a pozzi di una piastra di 384 pozze per l'imaging. In questo formato, le dimensioni relativamente piccole dei pozzi incanalano gli embrioni in un'area stretta, che facilita l'identificazione di campi contenenti più embrioni per l'imaging time-lapse. Per mantenere lo sviluppo approssimativamente sincrono attraverso la coorte di embrioni, le dissezioni vengono eseguite in supporti refrigerati e la piastra viene tenuta sul ghiaccio, il che impedisce uno sviluppo significativo durante la finestra temporale di dissezione della durata di un'ora. La piastra viene trasferita al microscopio e gli embrioni vengono filmati in una stanza a temperatura controllata durante la notte, a intervalli di tempo di 20 min, utilizzando una lente 60x di immersione dell'olio 1,35 NA, per raccogliere l'intera gamma z in 2 gradini. Cinquanta campi, ciascuno contenente tra 1 e 5 embrioni, sono immagine in un'unica pernottamento. A seconda dell'esperimento desiderato, la risoluzione del tempo potrebbe essere aumentata (ad esempio, l'imaging a intervalli da 5 a 10 min) diminuendo proporzionalmente il numero di campi immagine.

Con questo protocollo, anche una singola esecuzione notturna genera una notevole quantità di dati (80-100 embrioni distribuiti su 50 campi) e esperimenti più grandi possono diventare rapidamente ingestibili per quanto riguarda l'analisi dei dati. Per facilitare l'elaborazione, la visualizzazione e semplificare l'analisi di questi dati, è stato costruito un programma per ritagliare e orientare gli embrioni ed eseguire passaggi di pre-elaborazione (opzionale), e una macro ImageJ che compila i dati per semplificare la visualizzazione. Questi programmi possono essere utilizzati per elaborare immagini raccolte utilizzando approcci convenzionali, in quanto sono indipendenti dal metodo di imaging, che richiedono un solo piano di campo luminoso. Il primo programma prende in un campo 4D contenente più embrioni (opzione GUI o codice sorgente embryoCrop.py) o più campi 4D contenenti più embrioni (screenCrop.py), ben da muntire embrioni e li orienta in una configurazione anteriore-posteriore. Questi programmi offrono inoltre agli utenti la possibilità di eseguire la sottrazione in background, la correzione della deriva e la correzione dell'attenuazione. I file risultanti sono uniformemente pre-elaborati, impilati tiff strettamente tagliati per ogni embrione che sono modificabili per l'analisi automatica delle immagini. Per rendere più semplice visualizzare tutti gli embrioni per ogni condizione, è stata scritta una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), che assembla tutti gli embrioni da una determinata condizione in un unico stack tiff e array immagini luminose e colore di proiezione massima intensità ( RGB) sovrapposizioni, affiancate, per ogni embrione. I metodi sono stati convalidati usandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale dopo aver abbattuto 40 geni di sviluppo descritti in precedenza in una coppia di ceppi fluorescenti personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave dello strato di germinale specifiche e morfogenesi^10,11. Insieme, il protocollo di imaging embrionale semi-alto e gli strumenti di elaborazione delle immagini consentiranno esperimenti con numero di campioni più elevato e sforzi di screening su larga scala volti a comprendere i processi di sviluppo. Inoltre, questi ceppi forniranno anche un mezzo efficiente per esaminare gli effetti delle perturbazioni molecolari sull'embriogenesi.

Protocol

1. Preparazione di C. elegans Embrioni per l'imaging semi-alto a velocità effettiva

NOT: L'obiettivo di questa parte del protocollo è quello di caricare una popolazione di embrioni C. elegans semi-sincronizzati (da 2 a 8 celle), sezionati da ceppi di pennarelli adatti (Figura 2), in una piastra di 384 pozzetti con fondo di vetro per l'imaging. Anche altri formati di lamiere potrebbero funzionare, ma le 384 lastre di pozzo sono preferite perché le piccole dimensioni del pozzo limitano la diffusione degli embrioni in un'area relativamente piccola, il che facilita l'identificazione di campi contenenti embrioni multipli per l'imaging time-lapse. La sincronizzazione approssimativa degli embrioni garantisce che l'intero decorso dello sviluppo venga catturato per ciascuno degli embrioni in un campo.

1. Preparare 5-10 mL di 0,1 mg/mL di anetico tetramisole (TMHC) anestetico sciolto nel mezzo M9 freddo ghiaccio (0,45 M Na₂HPO_4x7H2O, 0.11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) da utilizzare durante l'uso durante dissezione e imaging. Questo supporto include un anestetico per garantire che le larve tratteggiate in movimento non interrompano l'imaging degli embrioni nelle fasi precedenti dello sviluppo.
   NOT: Se si utilizzano gli strumenti di ritaglio e visualizzazione per analizzare i dati acquisiti utilizzando i metodi standard di montaggio del pad agarose, passare alla sezione 3 di seguito.
2. Aliquota 70 -L della soluzione preparata in singoli pozzi di una piastra di 384 pozzetti con uno per ogni condizione; evitare le due file esterne della piastra per evitare effetti di bordo.
   NOT: È utile mascherare i pozzi circostanti utilizzando un foglio di lastra PCR adesivo (vedere l'esempio nella Figura 1D) questo conserva pozzi adiacenti per esperimenti futuri e rende più facile individuare pozzi appropriati al microscopio di dissezione. Una volta che la soluzione è aliquota, tenere la piastra e la soluzione rimanente sul ghiaccio per tutta la dissezione.
3. Generare pipettatori bocca per il trasferimento di embrioni dal vetrino depressione (dove gli ermafroditi gravidi sono sezionati) ai pozzi. Tirare i pipet capillari (25-L calibrati pipet) su una fiamma e rompersi per generare un'estremità conica fine(Figura 1D). È necessario un pipet per condizione per prevenire la contaminazione incrociata; scartare pipet dopo l'uso.
4. Utilizzare una pinzetta fine per trasferire 10 adulti gravidi a 10 adulti gravidi sotto un mirino di dissezione in 150 -L della soluzione TMHC ghiacciata su uno scivolo di depressione per ogni condizione. Utilizzando le pinzette e un bisturi, sezionare i vermi per rilasciare gli embrioni.
5. Caricare un tubo capillare tirato nell'attacco dell'aspiratore incluso con i pipettai e un tubo per trasferire tutti gli embrioni da 2 a 8 celle in un pozzo individuale della piastra preparata (Figura 1D). Evitare di trasferire embrioni in fase avanzata e detriti di dissezione. Esaminare sotto un ambito di dissezione e se sono presenti aggregati di embrioni, pipet bocca su e giù o toccare ciuffi di embrioni con punta del pipet per disperdersi.
   NOT: Per evitare la contaminazione incrociata, pulire l'attrezzatura di dissezione e utilizzare un nuovo tubo bocca durante lo spostamento tra le condizioni. Conservare la piastra sul ghiaccio tra le dissezioni.
6. Una volta che i vermi di tutte le condizioni sono stati sezionati e gli embrioni posizionati nel loro pozzo appropriato, girare la piastra 384-pozzetto per 1 min a 600 x g per risolvere gli embrioni.
7. Pulire il fondo della piastra con una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere eventuali residui e posizionare la piastra su un microscopio confocale dotato di un supporto a piastre in un ambiente a temperatura controllata.
   NOT: I passaggi che seguono illustrano in dettaglio questo metodo utilizzando l'impostazione del lab. modificare le condizioni di acquisizione in base alle esigenze e alle attrezzature sperimentali. Qui, una scatola scanner confocale dotata di un disco rotante Nipkow doppio potenziato microlens, una fotocamera EM-CCD 512 x 512, una fotocamera auto-XY-Stage ad alta precisione (risoluzione designata 0,1 m) e il controllo motorizzato dell'asse z (risoluzione designata 0,1 m). Questo sistema è conservato in una stanza di 16 gradi centigradi, che mantiene la temperatura del microscopio tra i 21 e i 23 gradi centigradi durante l'imaging notturno.
8. Per identificare i campi con embrioni adatti, eseguire una pre-scansione di ogni pozzo utilizzando un obiettivo 10x 0.4 NA e un software di imaging adatto. I campi più ottimali conterranno più di un embrione in fase iniziale che si trova nello stesso piano focale degli altri embrioni e idealmente avranno un contatto minimo tra embrioni adiacenti. Contrassegnare le posizioni delle regioni adatte.
9. Per selezionare i campi di imaging, passare all'obiettivo 60x e regolare il piano focale in ogni visita punto per sezionere in modo appropriato gli embrioni. 1–4 campi per pozzo sono immagine, per un totale di 50 campi in 14 pozzi, e ogni campo può contenere da uno a cinque embrioni. Complessivamente, da 4 a 15 embrioni vengono selezionati da ogni condizione per l'imaging ad alta risoluzione.
   NOT: Una variabile chiave in questa fase è l'uso di olio sufficiente; posizionare l'olio sull'obiettivo, visitando i punti in ogni pozzo per stendere l'olio intorno alla superficie di tutti i pozzi e quindi applicare un ulteriore goccio di olio all'obiettivo prima della selezione dei campi.
10. Immagina i campi selezionati utilizzando un obiettivo 60x 1.35 NA per acquisire sezioni di 18 z a intervalli di 2 m ogni 20 min per 10 h. Le condizioni di imaging che utilizzano i ceppi di reporter a strato germinale e morfogenesi sono le seguenti: campo luminoso, potenza del 90%, 25 ms, 20% di guadagno; 488 nm, 100% di potenza, 200 ms, 60% di guadagno; 568 nm, 45% di potenza, 150 ms, 60% di guadagno.
11. Una volta completata l'imaging, valutare la letalità embrionale eseguendo un basso ingrandimento (10x 0,4 NA obiettivo) di una scansione completa del campo luminoso da 20 a 24 h dopo l'inizio dell'imaging notturno.

2. Punteggio di letalità embrionale

1. Utilizzando i campi scansionati 10x post-esecuzione, valutare la letalità embrionale e i difetti larvali contando i vermi covati e gli embrioni non tratteggiati per ogni pozzo.
2. Ottenere embrioni come letali. Escludere gli embrioni arrestati da uno a quattro stadi da un numero di letalità, poiché i giovani embrioni sezionati a volte non riescono a completare la formazione del guscio d'uovo (se la meiosi II non è ancora completa) e i difetti di permeabilità possono portare a complicazioni osmotiche durante i primi due Divisioni.
3. Punteggio vermi parzialmente schiusi o completamente schiusi con morfologia del corpo o difetti comportamentali, come dumpy o paralizzato, come 'larva anormale'.

3. Ritaglio automatico (Figura 3A)

NOT: Il software è ospitato in due posizioni: (1) zenodo ospita una versione user-friendly del software¹² che non richiede alcuna esperienza di programmazione. (2) Github contiene il codice sorgente per il nostro embryoCropUI.py e screenCrop.py software¹³, che richiedono competenza con Python. Le istruzioni dettagliate per il download e il funzionamento di entrambe le versioni del programma sono disponibili di seguito.

1. Ritaglio automatico con versione eseguibile embryoCropUI (versione user friendly)
   1. Per utilizzare il programma embryoCropUI, scaricare prima il programma da .enodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Scarica la versione in formato MacOS o Windows del programma (si noti che la versione MacOS richiede MacOS X10.11 o superiore).
      2. Scaricare il file di istruzioni (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx), che fornisce istruzioni dettagliate per il test e l'utilizzo del programma embryoCropUI.
      3. Scaricare test_files.zip per verificare se il programma funziona correttamente sulla piattaforma (vedere le istruzioni).
   2. Una volta scaricato, decomprimere e navigare per trovarel'eseguibile embryoCropUI (... Fare doppio clic per avviare (o scegliere 'apri con' terminale) ed eseguire l'eseguibile embryoCropUI.
   3. L'eseguibile GUI ritaglia un campo visivo 4D alla volta. Nell'angolo in alto a sinistra, selezionare il pulsante Apri per caricare il campo specifico da ritagliare (multitiff). Se si ritaglia una serie tiff, con più dimensioni (ad esempio, z, tempo, canale), caricare solo la prima immagine della serie all'interno della cartella (una serie tiff per cartella).
   4. Una volta caricate le immagini, specificare le seguenti informazioni: numero di sezioni z, (z), numero di punti temporali (T), numero di canali (C), il canale che corrisponde a DIC o brightfield (primo, secondo, 2 e così via).
   5. Selezionare l'elaborazione aggiuntiva da eseguire sulle immagini. Il programma offre la correzione della deriva, la sottrazione in background e la correzione dell'attenuazione.
   6. Specificare i parametri per Topologia in background e Correzione attenuazione per guidare le attività di elaborazione nel prompt GUI. Per Sottrazione in background, definire la dimensione della feature più grande per riflettere la dimensione del segnale significativo; questa dimensione della funzione non deve essere considerata come sfondo e deve essere un valore numerico dispari. Immettere un valore compreso tra 0 e 1 per Correzione attenuazione. Il valore Correzione attenuazione riflette la percentuale dell'intensità originale che rimane alla profondità più lontana dell'oggetto che si sta immagine.
      NOT: La sottrazione in background e la correzione dell'attenuazione devono essere eseguite insieme.
   7. Specificare l'ordine di raccolta delle immagini (ad esempio, channel-z-time (czt) o z-channel-time (zct)).
   8. Specificare i micron per pixel per le immagini in base alla fotocamera utilizzata.
      NOT: Se le dimensioni in pixel non sono definite correttamente, si verificherà un ritaglio di immagine scadente.
   9. Selezionare Esegui nell'angolo in basso a sinistra. Una nuova sottocartella denominata "crop" verrà creata nello stesso percorso della cartella non ritagliata; le versioni ritagliate verranno salvate in questa posizione. A seconda delle dimensioni del file, il ritaglio dovrebbe essere completato in pochi secondi a minuti.
2. Ritaglio automatico con screenCrop.py (versione batch alternativa alla GUI embryoCrop descritta sopra;Solo utenti esperti di Python)^10,13
   1. Per utilizzare screenCrop.py, la versione software Python per il ritaglio di set di dati più grandi in formato batch, clonare o scaricare il codice sorgente da Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Leggere le istruzioni per la configurazione di un ambiente virtuale appropriato e seguire il sistema di denominazione dei file descritto; entrambi dettagliati nel file README nel repository Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Una volta che le variabili ambientali e le convenzioni di denominazione sono state stabilite correttamente, aprire parameters.py e screenCrop.py in un editor di scelta.
   4. Per modificare i parametri regolabili senza toccare il codice sorgente, modificare il file parameters.py.
      NOTA: è anche possibile modificare direttamente i parametri all'interno dell'intestazione di screenCrop.py.
      1. Se si utilizza il file di configurazione parameters.py, modificare l'impostazione use_configure su True. Se si utilizza la modifica diretta all'interno di screenCrop.py, lasciare l'impostazione use_configure su False.
      2. Individuare le seguenti informazioni all'interno del file parameters.py e apportare le modifiche necessarie ai parametri di imaging desiderati e alla struttura dei file:
         1. loadFolder (riga 9): passare all'unità in cui sono memorizzati i file (ad es.D://,
         2. data (riga 7): passare alla cartella contenente i file per la sessione di imaging. Questa operazione viene definita "Nome cartella dell'esperimento" nel file di monitoraggio CSV (vedere le istruzioni).
         3. trackingFile (riga 11): consente di passare al percorso del file CSV in cui sono memorizzate le informazioni sull'esperimento.
         4. z (linea 13): impostare come numero di piani z.
         5. nT (linea14): impostare come numero di punti temporali.
         6. nWells (riga 19): Impostare come numero di pozze utilizzate.
         7. pointVisits (linea 20): impostare come numero massimo di visite a punti (per pozzo).
         8. Nella riga 10 trovare la posizione attualmente occupata da 'CV1000/' e immettere la cartella esterna utilizzata nel percorso del file. Per evitare problemi, utilizzare la convenzione seguente: 'XXXXXXX/'.
         9. Nella riga 12 immettere un percorso di file valido per l'archiviazione dei dati delle proporzioni per i dati ritagliati.
         10. Nelle righe 15, 16, 17 e 18 immettere True/False per verificare se le immagini vengono sottoposte all'elaborazione seguente:
             1. Immettere True o False per la correzione della deriva sulla riga 15.
             2. Immettere True o False per lo sfondo sottrarre sulla riga 16. Le dimensioni delle entità geografiche devono essere determinate empiricamente per diversi ceppi di marcatori e dimensioni dei pixel. Nella configurazione qui, la dimensione della funzione è stata definita come 41 per la deformazione Germ-Layer e 201 per la deformazione Morphogenesis. La sottrazione in background deve essere eseguita in combinazione con la correzione dell'attenuazione.
             3. Immettere True o False per la correzione dell'attenuazione sulla riga 17.
             4. Ingresso True o False per la rotazione posteriore anteriore sulla linea 18.
   5. Una volta apportate tutte le modifiche, è possibile iniziare il ritaglio. A tale scopo, passare a screenCrop.py e selezionare l'icona di riproduzione nella barra degli strumenti, nel menu a discesa selezionare Esegui come > Python Run.
   6. Poiché il ritaglio può richiedere diverse ore per un set di dati di grandi dimensioni (50 visite 18 z passaggi, 3 canali, 31 timepoint), tenere traccia dello stato di avanzamento del ritaglio nella finestra della console. Una volta completato il ritaglio, una piccola finestra mostrerà le anteprime delle immagini ritagliate prima di salvare. Per ogni immagine ci sono 3 opzioni:
      1. Salva: Premere la barra spaziatrice per salvare l'immagine se l'immagine viene ritagliata correttamente senza aree di interesse tagliate.
      2. X: Premere X se l'immagine sembra avere aree di interesse tagliate; l'immagine verrà salvata con una X davanti al nome per separarla dalle altre immagini.
      3. Elimina: Premere D per eliminare l'immagine ritagliata se l'immagine non viene ritagliata correttamente o se l'embrione non è soddisfacente.
         NOTA: le immagini verranno salvate in una sottocartella denominata "Rifilato" nella cartella di caricamento (definita nella riga 9 del programma).

4. Visualizzazione (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 è una macro ImageJ che creerà un file tiff facile da visualizzare da tutte le immagini per una deformazione e una condizione specifiche. È necessaria l'installazione di FIJI/ImageJ^14,15. Questa macro viene eseguita in base alla nostra struttura di file; dovrà essere modificato per funzionare con altre strutture di file. Una guida alla struttura corretta dei file e la descrizione dettagliata di considerazioni importanti sono disponibili alla fine del file GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx nel repository. Si prega di leggere queste istruzioni completamente prima di imaging per nome e struttura correttamente i file per interfacciarsi meglio con questa macro. Per riferimento, la struttura della posizione dei file è simile alla seguente:For reference, our file location structure looks like this:
Identificatore univoco delle cifre ,,.tif , n. #_C #_Z #F .
ad esempio, : : : cropped EMBD0001_GLS , Emb1_EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_C1.tif

1. Scaricare OpenandCombine_embsV2 e GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx da .enodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Preparare le seguenti informazioni:
   -La posizione in cui sono memorizzate le cartelle delle immagini (dopo il ritaglio).
   -I nomi delle cartelle dell'immagine per le condizioni specifiche da elaborare (ad esempio, EMBD0002). Questo è indicato come "Target" nell'esempio precedente
   -Un identificatore univoco alfanumerico di 15 cifre specifico di un determinato esperimento notturno: questo identificatore è il nome della cartella di acquisizione dei dati (ad esempio, 20140402T140154) e l'identificatore univoco è incorporato nel singolo nome di file tiff (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_'01_C1) per ogni embrione di immagine in quel giorno. La macro utilizza questo identificatore per verificare la presenza di embrioni acquisiti nella stessa data e può assemblare condizioni ripetute, con date separate, in file ImageJ separati.
3. Aprire ImageJ e trascinare il file della macro OpenandCombine_embsV2.ijm, sulla barra ImmagineJ oppure aprire direttamente la macro.
4. Una volta aperta la macro, individuare le righe 3 e 4. Inserire le informazioni raccolte nella sezione 4.2 in base ai seguenti passaggi:
   1. Nella riga 3 (RNAL), immettere il nome di destinazione per le immagini da elaborare. Immettere ogni destinazione nella struttura seguente newArray("XXXXXXXX/"); includere le citazioni. Per eseguire più condizioni contemporaneamente, separare con una virgola e mantenere tutti i nomi di destinazione all'interno della parentesi (ad esempio, newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Nella riga 4 (data), immettere l'identificatore univoco alfanumerico di 15 cifre nelle virgolette, ad esempio newArray("20140402T140154").
5. Premere Esegui nella parte inferiore sinistra della finestra della macro. Apparirà una finestra che avvierà un prompt per passare alla cartella esterna contenente le cartelle di immagini ritagliate (specificate in 4.4.1).
6. Una volta selezionata, apparirà un'altra finestra, che permetterà la specifica dei parametri di imaging.
   1. Immettere il numero di canali, il numero di sezioni, la dimensione del carattere per il testo utilizzato nell'etichettatura delle immagini compilate e il colore per ciascuno dei canali.
   2. Controllare on/off auto a contrasto in tutti i canali.
7. Una volta specificati tutti i parametri, fare clic su OK nella parte inferiore della finestra. Il file composito inizierà ad assemblarsi; questo richiederà diversi minuti, per condizione, per completare.
8. Una volta completato, rivedere i file che vengono lasciati aperti se lo si desidera. Essi possono essere chiusi senza salvare, come la macro ha già salvato i file in una cartella appena creata che è denominato nel modo seguente: il nome della cartella esterna (specificato nel prompt della sezione 4.5) - "-fiji-processed-output" (cioè, cropped-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Representative Results

Una sfida significativa nel caratterizzare l'effetto delle perturbazioni molecolari sullo sviluppo embrionale di C. elegans è che ci vogliono circa 10 h per gli embrioni per progredire dalla prima scissione alla fine dell'allungamento a 20 .¹⁶. Un metodo semi-alto in cui grandi coorti di embrioni possono essere imagete simultaneamente è utile per gli eventi su questa scala temporale perché consente l'imaging di più condizioni in parallelo con una dimensione sufficiente dell'ensemble per ogni condizione per consentire analisi quantitativa (Figura 1A).

Metodo di imaging semi-alto a velocità effettiva e ceppi multi-marcatore
Il metodo di imaging semi-alto rendimento descritto qui (illustrato nella Figura 1B),impiega una piastra inferiore in vetro 384-well; il formato multi-bene consente di mettere in serie fino a 14 condizioni in parallelo e le piccole dimensioni dei pozzi vincolano l'area di ricerca, semplificando l'identificazione dei campi contenenti embrioni per l'imaging ad alta risoluzione. Qui è stata utilizzata una scatola scanner confocale, dotata di un disco rotante Nipkow, di una fotocamera Ni12 x 512 EM-CCD, di una fotocamera auto-XY-Stage ad alta precisione (risoluzione designata 0,1 m) e di un controllo motorizzato dell'asse z (risoluzione designata 0,1 m). Tuttavia, il protocollo può essere adattato per qualsiasi microscopio confocale con capacità di osservazione dei punti di precisione e un adattatore per palco in grado di ospitare una piastra multi-pozzo. Una sfida significativa nello sviluppo di questo metodo è stata l'ideazione di un mezzo per generare una piastra di embrioni nella stessa fase di sviluppo in modo che l'intero sviluppo possa essere catturato per tutti gli embrioni in ogni campo. Questa è una sfida perché gli embrioni disposti sulla piastra di imaging continueranno a svilupparsi mentre i campioni successivi vengono sezionati, con conseguente gradiente di messa in scena tra i pozzi. Per aggirare questo problema, vengono selezionati embrioni in fase iniziale (stadio 2-8 cellule) e mantengono la dissezione mediae e la piastra di imaging sul ghiaccio; questa stalla embriogenesi per gli embrioni sezionati fino a quando tutte le condizioni sono state schierate senza avere un impatto significativo sulla vitalità embrionale¹⁰. Per limitare il tempo in cui gli embrioni siedono sul ghiaccio a 1 ora, due ricercatori eseguono le dissezioni contemporaneamente, il che consente l'impostazione di 14 condizioni diverse in circa 50 min. Dopo la dissezione, la piastra viene filata a 600 x g per 1 min per sedimentare gli embrioni e i pozzi vengono pre-scansionati a bassa ingrandimento per individuare i campi con gruppi di embrioni adatti per l'imaging ad alta ingrandimento; luoghi di visita punto sono contrassegnati. Gli embrioni vengono filmati in una stanza a temperatura controllata durante la notte utilizzando un'immersione ad olio 60x 1.35 NA lente. I campioni sono configurati in un pozzo 4 per 4 regione del pozzo in modo che la superficie della piastra utilizzata in un esperimento sia paragonabile a una vetrina standard 22 x 22 mm^2, che consente l'uso di un obiettivo di olio 60x. La diffusione uniforme del petrolio in questa regione prima dell'inizio dell'imaging è fondamentale per il successo dell'acquisizione di immagini a lungo termine. Gli embrioni in via di sviluppo sono immagini in una soluzione contenente anestetico; questo assicura che quando gli embrioni più anziani all'interno del pozzo si schiudono, il loro movimento non interrompa la posizione degli embrioni più giovani adiacenti che vengono immagine. A causa della natura impenetrabile del guscio d'uovo, l'anestetico non influisce sul movimento prima della schiusa. In queste condizioni, i dati time-lapse 3D vengono raccolti in 3 canali per un totale di 80-100 embrioni in un singolo esperimento notturno (discusso più di seguito).

C. elegans sviluppo embrionale si verifica in due fasi. In primo luogo, 10 cicli di divisione cellulare accoppiato alle specifiche del destino cellulare generano i tre strati germi (ectodermi, mesoderma ed endoderma) in un periodo di 6 ore¹⁷. Nei seguenti 7 h, gli eventi morfogenetici guidano la formazione di tessuti differenziati^8,16. Per catturare questi due aspetti dello sviluppo, abbiamo costruito un paio di ceppi personalizzati, il Germ Layer e la Morphogenesis ceppi¹⁰ (Figura 2A), e utilizzato il protocollo semi-alto-velocità effettiva per immagini embrioni da entrambi i ceppi. Il ceppo Germ Layer esprime proteine fluorescenti codificate transgene che segnano i nuclei nell'ectodermo, mesoderma ed endoderma in rosso, giallo e verde. Questo ceppo contiene tre transgeni reporter: (1) un transgene che esprime PHA-4::GFP che segna i nuclei nell'intestino e il pharynx (endoderm verde)^10,18,19, (2) un transgene che esprime un fusione mCherry-histone nell'epidermide e in 1/3 dei neuroni (ectoderma rosso; Figura 2A) e (3) un transgene che esprime contemporaneamente istoni mCherry e GFP nel muscolo della parete del corpo (mesoderma giallo). La varietà Morfogenesi ha due transgeni che esprimono due transgeniche che esprimono: (1) un marcatore di giunzione epiteliale verde (DLG-1::GFP) nell'epidermide e (2) un marcatore della membrana plasmatica con etichetta di mCherry, in 1/3 di neuroni (promotore di Pcnd-1; Figura 2A). Per migliorare l'efficacia dell'RNAi, entrambi i ceppi sono stati progettati per contenere una coppia di mutazioni sensibilizzanti DELL'RNAi (nre-1(hd20) lin-15b(hd126)²⁰. Questi sono stati costruiti con l'obiettivo di eseguire uno schermo su larga scala basato su RNA dei geni da 2.000 dollari necessari per lo sviluppo embrionale. Tuttavia, questa coppia di ceppi costituirà anche una piattaforma standardizzata ampiamente utile per valutare i difetti dello sviluppo nei mutanti e per analisi più dettagliate dei ruoli delle diverse proteine nello sviluppo.

Per la raccolta dei dati in questo formato semi-alto, con questi ceppi, vengono raccolti i ceppi verdi, rossi e i campi luminosi della z(18 x 2 xm² intervalli) che ogni 20 min, per un periodo di 10 h in una stanza a temperatura controllata da 16 gradi centigradi; questo mantiene il microscopio tra i 21 e i 23 gradi centigradi durante la corsa. L'intervallo di tempo di 20 min ci permette di immagini 50 campi di embrioni (visite a punti) per esperimento. Gli utenti possono personalizzare le acquisizioni a intervalli più brevi con meno visite a punti o intervalli più lunghi con più visite a punti per soddisfare al meglio i loro obiettivi sperimentali. Per questi ceppi, i primi tempi di sviluppo non sono immagine perché i giornalisti specifici del tessuto che guidano l'espressione del marcatore non iniziano ad esprimere fino a metà-fine gasstrulation. Durante questa fase iniziale, i pozzi sono stati scansionati a basso ingrandimento (10x) e i campi sono selezionati per l'imaging ad alto ingrandimento. Si raccomanda la selezione di campi contenenti più di un embrione in fase iniziale, ma si evitano i campi in cui gli embrioni sono parzialmente sovrapposti, sovraffollano o si trovano all'estremità del pozzo. Dopo l'imaging notturno 60x, viene eseguita una scansione dell'intero pozzo a basso ingrandimento (10x) per determinare se gli embrioni si schiudono con aspetto normale (WT), si schiudono con anomalie visibili (anormali larvali) o sono embrionali per ogni condizione valutata ( Figura 1B). Questo passo serve come un'alternativa facile alla creazione di piastre in parallelo per valutare la letalità tra una popolazione più grande; l'intero pozzo 10x post-scansione fornisce dati di letalità embrionale su 50-80 embrioni per condizione. L'utilizzo di questa misura per confrontare i dati di letalità embrionale della popolazione per i controlli tra le esecuzioni è un controllo utile che garantisce la coerenza rispetto alla salute dei ceppi e alle condizioni ambientali e alle fasi di lavorazione. Quando vengono immagini in combinazione, i due ceppi di reporter personalizzati forniscono letture informative per la maggior parte dei principali eventi di sviluppo, tra cui la specifica del destino cellulare, l'intercalazione dorsale, il recinto epidermico, l'allungamento e la neurogenesi (rappresentante le immagini di controllo sono illustrate nella Figura 2B, vedere anche Wang et al.¹⁰).

Trattamento dei dati: ritaglio e orientamento automatizzati degli embrioni
Con il nostro protocollo di imaging, ogni campo di imaging ad alta risoluzione contiene da 1 a 5 embrioni; questi embrioni sono orientati in modo casuale e sono spesso posizionati immediatamente adiacenti l'uno all'altro. I dati raccolti utilizzando le tecniche convenzionali di montaggio degli embrioni soffrono delle stesse sfide. Per preparare i dati per la successiva visualizzazione e analisi, è necessaria una notevole manipolazione pratica per ritagliare e orientare le sequenze embrionali, nonché pre-elaborarle per sottrarre lo sfondo, correggere la deriva e compensare l'attenuazione del segnale con profondità. Per semplificare questo processo, è stato costruito un programma personalizzato di ritaglio degli embrioni che isola e orienta ogni embrione dal campo più ampio (Figura 1C, Figura 3). Questo programma è stato confezionato come un facile utente, programma stand-alone con interfaccia utente grafica (GUI, compatibile con i dati dalla maggior parte delle piattaforme di imaging) che può prendere in una sequenza time-lapse 3D di un campo di embrioni, ed elaborarlo in singole serie tiff per ogni embrione nel campo (Figura 3B, disponibile a https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)^10,12. Il codice sorgente Python per la GUI (embryoCropUI.py) e una versione batch di questo programma (screenCrop.py) sono disponibili anche per gli utenti esperti di Python su GitHub (https://github.com/renatkh/embryo_crop.git)^10,13. La funzionalità principale di questo programma è quella di localizzare, ritagliare e orientare l'embrione lungo l'asse anteriore-posteriore. Contemporaneamente, la sottrazione dello sfondo, la correzione dell'attenuazione e la correzione della deriva possono essere eseguite sul set di dati utilizzando impostazioni regolabili facoltative.

In breve, il software di ritaglio automatico rileva in modo iterativo singoli embrioni in una maschera binaria ottenuta dalle immagini del campo luminoso e ritaglia in sequenza gli embrioni di tutti i canali e orienta le immagini lungo l'asse anteriore-posteriore(Figura 3 B, descritto per la prima volta in Wang et^al. Prima del ritaglio, il software corregge la deriva, sottrae lo sfondo ed esegue la correzione dell'attenuazione della profondità in ogni canale di fluorescenza (opzionale). Per ottenere la maschera binaria, il software applica il rilevamento bordo Canny²¹ alle immagini dei campi luminosi, esegue la proiezione di intensità massima dei tre piani centrali e riempie in piccoli fori. L'algoritmo rileva singoli embrioni inserendo un ovale Cassini a una sezione del contorno della maschera binaria (vedere la figura 3B, 3C). Dopo aver allineato l'ovale lungo il suo asse principale, il software misura l'intensità della fluorescenza rossa in ogni metà dell'embrione isolato e ruota l'embrione in modo che l'intensità rossa sia orientata verso sinistra, il che mette l'embrione anteriore a sinistra per ceppi di reporter utilizzati in questo lavoro (Figura 3D). Pilotaggio di questo software ha rivelato che la maggior parte degli embrioni sono stati tagliati in modo efficiente come previsto. Piccoli problemi di imaging, come la deriva dell'embrione, la perdita temporanea di piani focali (a causa di bolle nel petrolio) o i campi affollati di embrioni non hanno in genere interrotto il successo della coltivazione. Tuttavia, per i campi in cui c'erano grandi gruppi di embrioni (sovrapposti in un po 'in z), embrioni che sono stati significativamente inclinati all'interno del piano di imaging (in z), perdita di piani focali a lungo termine, o embrioni che sono stati parzialmente tagliati, ritaglio di successo non è stato sempre Raggiunto. Questi problemi possono essere facilmente aggirati da una migliore selezione del campo durante la fase di acquisizione dei dati. Nel complesso, la pre-elaborazione dei dati raccolti con questo metodo semi-alto o utilizzando metodi di montaggio convenzionali è un primo passo utile per la visualizzazione e l'analisi di set di dati embrionali.

Convalida dei metodi di raccolta e di elaborazione dei dati delle immagini: visualizzare lo sviluppo embrionale dopo l'abbattimento di 40 geni descritti in precedenza
Per convalidare questo metodo di raccolta di immagini semi-alto e un regime di ritaglio personalizzato, è stato eseguito un piccolo schermo RNAi nei ceppi personalizzati, diretto contro 40 geni con funzioni descritte in precedenza nella specifica del destino cellulare e della morfogenesi ( descritti da Wang, Ochoa, Khaliullin e colleghi^10,11). Per fare questo, dsRNA è stato generato contro ogni bersaglio, iniettato animali L4 da ogni ceppo, atteso 20-24 h, e poi sezionato e gli embrioni di immagine utilizzando il protocollo descritto sopra (per il set di dati completo^10,11). Il raggiungimento di fenotipi dello sviluppo da parte dell'RNAi richiede inibizione dell'espressione genica sia materna che zygotica. I geni dello sviluppo possono essere espressi maternamente, con i prodotti proteici risultanti caricati negli embrioni, o zygotically espressi nell'embrione, o, in molti casi, entrambi^10,22,23. Il tempo che intercela l'iniezione e le riprese degli embrioni è la variabile fondamentale per indirizzare efficacemente le popolazioni espresse in modo maschile e zigotica; determina sia la quantità di dsRNA iniettato che viene caricato nell'embrione per prevenire l'espressione zitetica²⁴ sia l'entità dell'esaurimento delle proteine materne. Dopo l'iniezione di dsRNA, l'mRNA materno corrispondente al gene mirato viene degradato e non si riprende in un intervallo di tempo rilevante. L'esaurimento preesistente delle proteine richiede la produzione di embrioni, che espelle la proteina materna dai tessuti germinali caricandola in embrioni formanti. 20-24 h a 20 gradi centigradi è il tempo di incubazione più breve che consente un costante esaurimento materno; esaurimento materno migliora nei tempi successivi (cioè 36-42 h dopo l'iniezione). La quantità di dsRNA iniettato che viene caricata nell'embrione determina quanto efficace sarà la prevenzione dell'espressione genica zigotica. La quantità di RNA caricato picchi circa 5-10 h dopo l'iniezione, quando gli embrioni con materiale iniettato vengono prima fecondati, scendendo successivamente. Nella nostra esperienza, 24 h dopo l'iniezione è un punto di tempo ottimale, in cui l'esaurimento delle proteine materne e l'inibizione dell'espressione genica zigotica sono entrambi efficaci. L'analisi dei fenotipi nei ceppi di reporter personalizzati utilizzati in questo lavoro, attraverso l'insieme di 40 geni di prova, ha mostrato che il nostro protocollo combinato produceva fenotipi distinti e altamente riproducibili in un ampio spettro di geni coinvolti nel destino cellulare specificazione e morfogenesi (vedi Wang et al.¹⁰); il set di dati completo è disponibile¹¹). Come esempio di questi dati, immagini fisse di quattro embrioni diversi per il controllo, pha-4 (RNAi), pal-1 (RNAi)e mex-3 (RNAi) nel ceppo di reporter livello germinale sono mostrate nella Figura 4A. Per una discussione più completa dei fenotipi osservati nella schermata RNAi di 40 geni, vedere Wang et^al.

Macro ImageJ: compilazione e visualizzazione di tutti i dati per una determinata condizione
La visualizzazione di un gran numero di embrioni provenienti da singoli stack tiff può essere noiosa e dispendiosa in termini di tempo. Dal nostro sforzo iniziale, >400 singoli embrioni sono stati isolati utilizzando il programma di ritaglio automatico personalizzato descritto in precedenza. Per accelerare l'analisi del primo passaggio, abbiamo costruito una macro ImageJ, che genera una matrice di tutti gli embrioni immagine per una determinata condizione di RNAi in un determinato sfondo di deformazione (Figura 4B). Per ogni embrione dell'array, un'immagine di campo luminoso e un'immagine di proiezione di intensità massima vengono presentate fianco a fianco, per ogni punto temporale, per generare un file di filmato composito. Mentre questa macro è stata scritta per funzionare con la nostra struttura di file, può essere modificata per ospitare la struttura del file dell'utente. Per ottenere risultati ottimali, tuttavia, gli utenti devono seguire le convenzioni di denominazione e struttura dei file stabilite nel protocollo (vedere i file README di Configurazione GUIDATA o Github per ulteriori specifiche per le convenzioni di denominazione delle applicazioni Python e ImageJ). Per visualizzare tutti i dati elaborati ImageJ e ottenere un'analisi più approfondita dei fenotipi osservati per il set di test di 40 geni, si prega di consultare i dati depositati nel database Dryad^10,11. Questo formato di visualizzazione ImageJ consente una rapida valutazione del fenotipo generale e della sua penetrazione e rende facile segnalare facilmente i problemi di qualità dei dati, come la presenza di detriti o la perdita del piano focale. Nel complesso, la combinazione del metodo di acquisizione dei dati semi-alto-velocità, programma di ritaglio e strumento di visualizzazione ImageJ, combinato con ceppi di reporter personalizzati, facilita notevolmente gli sforzi su larga scala per studiare lo sviluppo embrionale.

come illustrato nella Figura 1. Panoramica del metodo di imaging ad alto contenuto, della procedura di elaborazione dei dati e degli strumenti essenziali. (A) Un confronto delle caratteristiche del metodo standard basato sul pad agarose per il montaggio degli embrioni C. elegans all'approccio di imaging multi-bene semi-alto rendimento descritto qui. (B) Panoramica del metodo semi-alto/velocità effettiva per il monitoraggio dello sviluppo embrionale. Vedere il testo per i dettagli. (C) Panoramica degli strumenti di elaborazione e visualizzazione dei dati, che possono essere utilizzati sui dati acquisiti utilizzando una convenzionale procedura di montaggio a gagarose basata su cuscinetto o il metodo a base di piastra multi-bene semi-alto rendimento descritto nel presente documento. Una sequenza embrionale time lapse a 3 canali da un campo (a sinistra) o da più 3 canali, campi quadridimensionali di dati embrionali (a destra) possono essere elaborati utilizzando il programma di ritaglio personalizzato, compatibile con i dati acquisiti sulla maggior parte delle piattaforme di imaging. La versione grafica dell'interfaccia utente (GUI) del programma è facile da usare e non richiede alcuna esperienza di programmazione. L'applicazione screenCrop.py richiede esperienza Python, ma ha aggiunto funzionalità, vale a dire che può ritagliare in formato batch. L'uscita di questo passaggio è strettamente ritagliata, pile di tiff degli embrioni orientati anteriori-posteriori. Per visualizzare tutti i dati da una singola condizione, è stata creata una macro ImageJ che compila stack tiff ritagliati e ruotati per mostrare un'immagine di campo luminoso e una proiezione di intensità massima per ogni embrione in ogni punto temporale. Il pannello (D) mostra gli strumenti essenziali necessari per la dissezione e la configurazione del formato di imaging semi-alto.high-throughput. Alcuni componenti di figura riprodotti con il permesso di Wang et al.¹⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 2. Ceppi personalizzati generati per l'imaging ad alto contenuto di embriogenesi C. elegans . (A) Gli schemi illustrano i transgeni utilizzati per costruire i ceppi Germ Layer (in alto) e Morfogenesi (in basso). (B) I pannelli di proiezione di intensità massima mostrano il corso temporale dello sviluppo nei ceppi Morfogenesi (in alto) e Germ Layer (in basso). Viene visualizzata la vista ventrale, come illustrato negli schemi (a sinistra). Il tempo è relativo alla fase della virgola (t - 0), che è facilmente identificabile in entrambi i ceppi. Barra della scala : 10 m. Figura riprodotta con il permesso di Wang et^al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella figura 3. Il programma di ritaglio personalizzato isola e orienta i singoli embrioni dai campi di imaging. (A) Schematico illustra le caratteristiche del programma di ritaglio dell'embrione personalizzato ed evidenzia le due opzioni per accedere a questo programma: un'interfaccia GUI user-friendly, che non richiede competenze di programmazione ed è disponibile su versione di ritaglio batch del programma, che richiede esperienza Python ed è disponibile su Github (a destra). (B) Graphic riassume l'algoritmo di ritaglio automatico: una maschera binaria viene generata da immagini di campi luminosi a 8 bit e singoli embrioni vengono rilevati, ritagliati e orientati lungo l'asse anteriore-posteriore. La barra della scala è di 10 m.(C)Gli schemi illustrano in dettaglio la procedura utilizzata per rilevare in modo iterativo gli embrioni nella maschera binaria. (D) Schema indica il metodo utilizzato per orientare gli embrioni lungo l'asse anteriore-posteriore. Pannelli B-D riprodotti con il permesso di Wang et al.¹⁰. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

come illustrato nella Figura 4. La macro ImageJ personalizzata consente la visualizzazione dei dati di screening degli RNAi generando file compositi per ogni condizione. (A) Sono mostrati (a destra) gli embrioni per tre esempi di condizioni di RNAi del set di test di 40 geni (vedi Wang et al.^10,11 per il set di dati completo) che evidenziano i fenotipi distinti ottenuti per ciascuna condizione e la riproducibilità dei fenotipi all'interno di ciascuna condizione. Gruppo è stato adattato con il permesso di Wang et^al. (B) Pannello illustra come la macro ImageJ personalizzata (OpenandCombine_embsV2.ijm) array embrioni da una data condizione RNAi in un file ImageJ composito che arrays il campo luminoso e le proiezioni di intensità massima per ogni embrione in ogni punto temporale. Mentre viene evidenziato solo un esempio, questa macro può compilare i dati per molte condizioni RNAi contemporaneamente. La macro ImageJ è disponibile su^{.enodo 12}. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo lavoro descrive una suite di strumenti e metodi che sono stati sviluppati per consentire sforzi su larga scala per profilare la funzione dei geni nello sviluppo embrionale in C. elegans. Il nostro metodo semi-alto-velocità consente l'imaging 3D time-lapse dello sviluppo embrionale a 20 minuti di risoluzione per 80-100 embrioni in un unico esperimento. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l'uso con qualsiasi ceppo o ceppo di marcatori desiderato, questo lavoro dimostra il potenziale del metodo utilizzando due ceppi personalizzati sviluppati per monitorare gli eventi durante l'embriogenesi: (1) un ceppo di reporter a strato germinale, in cui promotori guidano l'espressione di istoni fluorescenti per segnare i nuclei di endodermia, mesodermia ed ectodermi, e (2) un ceppo di reporter di morfogenesi, che utilizza promotori epidermici e neuronali per guidare l'espressione di marcatori fluorescenti nelle giunzioni cellulari e la membrana plasmatica. Esaminando i due ceppi, le conseguenze delle perturbazioni molecolari sulla specifica del destino cellulare e sugli eventi morfogenetici possono essere catturate con dettagli notevoli. Per affrontare le sfide poste dalla quantità di dati generati da questo metodo, sono stati sviluppati strumenti personalizzati allo scopo di semplificare l'elaborazione e la visualizzazione dei dati. Il primo strumento coltiva singoli embrioni da un campo di embrioni in sequenze di time-lapse 3D, ruotando al contempo gli embrioni in un orientamento anteriore-posteriore standard ed eseguendo la sottrazione in background, la correzione della deriva e la correzione dell'attenuazione. Questo programma è stato confezionato come una GUI user-friendly (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w) e il codice sorgente e una versione batch più avanzata del programma per gli utenti esperti Python (github.com/renatkh/embryo_crop.git) è fornito^10,12,13. Infine, per visualizzare questi dati elaborati in un formato significativo, è stata ideata una macro ImageJ; questo permette all'utente di visualizzare tutti gli embrioni da una determinata condizione di RNAi in un filmato multi-pannello, che mostra una proiezione di intensità massima e di campo luminoso per ogni embrione in ogni punto temporale. Insieme, i ceppi, il protocollo e gli strumenti di elaborazione dei dati, si sforzano di studiare l'embriogenesi di C. elegans su larga scala in uno sforzo più fattibile.

Anche se semplice da implementare nel complesso, il metodo di acquisizione semi-alto-velocità descritto di seguito richiede attenzione ad alcuni dettagli critici, che sono descritti di seguito. In primo luogo, gli utenti devono avere accesso a un microscopio confocale con capacità di visita di precisione che può essere equipaggiato con un supporto a piastra multi-pozzo. La considerazione più critica per questo protocollo è che il microscopio sia mantenuto in una stanza a temperatura controllata. Mentre molti microscopi hanno la capacità di riscaldare, la maggior parte non può raffreddare in modo affidabile, quindi la temperatura ambientale deve essere adattata per mantenere una temperatura amichevole costante C. elegans. Per raggiungere questo obiettivo, la sala di imaging si tiene a 16 gradi centigradi. L'area campione dello strumento si riscalda fino a 21-23 gradi durante l'imaging. Le fluttuazioni della temperatura ambiente possono influenzare i tempi di sviluppo e alterare sottilmente la precisione del piano focale durante la visita del punto e devono essere evitate il più possibile. Si noti che l'esecuzione a temperature superiori a2: 23 gradi centigradi può provocare un notevole picco di letalità embrionale per le condizioni di controllo e non è consigliabile. Un'altra considerazione fondamentale è la selezione e la dispersione degli embrioni durante la dissezione. Occorre prestare attenzione a evitare di trasferire embrioni più vecchi nei pozzi di imaging, poiché, dopo la schiusa, gli animali tendono a non sperare gli embrioni adiacenti; l'incidenza di questo è diminuita dall'inclusione di anestetico nei media. La dispersione degli embrioni, per evitare grandi ciuffi di embrioni, è anche una variabile critica. L'agglomerazione tende a verificarsi quando gli embrioni vengono trasferiti ai pozzi in pipetti capillari troppo sottili o quando gli embrioni non sono sufficientemente dispersi durante la dissezione. Un'altra considerazione è che la selezione dei punti e la messa a punto del piano focale richiede tempo. La piastra non viene tenuta sul ghiaccio durante questo processo, quindi gli embrioni iniziano a svilupparsi immediatamente. Per i ceppi di marcatori personalizzati utilizzati in questo studio, c'è circa una finestra di 90 min dopo che la piastra è stata rimossa dal ghiaccio per eseguire la scansione della piastra e la selezione dei punti prima che i marcatori inizino a essere espressi. Questo è il tempo sufficiente per impostare sul nostro strumento con questi ceppi, ma altri microscopi e ceppi possono offrire ulteriori sfide di tempo che richiederanno la risoluzione dei problemi. Infine, il metodo che descriviamo impiega un obiettivo di olio 60x per raccogliere z-stack di 50 campi a intervalli di tempo di 20 min. Come evidenziamo, la risoluzione temporale può essere aumentata diminuendo il numero di campi immagine. Ad esempio, 10 campi possono essere immagini con risoluzione temporale di 4 min. Una seconda alternativa per aumentare la risoluzione temporale consiste nell'utilizzare un obiettivo di ingrandimento numerico ad alta apertura inferiore; in questo caso, il campo visivo più ampio consente l'imaging di un gran numero di embrioni a una risoluzione temporale più elevata con solo una moderata riduzione della risoluzione spaziale.

Per consentire l'elaborazione e la visualizzazione dei dati su scala più ampia, abbiamo creato strumenti personalizzati e li abbiamo resi disponibili gratuitamente. Lo strumento più utile è la GUI di ritaglio personalizzata, che non richiede alcuna competenza di programmazione per funzionare. La GUI può essere utilizzata per ritagliare e orientare gli embrioni in tutte le fasi dello sviluppo ed è compatibile con tutti i marcatori, rendendolo utile non solo per i biologi dello sviluppo, ma anche per i ricercatori che studiano i processi nell'embrione precoce. Poiché l'output della GUI viene ritagliato con precisione, orientato, scalato, dati corretti alla deriva, i dati possono essere facilmente incanalati in una pipeline di analisi automatizzata, rendendo questo strumento utile per l'analisi dei dati passati e futuri; se vengono utilizzati ceppi appropriati, i file di dati risultanti possono essere utilizzati come input per i regimi di analisi automatizzata esistenti, come gli strumenti di allineamento dell'embriogenesi²⁵. Per utilizzare il programma, è importante che gli utenti siano consapevoli del fatto che l'algoritmo di ritaglio richiede una raccolta di un'immagine di campo luminoso o DIC per ogni passaggio e punto temporale. Inoltre, gli utenti dovrebbero notare che l'algoritmo di orientamento anteriore-posteriore è strutturato in base alla distribuzione del segnale rosso nei ceppi del rapporto del rapporto germinale e morfogenesi, mostrato in questo lavoro. Pertanto, l'accuratezza dell'orientamento AP in altri ceppi di marcatori dovrà essere valutata caso per caso. La GUI è stata testata con i dati raccolti su tre diverse piattaforme di imaging confocale ed è compatibile su tutta la linea per stack multi-tiff e serie tiff. Oltre alla versione user-friendly, il codice sorgente per la GUI e una versione batch di questo programma è stato anche reso disponibile, con l'avvertenza che l'esperienza di programmazione è necessaria, e le strutture di file e le convenzioni di denominazione dovranno essere seguite. Infine, è stata creata una macro di elaborazione ImageJ per prendere pile di immagini grezze per tutti gli embrioni, in ogni condizione di RNAi, e compilare un array informativo per mostrare tutti gli embrioni per quella condizione in luminosità e fluorescenza proiezione di intensità massima in ogni momento. Questo strumento può essere adattato alle specifiche dell'utente ed è una macro utile per semplificare l'esplorazione dei dati e la valutazione del controllo qualità.

Insieme, il metodo di ripresa semi-alto-velocità insieme agli strumenti di ritaglio degli embrioni e di elaborazione delle immagini descritti qui, faciliterà l'analisi dello sviluppo embrionale di C. elegans utilizzando una varietà di mutanti, perturbazioni e ceppi marcatori. Nel nostro laboratorio, è attualmente in corso uno schermo su larga scala che impiega questi metodi per filmare embrioni dei due ceppi ingegnerizzati personalizzati descritti qui dopo il knockdown di 2.000 geni necessari per lo sviluppo. Infine, i dati di questo sforzo serviranno come ulteriore risorsa per migliorare gli sforzi per comprendere le specifiche del destino cellulare e gli eventi morfogenetici durante l'embriogenesi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832