Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الجرذ ماماري زرع الخلايا الظهارية في وسادة الدهون البيضاء Interscapular

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60401
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

تصف هذه المقالة طريقة زرع لتطعيم الخلايا الظهارية الثديية الفئران المانحة في وسادة الدهون البيضاء interscapular من الحيوانات المتلقية. ويمكن استخدام هذه الطريقة لفحص آثار المضيف و/ أو المانحة على تطور ظهارة الثديية ويلغي الحاجة إلى المقاصة المسبقة ، وبالتالي توسيع نطاق فائدة هذه التقنية.

Abstract

في وقت مبكر من 1970s، وقد نجح الباحثون في زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانتربوبي للفئران. تطعيم ظهارة الثديية باستخدام تقنيات زرع يستفيد من البيئة الهرمونية التي يوفرها المضيف القوارض المراهق. هذه الدراسات هي مناسبة بشكل مثالي لاستكشاف تأثير التلاعب البيولوجي المختلفة على تطور الغدة الثديية وتشريح العديد من جوانب بيولوجيا الغدة الثديية. ميزة شائعة ، ولكنها محدودة ، هي أن الخلايا الظهارية المزروعة تتأثر بشدة بستروما المحيطة وتفوقت عليها ظهارة ذاتية . للاستفادة من الأنسجة الثديية الأصلية ، يجب مسح وسادة الدهون البيضاء البطنية لإزالة ظهارة الثديية المضيفة قبل عملية الزرع. عقبة رئيسية عند استخدام نموذج الكائن الحي الفئران هو أن إزالة شجرة الثدييالنامية في الفئران بعد الفطم ليست فعالة. عند زرعها في منصات الدهون خالية من الغدة، يمكن للخلايا الظهارية المانحة إعادة ملء وسادة الدهون المضيف ة التي تم تطهيرها وتشكيل غدة ثديية وظيفية. لوحة الدهون الانفية هي موقع بديل لهذه الطعوم. ميزة رئيسية هي أنه يفتقر إلى هياكل القناة بعد يوفر ستروما العادية التي هي ضرورية لتعزيز النمو الظهاري ويمكن الوصول إليها بسهولة في الفئران. ميزة رئيسية أخرى لهذه التقنية هي أنها طفيفة التوغل ، لأنها تقضي على الحاجة إلى التكي وإزالة شجرة الثديية الذاتية المتنامية. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي وسادة الدهون الانفيسية على وعاء دموي وسطي يمكن استخدامه لفصل مواقع التطعيم. لأن الغدد الذاتية لا تزال سليمة، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للدراسات التي تقارن الغدة الثديية الذاتية إلى الغدة المزروعة. تصف هذه الورقة طريقة زرع الخلايا الظهارية الثديية في وسادة الدهون البيضاء الانجيلية للفئران.

Introduction

تطور الغدة الثديية بعد الولادة ومورفوجينيسيس القناة هي عمليات تتأثر إلى حد كبير بالإشارات الهرمونية في بداية سن البلوغ. في الفئران والجرذان ، والكائنات الحية النموذجية الشائعة الاستخدام لبيولوجيا الغدة الثديية ، تبدأ هذه العملية حوالي 3 أسابيع من العمر ، حيث يؤدي الانتشار السريع والتمايز إلى تكوين parenchyma الناضجة. يمكن أن تخضع الغدة الثديية الناضجة لجولات عديدة من التوسع والتمدد ، وهي خاصية تخضع للتحقيق منذ أوائلالقرن العشرين. في سياق الانتشار المفرط وتطور السرطان ، تم تطوير تقنيات زرع الغدة الثديية في 1950s1، وعززتها المنهجية الكمية التي ساهم بها غولد وآخرون في عام 19772،3،4. وقد ساهم صقل تقنية زرع في القوارض في التقدم الكبير في فهم علم الأحياء الغدة الثديية العادية التي لا تزال تستخدم على نطاق واسع لدراسة تأثير العلاجات المختلفة والتلاعب الجيني على تطور الغدة الثديية الطبيعية وحالات المرض.

وقد تم إنشاء العديد من الفرضيات واختبارها في وقت لاحق باستخدام زرع الغدة الثديية ، التي وصفها لأول مرة DeOme وآخرون في عام 19591. وأظهرت التجارب عبر عدة عقود ميل الأنسجة القناةية التي تم استئصالها من الغدد الثديية المانحة لإعادة ملء كامل لوحة الدهون5،6،7 وأشار إلى أن عنصرا حاسما من نمو الغدة الثديية يكمن في هذه الهياكل الظهارية. أظهرت الدراسات اللاحقة في الفئران أن خلية جذعية مامية واحدة يمكن أن تعيد ملء وسادة الدهون التي تم تطهيرها وساهمت في اكتشاف ذرية واحدة مشتركة من الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والإنارة8،9،10. وتمشيا مع هذه الاستنتاجات، فقد اقترح أن زرع يزيد من مجموعة من الخلايا مع تعدد المجالات إعادة إسكان المحتملة نتيجة لللدونة، مما يسمح للخلايا المطعمة لتنمو الغدة الثديية وظيفية7،10،11،12،13. الأهم من ذلك ، فإن استخدام تقنيات زرع في القوارض يتغلب على قيود التشوهات الناجمة عن زراعة الخلايا14 وغالبا ما يوفر نتائج في غضون أسابيع فقط.

في حين أن الإجراء كان يوصف في الأصل في سياق آفات ما قبل النيوبلاستيك في الفئران ، سرعان ما تم توسيعه ليشمل الفئران واستخدمه بالتزامن مع علاج المواد المسرطنة لإنشاء التعدد كمقياس لقابلية السرطان15، ولكن شعبية تقنيات الزرع تابعت تطوير الأدوات الوراثية لكل نوع. على الرغم من أن دراسات الماوس التي تتضمن زرع ساهمت في العديد من النتائج الانتقالية، فإن parenchyma من الغدة الثديية الفئران يشبه الإنسان بشكل وثيق أكثر16،17 ويقدم مزايا متميزة لدراسة مستقبلات هرمون الاستروجين إيجابية (ER +) سرطان الثدي. الأورام الثديية غير قابلة للاختزال في كلا النوعين ، ولكنها تختلف من حيث حساسية الهرمونات وملامح التعبير الجيني. والفرق الأساسي هو أن الأورام الثديية الفئران التعبير عن وتعتمد على وظيفة مستقبلات هرمون المبيض والغدة النخامية، وهي، الإستروجين والبروجستيرون (PR)، على غرار النوع الفرعي من سرطان الثدي البشري. في الواقع ، تم استخدام زرع الخلايا الظهارية الثديية ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لدراسة المتغيرات الجينية المشاركة في سرطان الثدي وتحديد الاستقلال ية الخلوية للآثار على الخلايا الظهارية الثديية18.

بالإضافة إلى بيولوجيا الورم ، يعرض ظهارة القناة في الغدة الثديية العادية للفئران مستوى أعلى من التفريع وتحيط به طبقة أكثر سمكًا من ستروما من الماوس. أهمية ستروما موثقة بشكل جيد في دراسات زرع الظهارية الثديية. يجب أن تتفاعل ظهارة مامماري مع ستروما الدهنية ، ومن الناحية المثالية mesenchyme الخاصة بها ، للخضوع لمورفوجينيسيس مميزة19،20. تطعيم الأنسجة في الغدة الثديية المتلقي يوفر بيئة مثالية; ومع ذلك ، فإن وجود ظهارة ذاتية يمكن أن تتداخل مع النتائج. يتم إجراء تطهير الغدة الثديية من ظهارة الذاتية عادة في عينات زرع الفئران ويتطلب الختان الجراحي للأنسجة الثديية الذاتية و / أو إزالة الحلمة1،21،22. على الرغم من أن ذلك ممكن، فإن التبذّر المُسبّل في الفئران بعد الفطم ليس على نطاق واسع، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم فعالية إزالة شجرة الثديية المتنامية في الفئران بعد الفطمة. منذ وقد ثبت أن مناطق الأنسجة الدهنية في مكان آخر من الجسم يمكن أن تدعم نمو ظهارة الثديية المزروعة21،23،24، يمكن تجنب عملية المقاصة بسهولة في الفئران عن طريق تطعيم الأنسجة في وسادة الدهون البيضاء interscapular.

تتضمن طريقة الزرع الموصوفة في هذه الورقة حقن عضويات الغدة الثديية المنفصلة بشكل أنزيمي (أجزاء من ظهارة القناة الثديية وأنواع الخلايا الأخرى القادرة على النشوء المورفولوجي) أو الخلايا أحادية التشتت في وسادة الدهون البينية في سلالات الفطرية أو الأيجينية أو الجينية للفئران المختبرية2. لأن وسادة الدهون الانفيسية عادة ما تخلو من الأنسجة الثديية، فإنه يوفر بيئة مناسبة لمواقع زرع متعددة دون الحاجة إلى مسح الظهارة الذاتية مسبقا. ونتيجة لذلك ، فإن الغدد الثديية الذاتية البطنية للالحيوان المضيف لا تخضع للتلاعب الجراحي ، وتتطور بشكل طبيعي ، ولا يمكن أن تتداخل مع تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الغدد الثديية السليمة للمقارنة لتقييم آثار المضيف مقابل المانحين على تطور ظهارة الثدي والورم18،25. على الرغم من أن إعادة انتشار الغدة الثديية من خلية جذعية واحدة متاحة للفئران ، إلا أنها لم يتم تطويرها بعد للفئران ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى عدم توفر الأجسام المضادة لاختيار الخلايا الجذعية الثديية للفئران25،26،27. على الرغم من هذا ، يمكن إجراء زرع الخلايا الظهارية الثديية أحادية التشتت لتحديد إمكانات إعادة التهوم بنجاح ، وسوف تتطور هذه الخلايا بشكل طبيعي عند تطعيمها في الإطار المناسب2،3،4. في حين أن الأجهزة الاعضاء جيدة لأغراض عديدة ، فإن الخلايا أحادية التشتت مطلوبة للتطبيقات الكمية ، على سبيل المثال ، لتحديد عدد الخلايا الظهارية الثديية اللازمة لبدء السرطان بعد العلاج الإشعاعي المؤين28 أو لمقارنة خصائص التدفق المختار بالخلايا الثديية المختارة بالخلايا الظهارية29.

حتى الآن ، فإن الإجراء الموصوف هنا هو أقوى طريقة لإجراء زراعة الغدة الثديية في الفئران مع هدف عام هو دراسة تطور الغدة الثديية والآليات الكامنة وراء تطور سرطان الثدي. في كثير من الأحيان ، يتعرض المتبرع و / أو الحيوانات المتلقية لمتغيرات مختلفة قبل أو أثناء أو بعد زرع الظهارية. ومن الأمثلة على ذلك دراسات الجينات الواحدة التي تنطوي على التسرطن الكيميائي30، الإشعاع28،31،32، التلاعب الجيني للجينوم المضيف / المانح18، والتلاعب الهرموني12. ومن المزايا الرئيسية للانفصام الأنزيمي الموصوف في هذا البروتوكول هو فرصة لعزل الاعضاء الظهارية أو الخلايا أحادية التشتت للتجارب التكميلية التي تنطوي على تدفق الخلايا، والثقافة ثلاثية الأبعاد، وتحرير الجينات، وأكثر من ذلك. وستشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية التلاعب الإضافي بالأنسجة المانحة و/أو المضيفة بالهندسة الوراثية. على سبيل المثال، يمكن تغيير الخلايا المانحة وراثيًا في أي مكان جينومي مختار باستخدام نظام تحرير الجينات CRISPR-Cas9. وبالمثل، يمكن أيضا ً تغيير الفئران المتلقية وراثياً لدراسة التفاعل بين العوامل الوراثية المهندسة للمانحين والمتلقين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء جميع الحيوانات وصيانتها في منشأة معتمدة من AAALAC ، وتمت الموافقة على التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC). يجب أن تكون الحيوانات للاستخدام في الزرع المتبادل سلالة أصيلة أو isogenic ، مع الوضع المتجانس المفضل أو متبدى للخلف لمدة 6 أجيال على الأقل.

1. حصاد المتبرعين الفئران مامماري الغدة ظهارة

  1. تحديد عدد الفئران المانحة اللازمة لزرع.
    ملاحظة: بشكل عام، يمكن لفأر متبرع واحد (4 أسابيع من العمر) أن يوفر خلايا كافية لزرعها في 4 الحيوانات المتلقية. بعض التطبيقات من هذا البروتوكول سوف تتطلب أعداد إضافية من الخلايا، ويمكن أن يكون هناك اختلافات سلالة محددة في إجمالي العائد.
  2. تسمية جميع اللوازم وضمان وضع يمكن الوصول إليها للجراح(الجدول 1).
  3. سجل وزن جسم كل أنثى من الفئران المانحة. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للتطفل بشكل كامل أو القتل الرحيم الفئران المانحة. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
  4. نقل الحيوان إلى الحقل الجراحي العقيم. وضع الحيوان على ظهره ورش كامل سطح البطن مع الإيثانول 70٪.
  5. جعل القوس، شق على شكل X، مما يسمح بالوصول إلى الغدد الثديية الصدرية والبطنية والابلية. تشريح جميع أنسجة الغدة الثديية من الفئران المانحة باستخدام مقص(الشكل 1). إزالة جميع الغدد الليمفاوية مرئية.
  6. استخراج الأنسجة الثديية باستخدام ملقط ووضعها في طبق 60 ملم المسمى على الجليد. أضف 500 ميكرولتر من وسائط DMEM/F12 الخالية من المصل إلى الطبق 60 مم. ضبط موضع أنسجة الغدة الثديية بحيث يبقى الرطب تماما.
  7. فرم الأنسجة الثديية بدقيقة باستخدام المقص. للقيام بذلك، وقطع الأنسجة إلى قطع 1-2 ملم3 في الحجم(الشكل 1C). الحفاظ على الغدة على الجليد حتى تم حصاد جميع الأنسجة المانحة (لا تتجاوز 60 دقيقة).
    ملاحظة: يمكن للموظفين الإضافيين أن ينموا الغدد الثديية وأن يعدوا محلول الكولاجين بالإضافة إلى ذلك بينما يمضي الجراح في عمليات استخراج الأنسجة.

2. استخراج أنسجة الدماغ من المتبرعين القتل الرحيم

  1. بدوره بعناية الجسم من الحيوان المانحة أكثر لوضعها في موقف عرضة. آمن بدبابيس. رش الرأس والظهر العلوي مع الإيثانول 70٪.
  2. تحديد موقع قاعدة الجمجمة وجعل شق تحت البثور القذالي. أدخل مقصًا حادًا أسفل الجلد واقطع الجلد بعيدًا عن الجمجمة، بما في ذلك جانبي الرأس.
  3. استخدام قطع العظام أو مقص قوي لقطع الجمجمة على طول خط الوسط، من القذالي إلى العظام الأمامية. الحفاظ على شفرة سطحية قدر الإمكان وزاوية إلى أعلى لمنع تدمير أنسجة الدماغ الكامنة.
  4. قشر العظام بعيدا باستخدام rongeurs أو ملقط قوية. أدخل الأداة الجانبية إلى المخيخ لكسر العظام على كلا الجانبين ، مما يعرض القناة السمعية العظمية. قطع الاتصالات إلى meninges.
  5. ارفع الدماغ برفق باستخدام ملقط منحني وناعم. وضع الدماغ على قطعة من احباط وتسجيل الوزن، ومن ثم نقل على الفور إلى أنبوب 15 مل مع كمية متساوية (ث:v) من وسائل الإعلام، وتخزينها على الجليد.
    1. اختيارياً، استخدم ملقط الطرف الدقيق لإزالة الغدة النخامية (الموجودة تحت الدماغ) للاستخدام الإضافي في إجراء الزرع، إذا لزم الأمر.
  6. استخدام المتجانس الميكانيكية لتعطيل الأنسجة. تجانس الدماغ لمدة 10-15 s على سرعة منخفضة. دع الخليط يُجلس على الثلج لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم يتجانس مرة أخرى. التجانس يكفي عندما يكون الخليط النهائي خاليًا من القطع الكبيرة.
  7. تصفية التجانس عن طريق تمريرها من خلال مرشح 100 ميكرومتر. الحفاظ على filtrate على الجليد حتى الاستخدام (أقل من 4 ساعة).

3. هضم وتجهيز مستخلصات الغدة الثديية

  1. إذابة أو الكواشف الدافئة كما هو مبين(الجدول 1). اتبع الخطوات المناسبة لاستعادة الاعضاء أو الخلايا أحادية التشتت.
  2. إعداد 10 مل من وسائل الإعلام الهضم خالية من المصل (دون الكولاجين) لكل الحيوانات المانحة(ملف تكميلي 1).
    ملاحظة: يمكن تعديل حجم وسائط الهضم المستخدمة (تحجيمها لأعلى أو لأسفل) لاستيعاب الأنسجة المجمعة، إذا كان ذلك ممكنًا.
    1. للorganoids تخطي إلى 3.3.
    2. للخلايا أحادية التشتت، وإعداد خليط أحادي التشتت الطازجة والحل التعطيل(ملف تكميلي 2، ملف تكميلي 3)بالإضافة إلى وسائل الإعلام هضم الكولاجين خالية من المصل. انتقل إلى الخطوة 3.3.
  3. عندما يتم استخراج جميع الأنسجة الثديية من المتبرعين والمفروم، إضافة إنزيم الكولاجين إلى وسائل الإعلام الهضم الحارة (أو درجة حرارة الغرفة)(ملف تكميلي 1). مزيج عن طريق عكس.
  4. تمرير وسائط الهضم collagenase من خلال مرشح 20 ميكرون. الاستغناء 10 مل من وسائل الإعلام المصفاة في أنابيب 50 مل المسمى للهضم.
  5. استخدم نصيحة ماصة جديدة تبلغ 1000 ميكرولتر لكل عينة ونقل الأنسجة المانحة المفرومة من كل طبق 60 مم إلى أنبوب هضم الكولاجين. قطع 1 سم من نهاية تلميح 1000 ميكرولتر ووضعه يدويا على الجهاز قبل الاستخدام. مزيج بلطف الأنسجة المفرومة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 1-2 مرات.
    ملاحظة: إذا كان من الصعب على الأنسجة ماصة أثناء نقل, استخدام كمية صغيرة من وسائل الهضم collagenase من أنبوب 50 مل, ومن ثم نقله مرة أخرى.
  6. ضع العينات في الموضع الأفقي في حاضنة اهتزاز والسماح للعينات لهضم 1.5-2 ساعة في 37 درجة مئوية، 200-220 دورة في الدقيقة.
    1. للorganoids تخطي إلى 3.7.
    2. للخلايا أحادية التشتت إضافة DNase الأول (0.2 ميكروغرام / مل) إلى الخليط لآخر 10 دقيقة من الهضم. احتضان كما كان من قبل، مع اهتزاز قوية. انتقل إلى الخطوة 3.7.
  7. عندما يتم هضم الأنسجة بالكامل ، بيليه التعليق باستخدام الطرد المركزي البارد (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة في 1200 × ز (الشكل 1D).
    ملاحظة: احتفظ بالأنابيب على الجليد بين كل خطوة لزيادة قابلية الخلايا للحياة.
  8. تأكد من أن بيليه قد شكلت، ومن ثم صب بعناية قبالة طبقة supernatant والدهون. إعادة تعليق بلطف بيليه في 10 مل من وسائل الإعلام DMEM/F12 الطازجة.
  9. تدور لفترة وجيزة في 68 × ز لحوالي 10 s. يمكن زيادة طول الدوران (ولكن ليس السرعة) إذا لم يكن هناك فصل واضح للخلايا. فحص بصريا بيليه قبل المضي قدما(الشكل 1D).
  10. إزالة بعناية supernatant، وترك وراءه حجم صغير. انتقل إلى الخطوة التالية ، استنادًا إلى ما إذا كانت هناك حاجة إلى الخلايا الاعضاء أو الخلايا أحادية التشتت.
    ملاحظة من المهم أن تترك حجم صغير من وسائل الإعلام في أنبوب لأن بيليه سوف تكون فضفاضة جداً. سيتم تخفيف حجم الوسائط المتبقية من خلال خطوات الغسيل.
    1. بالنسبة للأعضاء، أضف حجم 10 مل أخرى من وسائط DMEM/F12 وكرر الغسيل/الدوران. بعد الغسيل الثاني، قم بإعادة تعليق الخلايا في حجم أصغر (1-2 مل) من وسائط DMEM/F12 للترشيح. انتقل إلى الخطوة 3.11.
    2. للخلايا أحادية التشتت، تذوب في 2 مل من HBSS درجة حرارة مسبقة مع 0.025٪ (ث / v) التربسين و 6.8 mM EDTA. هضم لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية. تعطيل فورا.
      1. إضافة 4 مل من DMEM/F12 مع FBS 10٪ لوقف تعطيل التربسين.
      2. قم بتدوير الخلايا عند 270 × ز لمدة 5 سنوات، ثم أعيد تعليقها في DMEM/F12 مع FBS بنسبة 10٪ مرة أخرى. انتقل إلى الخطوة 3.11 لتصفية الخلايا.
  11. تصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرون وضعت في أنبوب جديد 50 مل. قبل الرطب مصفاة عن طريق pipetting 1 مل من نفس الوسط قاعدة تستخدم لتعليق الخلايا، ومن ثم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح باستخدام ماصة لجمع شظايا القناة / organoids.
    ملاحظة: العائد التقريبي للظهارة المصفاة من أنسجة الغدة الثديية لفأر متبرع واحد عمره 4 أسابيع هو 1 × 106 خلايا.
    1. بالنسبة للأعضاء، تجاهل الفيرات. سوف تبقى الاعضاء الثديية داخل سلة مصفاة الخلية وسيتم القضاء على أصغر, الخلايا غير المرغوب فيها. عكس مصفاة الخلية على أنبوب جديد 50 مل، وشطف مع أي حجم اللازمة لجمع الخلايا. انتقل إلى الخطوة 3.12.
    2. بالنسبة للخلايا أحادية التشتت، تخلص من مصفاة الخلية والحفاظ على الفيلتر لأن الخلايا الظهارية الثديية ستمر عبر الفلتر، إلى جانب الخلايا المترفية والمناعية الأصغر. شطف الأنبوب الذي كان يستخدم للهضم / الطرد المركزي مع حجم آخر من DMEM/F12 مع FBS 10٪ وتمر من خلال مصفاة الخلية نفسها. بيليه الخلايا أحادية التشتت عن طريق الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 5 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 3.12.
      ملاحظة: الخلايا التي تم إعادة تعليقها جاهزة للتطبيقات اللاحقة.
  12. نبض تدور الحل وضمان تشكيل بيليه الخلية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. نبض تدور مرة أخرى، إذا لزم الأمر.
  13. إزالة بعناية supernatant. إعادة تعليق بيليه في حجم صغير (1000-2000 ميكرولتر من DMEM/F12) لتركيز الخلايا للعد.
  14. عد الخلايا ويخفف إذا لزم الأمر. إعادة تعليق العدد المطلوب من الخلايا للزرع في 20 ميكرولتر من وسائط DMEM/F12 لكل الحيوان. دائماً ما تبقي الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: عددالخلايا المانحة في نطاق 1 × 105 - 1 × 10 6 خلايا ستكون مطلوبة لكل موقع الكسب غير المشروع على أساس نقطة النهاية للدراسة. على سبيل المثال، غالبًا ما تتطلب تجارب التسرطن عددًا أكبر من الخلايا المزروعة، مقارنة بالتطبيقات الأخرى. يجب تحديد عدد الخلايا اللازمة تجريبيا لكل سلالة. استخدم الإجراء الموصوف في هذا البروتوكول 250,000 خلية مانحة في 20 ميكرولتر من الوسائط لكل موقع الكسب غير المشروع، قبل الاختلاط بتجانس الدماغ، كما هو موضح في الخطوة 3.16.
  15. إعداد أي aliquot (ليالي) من الخلايا اللازمة للتجارب الأخرى (على سبيل المثال، عزل FACS3،26،27،30،33).
    1. بالنسبة للأعضاء، انتقل إلى الخطوة 3.16.
    2. بالنسبة للخلايا أحادية التشتت، قم بتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام تيبان أو تلطيخ أزرق الميثيلين، ثم تابع.
  16. إعداد دفعات واحدة من المواد المانحة لجميع المتلقين زرع. الجمع بين أحجام متساوية من تعليق الخلية (20 ميكرولتر) مع 50٪ من تجانس الدماغ (20 ميكرولتر) لكل موقع من مواقع الزرع.
    ملاحظة: سيتم حقن ما مجموعه 40 ميكرولتر لكل موقع في كل موقع، ولكن من المستحسن تضمين ما لا يقل عن 25٪ حجم إضافي للنفايات.
  17. الشروع فورا في زرع أو تجميد الخلايا لزرع في وقت لاحق (نقطة توقف محتملة).
    ملاحظة: لم يتم اختبار الخلايا المجمدة مع هذا البروتوكول وسوف تتطلب التحسين مقدما لتوليد مجموعة من الحيوانات لتجارب زرع. يوصى بشدة بزرع خلايا طازجة.

4. إجراء زرع (الفئران المتلقي 4-5 أسابيع من العمر)

  1. وزن كل الفئران المتلقي وحساب الجرعة الصحيحة من المسكنات المعتمدة التي سيتم استخدامها في الإجراء.
    ملاحظة: يمكن قياس أوزان الجسم حتى 24 ساعة قبل الإجراء. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لتقييد أو لفترة وجيزة للتطفل على كل الحيوان لمدة الحلاقة.
  2. اغسل المنطقة الجراحية على كل من الحيوانات باستخدام المقصات الكهربائية. تحديد قاعدة الجمجمة وبداية العمود الفقري. تقريبا ثلث الطريق أسفل العمود الفقري، ومثل 3 سم × 2 سم منطقة على الجزء العلوي من الصدر من الظهر.
    ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء الحلاقة تحت التخدير في يوم الزرع ولكن يجب إجراؤها خارج الحقل المعقم. إعادة الجرذ إلى قفص المنزل حتى تكون هناك حاجة إليها.
  3. تحديد موقع جميع الإمدادات اللازمة للزرع(الجدول 1).
  4. تقييم نظام التخدير الحيواني المختبري قبل الاستخدام. قم بخلع أي سوائل واستبدل أي خزانات أو أجزاء مطلوبة. تأكد من أن خط الغاز إلى غرفة التخدير مفتوح وجميع الخطوط الطرفية مغلقة حتى التخدير isoflurane والأكسجين قد تتدفق بحرية إلى الحيوان بمجرد وضعه في الغرفة.
  5. منصات التدفئة الدافئة لدعم درجة حرارة الجسم من الحيوانات المتلقية.
  6. توليد الحقل المعقم الذي سيتم استخدامه للجراحة. ترتيب الإمدادات كما هو موضح في الجدول 1.
  7. إعطاء المسكنات قبل الجراحة للفئران المتلقية كما هو مبين في بروتوكول رعاية الحيوان المعتمد ة مؤسسيا.
  8. مسح المحاقن هاملتون مع وسائط DMEM/F12 المعقمة لمنع فقدان الخلايا. تأكد من أن الإبرة مؤمنة إلى جسم الحقنة ، وأدخل الإبرة في السائل ، واسحب المكبس مرة أخرى. التعبئة إلى الحد الأقصى لوحدة التخزين. اضغط على المكبس لأسفل وطرد محتويات في أنبوب جمع النفايات. كرر 3-5 مرات.
  9. تحميل الحجم الكامل للمواد المانحة (أعدت في الخطوة 3.16) في حقنة منفصلة لكل حالة (على سبيل المثال، السيطرة، المعالجة، البرية، خروج المغلوب، الخ). أدخل طرف الإبرة في السائل ، واسحب المكبس مرة أخرى والحفاظ على الإبرة تحت سطح الخليط مع انخفاض الحجم في الأنبوب.
    ملاحظة: قم بتضمين حجم إضافي بنسبة 10% على الأقل في كل حقنة. لا تتخلص من الخليط المتبقي أغلق الأنبوب وأبقه على الجليد في حالة الحاجة إلى المزيد.
  10. عكس الحقنة بعد تحميلها بالكامل واضغط على المكبس قليلا لإزالة فقاعات الهواء في غيض من الإبرة. انتقل إلى الخطوة التالية عندما يتم إعداد كل شيء.
    ملاحظة: تأكد من أن طرف الإبرة لا يمس أي سطح آخر، حتى داخل الحقل المعقم. من المفيد أن بقية الجسم من حقنة على وعاء صغير من الجليد لتعزيز صلاحية الخلايا.
  11. ضع الحيوان المتلقي في غرفة التخدير وشغّل الجهاز.
  12. عندما يكون الحيوان مسترخيًا تمامًا (لا يتفاعل مع التنصت على الحركة أو الحركة اللطيفة للغرفة) ، وجه التخدير إلى مخروط الأنف ونقل الحيوان إلى الحقل العقيم.
    ملاحظة: لا يتم تحمل مدة طويلة من التخدير جيد ًا من قبل الفئران. إكمال الإجراء لكل الحيوانات في 10 دقيقة أو أقل.
  13. وضع الحيوان في موقف عرضة (على معدته) بحيث يمكن الوصول إلى الجزء الخلفي من الرأس والعمود الفقري العلوي.
    ملاحظة: ضمان دعم الحرارة الكافية للللحيوانات في جميع الأوقات وتقييم بانتظام عمق التخدير باستخدام قرصة إصبع القدم شركة.
  14. اختياريا، تطبيق مرهم طبيب بيطري العيون لمنع جفاف العينين.
  15. تنظيف المنطقة الحليقة الطازجة لإزالة الشعر الزائد. استخدام حركة دائرية وتطبيق الإيثانول 70٪ (أو كاشف آخر، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية) على الجلد، تليها مطهر (مثل اليود)، وكرر. وضع منشفة الستائر على الحيوان حتى يتم كشف فقط المنطقة للمنطقة المنقضية.
  16. تأكد من أن الحيوان لا يستجيب للمحفزات العميقة مع قرصة إصبع القدم الثابتة ، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
  17. قم بعمل شق صغير (2 سم) بيني باستخدام شفرة جراحية حادة.
    ملاحظة: يجب أن يكون القطع سطحيًا ، حيث تقع وسادة الدهون تحت الجلد.
  18. تحديد موقع الأوعية الدموية المتوسطة للتوجيه(الشكل 2B).
  19. ارفع الجلد على جانب واحد من الشق باستخدام الملقط واحمله بعيدًا عن وسادة الدهون أثناء إجراء عملية الزرع(الشكل 2B). أدخل الإبرة في موقع الكسب غير المشروع.
    1. اختياريا، حرك طرف الإبرة داخل الأنسجة وخلق جيب صغير لجمع الخلايا. استخدام حركة صغيرة ومتكررة. لا تقم بإزالة الإبرة.
      ملاحظة: يوصى بهذه الخطوة لمستخدمي البروتوكول لأول مرة. توخي الحذر الشديد عند إنشاء جيب، كما الأنسجة لوحة الدهون الانفيسية حساسة جدا.
  20. حقن بعناية 40 ميكرولتر من خليط الخلية في أنسجة وسادة الدهون بينية. إزالة الإبرة ببطء.
  21. عقد الأنسجة في مكان والسماح للخلايا المزروعة لتسوية لمدة 3-5 s. استخدام زوج إضافي من ملقط, إذا لزم الأمر.
  22. أزل الإبرة. كرر إجراء الحقن (الخطوات 4.18-4.21) في الموقع الثاني للزرع.
    ملاحظة: يمكن حقن ظهارة من مجموعة واحدة من المانحين في نفس الجانب من وسادة الدهون في كل الحيوانات، أو الجوانب بالتناوب لمنع آثار دفعة من الهيمنة اليدوية للجراح.
  23. أغلق الجرح الجراحي باستخدام مقاطع الجروح أو الغرز، ثم توقف عن التخدير.
  24. توفير مسكن ما بعد الجراحة كما هو مبين في البروتوكول المعتمد مؤسسياً.
  25. نقل على الفور الحيوان إلى قفص الانتعاش مع دعم الحرارة. مراقبة لعلامات الضيق مثل النزيف من شق أو صعوبة في التنفس.
    ملاحظة: يجب أن يتعافى الحيوان بالكامل في غضون 5-10 دقيقة. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المؤسسية لإعادة الحيوانات إلى المستعمرة والرصد بعد الجراحة بعد إجراءات البقاء على قيد الحياة.
  26. اختياريا، إجراء دراسات التسرطن في موقع الكسب غير المشروع (ق) عن طريق إعطاء المواد المسرطنة للفئران المتلقي3-4 أسابيع بعد زرع.
    ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ التسرطن الثديي الفئران باستخدام علاج المواد المسرطنة الكيميائية في 50-57 يوما من العمر. هذا العلاج يملي عمر جراحة زرع (التي يجب أن تتم بين 29-36 يوما من العمر) لإتاحة الوقت الكافي للخلايا المطعمة لبدء نمو الغدة الثديية.

5- تقييم النمو الظهاري

  1. مراقبة دورة estrus من الفئران من خلال غسل المهبل اليومي وفحص علم الخلايا على شريحة المجهر. تبدأ 8-12 يوما قبل نقطة النهاية للدراسة. التضحية بجميع الفئران في نفس المرحلة. هذه خطوة اختيارية.
    ملاحظة: دورة estrus الفئران هو 4-5 أيام. السماح للالحيوان للذهاب من خلال 1-2 دورات كاملة سوف تسهل التفسير، كما يمكن استخدام الشرائح لافج من الدورات السابقة للمقارنة.
  2. جرذان زرع التضحية بعد 6-8 أسابيع من الزرع، حسب المبادئ التوجيهية المؤسسية.
    ملاحظة: عادة ما يكون النمو يمكن اكتشافه بعد 3-6 أسابيع من الزرع، ولكن قد يتطلب الأمر وقتًا إضافيًا.
  3. وضع الحيوان في موقف عرضة وتنظيف الجسم مع الإيثانول 70٪. رفع الجلد مع ملقط وجعل شق على طول العمود الفقري لفضح وسادة الدهون interscapular. تشريح الجلد بعيدا عن الأنسجة حتى غالبية وسادة الدهون مرئية.
  4. تحديد الأوعية الدموية اللوسطية التي تفصل بين مواقع الكسب غير المشروع في وسادة الدهون الانفية. استئصال لوحة كاملة كقطعة واحدة من الأنسجة أو قطع على طول الأوعية الدموية وإزالة الجانبين بشكل فردي.
  5. ضع الأنسجة على شريحة مجهر مشحونة بشكل إيجابي لجبل كامل. استخدام 2 أزواج من ملقط حادة ونشر بلطف الأنسجة لاستعادة تشكيلها الأصلي على الشريحة.
    ملاحظة: أنسجة الفئران الثديية حساسة للغاية. حواف الأنسجة قد حليقة تحت نفسها. تعامل دائمًا بعناية وتماسك حتى يلتصق النسيج بالشريحة (بضع ثوانٍ).
  6. كامل جبل واحد على الأقل من الغدد الثديية البطن الذاتية الإنجة (مع الغدد الليمفاوية للتوجيه) للمقارنة.
  7. وضع الشرائح في الإيثانول 70٪ لمدة 7-10 أيام لإبطال الأنسجة. تجديد الإيثانول كلما لزم الأمر لضمان الأنسجة لا تجف.
  8. إعداد وصمة عار الشب كارمين ومعالجة الشرائح عندما تكون الأنسجة مبهمة بما فيه الكفاية. السماح للوصمة لتبرد قبل الاستخدام(ملف تكميلي 4).
    ملاحظة: يمكن إعداد البقعة حتى يوم واحد قبل خطوات التثبيت والإماهة. يمكن تخزين الحل عند 4 درجات مئوية ولديه إمكانات محدودة لإعادة الاستخدام.
  9. إصلاح الأنسجة عن طريق وضع الشرائح في 25٪ حمض الخليك الجليدي: 75٪ الإيثانول لمدة 60 دقيقة.
    1. إعادة ترطيب الأنسجة من خلال سلسلة من 3 النظافة في سلسلة من انخفاض تركيز الإيثانول: 70٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 50٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة و DH2O لمدة 5 دقيقة.
  10. وصمة عار مع الشب كارمين لمدة 4-8 أيام. تحقق من الجزء الخلفي من الشرائح كل يوم لتحديد ما إذا كانت البقعة قد اخترقت الأنسجة بالكامل. انتقل إلى الخطوة التالية عند اكتمال تلطيخ.
    ملاحظة: يكتمل تلطيخ عندما يكون لأجزاء الغدة الأكثر سمكاً لون أرجواني ولا تظهر بيضاء بعد الآن.
  11. إزالة وتجفيف الأنسجة عن طريق نقل الشرائح من خلال سلسلة من التركيز المتزايد للإيثانول: 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة و 100٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  12. ضع الشرائح المجففة في الزيلين لمدة 3+ أيام لمسح الأنسجة. نقل إلى الزيوت المعدنية للتخزين على المدى الطويل.
  13. بعد مسح الشرائح، استخدم المجهر الضوئي المنخفض الطاقة أو التصوير الرقمي عالي الدقة للحصول على صور للشرائح للتحليل. تأكد من أن معلمات الحصول على الصور متناسقة لكافة الشرائح.
    ملاحظة: يجب أن يكون النمو الظهاري مميزًا بوضوح.
  14. التعامل مع وجود النمو نتيجة ثنائية.
  15. حساب متوسط عدد الخلايا الظهارية المزروعة التي أنتجت ≥ 1 نمو الثدي في 50٪ من مواقع الكسب غير المشروع باستخدام الصور المكتسبة. القياس الكمي الميزات المادية الأخرى، حسب الحاجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الغدد الثديية المانحة والمتلقية
وترد خطوات عزل وإعداد الخلايا الظهارية الثديية الفئران لزرعها في الشكل 1A. في 4 أسابيع من العمر ، بدأت الغدة الثديية الذاتية للفأر المانح النضج ويمكن تصور ظهارة على الشرائح المثبتة بالكامل الملطخة بكارمين الشب(الشكل 1B). واحد من المتبرعين الجرذ في هذا العمر سوف توفر ما يقرب من 1 × 106 خلايا لزرع. إذا كانت كمية الأنسجة المانحة التي تم جمعها أو التشبذة اللاحقة غير كافية ، فقد تكون غلة الخلايا بعد هضم الكولاجين منخفضة. على هذا النحو، من المهم جمع أكبر قدر ممكن من أنسجة الغدة الثديية من المتبرعين. يجب أن يكون لأنسجة الغدة الثديية المهضومة بالكامل مظهر دهني ، مع عدم وجود قطع مرئية من الأنسجة في التعليق(الشكل 1C). يجب أن يؤدي الهضم الكامل لأنسجة الغدة الثديية من متبرع واحد إلى تكوين بيليه مرئي يحتوي على الأعضاء الثديية ، كما هو موضح في (الشكل 1D). إذا لم يكن بيليه مرئياً، فقد يتطلب إجراء النسخة إجراء تحسين. في الشكل 2، يتم عرض الغدة الثديية للفئران ومواقع وسادة الدهون الانفية. لا يمكن تفسير النتائج ما لم يتم تحديد النقاط المرجعية البيولوجية بشكل صحيح في وقت جمع الأنسجة(الشكل 2A)وزرع(الشكل 2B). في هذا المنظار ، يتم استخدام الأوعية الدموية الوسطية لوسادة الدهون البيضاء البينية كنقطة مرجعية بيولوجية.

التقييم النوعي والكمي للنمو الظهاري
يمكن تقييم وجود أو غياب أو وفرة الظهارة لتحديد نجاح التجربة ، وكذلك استقلالية الآثار المتعلقة بالمتغيرات التجريبية. بالنسبة لهذا الأخير، قد تتطلب بعض الدراسات شرائح كاملة محمولة مع الغدة الثديية الذاتية البطن الإنجة للمضيف للمقارنة. كمقياس أولي، يمكن استخدام المجهر الخفيف لتوثيق النمو الظهاري كنتيجة ثنائية. يمكن تحليل هذه البيانات إحصائياً لاختبار فرضية أن رفض الكسب غير المشروع يعتمد على متغيرات المانحين أو المتلقيين. تجربة زرع متبادلة حيث كل من هذه العوامل لديها مستويات 2 - على سبيل المثال ، wildtype (WT) مقابل خروج المغلوب (KO) ، سيتم إنشاء 4 مجموعات زرع لاختبار الفرضية(الشكل 3A). مجموعات زرع، وأعرب عن المتبرع: المتلقي النمط الجيني، هي: WT:WT، WT:KO، KO:KO، KO:WT. عندما يتم استخدام الحيوانات الأيسيجينية أو شبه المعدلة وراثيا، رفض الكسب غير المشروع هو طفيف ة ويحدث على قدم المساواة عبر مجموعات زرع. ميزة واحدة من مواقع متعددة لزرع داخل وسادة الدهون الانتركابا هو الحد من الحيوانات المتلقية اللازمة، حيث يمكن تقييم 2 أنواع الخلايا المانحة في مضيف واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام كلا الموقعين لاختبار نوع خلية متبرع واحد بمعدل إصابة أعلى، باستخدام نفس العدد من الفئران. باستخدام النمط الجيني كمثال، يظهر هذا في الشكل 3B.

ويمكن أيضا تحليل النمَت الظهاري باستخدام صور الشرائح التي تم الحصول عليها سابقا. مثال على لوحة الدهون الانتركابلاية بأكملها التي تحتوي على نمو ظهاري في كل من مواقع الكسب غير المشروع (المسجلة كنتائج إيجابية) يظهر لتجربة باستخدام بروتوكول زرع الخلايا الثديية الموضح هنا(الشكل 3C). قد يشير نقص الظهارة في وسادة الدهون الانفيسية عبر العديد من العينات إلى وجود مشكلة تقنية في الإجراء ويتم التعامل معها كنتيجة سلبية.

ويمكن استخدام نتائج تجارب الزرع المتبادلة كذلك للتمييز بين الآثار المستقلة أو غير المستقلة للخلايا الظهارية الثديية. لاختبار الفرضية القائلة بأن التأثير مدفوع بعمليات في الخلايا الظهارية الثديية (مستقلة الخلية) أو متأثرة بالبيئة المضيفة /الدقيقة (غير مستقلة) ، يتم التعامل مع توافق النمط الظاهري للخلايا المانحة مع النمط الظاهري للمضيف (الذاتي) كنتيجة ثنائية. في مثال مثل فحص التسرطن المسرطن ، يمكن تحليل حدوث الورم كبيانات استجابة ثنائية ، وتحليل الانحدار اللوجستي المستخدم لتحديد ما إذا كان التفاعل بين المتبرع أو المضيف أو المانح والمضيف يساهم بشكل كبير في معدل حدوث الورم في موقع زرع الأعضاء. إذا كان التأثير مدفوعًا بخصائص ظهارة المتبرع ، فيمكن ملاحظة نتيجة زرع مماثلة عبر المجموعات المتلقية ، بغض النظر عن حالة المضيف. إذا تطور ظهارة المتبرع كما لو كانت داخلية للمضيف ، بسبب مساهمة النمط الجيني أو العلاج للمضيف ، فقد يكون التأثير غير مستقل. في كلتا الحالتين، يجب تفسير مجموعات الزرع التي تتطابق فيها الخلايا الظهارية المانحة مع المضيف (النفس: النفس) على أنها ضوابط، واستنتاجات مدعومة بالتحليلات الإحصائية.

لإثبات نتائج الآثار المستقلة وغير المستقلة على ظهارة المزروعة ، تم توفير توضيح(الشكل 4A)، إلى جانب شرائح من الزرع المتبادل من النوع البري وتجارب ظهارة الفئران الوحشية Cdkn1b. واقترحت نتائج هذه الدراسة غير الثديية المستقلة الخلية الآثار18 (الشكل 4B). بالنسبة لنتائج الزرع المتبادلة المصنفة كاستجابة ثنائية، يمكن اختبار احتمال ية النتيجة (على سبيل المثال، توافق النمط الظاهري لاستضافة ظهارة، أو النمو الناجح في الاختبارات الكمية) التي تعتمد على متغيرات قطعية (مثل النمط الجيني المانح أو المتلقي) من خلال بناء نموذج انحدار لوجستي للآثار الرئيسية ومصطلحات التفاعل.

Figure 1
الشكل 1: إعداد الغدد الثديية المانحة. (أ)نظرة عامة على إجراءات استخراج أنسجة الغدة الثديية من الحيوانات المانحة واستعادة الأعضاء لزرعها. (ب)كامل محمولة الذاتية البطن الإنجة الغدد الثديية من الفئران 4 أسابيع من العمر (العمر النموذجي للمتبرعين زرع), بعد تلطيخ الشب كارمين. في 4 أسابيع من العمر ، كان ظهارة الثدي في طور التوسع ، ولكن شجرة القناة لا تخترق تماما وسادة الدهون ، كما يتضح من القرب من الغدد الليمفاوية المركزية. (C)يظهر اتساق الغدة الثديية المفرومة بعد التقطيع (الوردي) في طبق 60 ملم على الجليد ، مع كمية مناسبة من وسائط DMEM /F12 للحفاظ على رطوبة. توفر الصور المجاورة مقارنة بين ظهارة المفروم بعد نقل الطين إلى Collagenase Digestion Media وعندما يكتمل الهضم ، بعد 90-120 دقيقة. (د)الأورجادات الظهارية الحبيبات وفصل الطبقة مرئية بعد الطرد المركزي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحديد حدود جمع الأنسجة وحقن الخلايا الظهارية الثديية. (أ)يتم عرض مواقع الغدد الثديية الفئران لجمع الأنسجة. يتم تحديد الموقع التقريبي للغدد الثديية الذاتية الإنجة البطنية التي يتم حصادها من المتبرعين والمتلقين. (ب)بعد الحلاقة وإجراء شق سطحي ، تتعرض وسادة الدهون البينية البيضاء لمستلم الزرع. الصورة العليا: يظهر الأوعية الدموية الوسطى (السهم الأصفر) في وسط الشق. الصورة السفلية: يتم رفع الجلد على جانب واحد من الشق لإظهار عرض وسادة الدهون IS تحت الجلد، نسبة إلى الأوعية الدموية المتوسطة (السهم الأصفر). يتم حقن ظهارة المانحة تحت هذه رفرف في وسادة الدهون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط زرع متبادل. (أ)يتم عرض التصميم التجريبي النموذجي لزرع المعاملة بالمثل ، وذلك باستخدام الأنماط الجينية كمثال. يؤدي اختبار متغير تجريبي واحد، مثل خروج الجينات بالضربة القاضية (KO) بالنسبة إلى ظهارة المتبرع بالنمط البري (WT) إلى خلق 4 مجموعات متلقية للزراعة. (ب)مثال تصميم لفرد متلقي واحد يتلقى حقنين من مواد المتبرع. يمكن الوصول إلى مواقع متعددة للتطعيم عند استخدام وسادة الدهون البيضاء البينية بسبب وجود وعاء دموي على طول خط الوسط. يمكن حقن الاستعدادات منفصلة من نوع البرية وخروج المغلوب الظهارة المانحة (أو غيرها من ظروف الاختبار) إلى اليسار واليمين من الأوعية الدموية. (C)يتم عرض ممثل كامل تركيبأنسجة الوسادة الدهنية IS من مستلم زراعة في نفس الاتجاه كما هو الحال في المثال المعروض في(B). يظهر النمو الظهاري Mammary في موقعين لزرع الأعضاء على شريحة كاملة مع أنسجة ملطخة بالشب- كارمين. تم استئصال وسادة الدهون الانفية كقطعة واحدة بعد 6 أسابيع من الزرع. وقد تكون هناك حاجة إلى وقت إضافي للتنمية الظهارية، ولكنها قد تيسر أيضا فرط النمو وصعوبة التمييز بين الطعوم الفردية للمانحين. قد تكون القطع الأثرية البيولوجية الشائعة مرئية: MS = العضلات، TP = ظهارة مزروعة، BF = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل النتائج المستقلة وغير المستقلة للخلية الثديية. (أ)محاكاة النتائج التي يمكن ملاحظتها عندما تكون هناك مساهمات كبيرة من الآثار المستقلة وغير المستقلة على النمط الظاهري لظهارة المتبرع. في هذا المثال، يتم استخدام الغدد الذاتية البطن الإنجينية من المضيف كمقارنة. يمكن استخدام توافق النمط الظاهري للناتج الظهاري للمتبرعين ، مقارنة بالغدة الذاتية ، كمرجع ، ولكن لا ينبغي استخدامه لتحديد الآثار حصريًا. (ب)يظهر نمو الظهارة الثديية المانحة في موقع الزرع ، بجوار صور الغدة الذاتية لجميع المجموعات الأربعة في تجربة زرع متبادلة. الآثار غير المستقلة على ظهارة الثديية لوحظ بعد خروج المغلوب من جين واحد، Cdkn1b، مما يشير إلى البيئة الدقيقة للمضيف يؤثر على الغدة الثديية الفئران النامية18. أشرطة مقياس تمثل 5 ملم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخطوة المطلوبة العناصر على الجليد تم إذابتها/تم تسخينها مسبقًا العناصر بالقرب من الجراح
1. إعداد ظهارة الغدة الثديية طبق 60 ملم أدوات جراحية معقمة
Aliquot من DMEM/F12 70% إيثانول
2. استخراج الدماغ المانحة Aliquot من وسائل الإعلام في 15 أو 50 مل أنبوب (حوالي 1-2 مل / المانحة) توازن لوزن الدماغ، داخل حقل معقم
المسمى 15 مل أنبوب لكل متبرع، ومناسبة للتجانس احباط
ماصة ونصائح (1000 ميكرولتر، أو إلكترونية مع 5 مل ماصة مصلية)
متجانس ميكانيكي
3. الهضم الأنزيمي للغدد المانحة DMEM/F12 كافية للتعاميم وسائط هضم خالية من المصل مقياس المختبر (ز)
DNAse I خليط أحادي التشتت حاضنة / شاكر
حل التنشيط 50 مل أنبوب (المسمى) لكل متبرع
10 مل (أو أكبر) حقنة لتعقيم تصفية الكولاجين هضم وسائل الإعلام
مرشحات 20-40 ميكرومتر
Aliquot من وسائل الإعلام لتصفية قبل الرطب (s)
50 مل أنبوب (الأنابيب) لجمع حل إنزيم تصفية
مقص معقم لقطع نصائح pipet المتاح
كوب كبير لجمع supernatant، أو خط فراغ لaspirating
4- زراعة الأعضاء ظهارة المتبرع + خليط متجانس في الدماغ حقن هاملتون – 1 لكل نوع/ حالة من المتبرعين
Aliquot من DMEM/F12 إلى المحاقن رئيس نطاق
اللوازم الجراحية المعقمة (مشرط / مقص، ملقط متعددة)
مقاطع الجرح/ الغرز
الشاش
70% إيثانول أو إيزوبروبانول
بيتا تناول الطعام أو اليود
مسكن
دعم الحرارة للحيوانات المتلقية
مناشف ورقية أو مناديل مهمة حساسة

الجدول 1: البنود التي تتطلب دراسة مسبقة في كل خطوة. تم تصميم هذه القائمة لاستخدامها كمرجع عند إعداد تجربة ولا ينبغي اعتبارها شاملة. قد تكون الكواشف ضرورية فقط لتطبيقات محددة من البروتوكول، استناداً إلى إدراج/استبعاد الخطوات الاختيارية. في أي تجربة، يجب أن تكون هذه العناصر يمكن الوصول إليها دون تأخير بمجرد بدء الإجراء.

ملف تكميلي 1: خالية من المصل Collagenase الهضم إعداد وسائل الإعلام. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).

ملف تكميلي 2: إعداد خليط أحادي التشتت. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).

ملف تكميلي 3: إعداد حل التعطيل. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).

ملف تكميلي 4: إعداد وصمة عار الشب-كارمين. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول تقنية زرع الخلايا الظهارية الثديية المحسنة للعمل مع الفئران. يتم تطعيم الأعضاء الظهارية الثديية المعزولة من الفئران المانحة (3-5 أسابيع من العمر) في وسادة الدهون البيضاء البينية للفئران المتلقية (3-5 أسابيع من العمر أيضًا). يمكن تفسير النتائج أقل من 4-6 أسابيع في وقت لاحق, باستخدام المجهر الخفيف لفحص الأنسجة المطعمة; ومع ذلك ، يجب تحديد المقدار الأمثل من الوقت بين الزرع والتضحية قبل تنفيذ تجربة كاملة. وإذا مر وقت قليل جدا أو كثير جدا، فإن النتائج لن تكون قابلة للتفسير ولا ذات مغزى. لتحسين البروتوكول، وتحليل النمو في مجموعة صغيرة من الحيوانات 6-8 أسابيع بعد زرع. إذا كان الظهارة المزروعة موجودة، ولكن هازغ، زيادة طول الوقت. إذا كانت الطعوم متطورة بشكل جيد ولكن تتداخل ملامح الظهارة تتداخل مع التحليلات ، والنظر في الحد من عدد أسابيع لنتيجة الظهارية. إذا تعذر تقصير مقدار الوقت (على سبيل المثال، في تجارب التسرطن)، يُنصح بحقن نفس النوع من ظهارة المتبرع في كلا موقعي الزرع (واحد على كل جانب من الوعاء الدموي المتوسط)، حيث لا يمكن تفسير النتائج من الأفراد الجانبين مع اليقين 100٪. إذا كان أي نوع من التفاعل (الأوتوكرين، الباراكرين) يشتبه، ينصح بشدة لتشمل الحيوانات مراقبة إضافية حقنمع نفس النوع من ظهارة المانحة في كل من مواقع زرع. وتشمل الخطوات الحرجة في الإجراء القياس الكمي السليم للخلايا المانحة بعد الهضم الأنزيمي، والاختلاط الموحد مع تجانس الدماغ. يجب توخي المزيد من الحذر في هذه الخطوات لضمان اتساق عدد الخلايا المزروعة عبر الحيوانات المتلقية. أيضا، أثناء الحقن، تأكد من أن خليط الأنسجة المطعمة لا يتسرب من وسادة الدهون البينية. 3. استئصال وسادة الدهون الانفيسي عند نقطة نهاية التجربة. يمكن إزالة الوسادة بأكملها كقطعة واحدة ، ولكن يجب توخي الحذر إذا اخترت فصل الجانبين من وسادة الدهون الانفية ، والقطع فقط بعد تحديد الأوعية الدموية الميديا. يمكن أن يكون من الصعب تحديد الجانب الذي نشأ منه النمو ، خاصة عندما يكون أحد الكسب غير المشروع قد تجاوز الآخر ، مما يجعل الإزالة كقطعة واحدة أكثر مثالية.

تعديل شائع في الإجراء هو إضافة علاج مسرطن للفأر المتلقي25،29. يمكن للأنسجة المطعمة الاحتفاظ بقابلية التسرطن التي يمتلكها الجرذ المتبرع25، أو ، على العكس ، يمكن للأنسجة المانحة اعتماد قابلية المضيف30. لا يمكن تحديد هذه الآثار إلا عند استخدام وسادة الدهون البينية كموقع للزرع ، لأن الغدد الثديية الذاتية لا تزال سليمة وتعمل كرقابة داخلية إيجابية.

عند استخدام الأعضاء الغدة الثديية لزرع, عدم وجود نمو الظهارية قد يكون بسبب مشاكل مع إعداد الخلايا المانحة أو إجراء الحقن. يمكن أن يحدث رفض الكسب غير المشروع أيضًا عندما لا يكون المستلم وسلالة المتبرع مُحَمَّمًا ، مما يسبب استجابة مناعية في المضيف. في مثل هذه الحالات ، يتعرف الجهاز المناعي المتلقي على الأنسجة المانحة على أنها غير ذاتية ، ويبدأ استجابة مناعية ، وتفشل الأنسجة المطعمة في النمو. للحد من خطر فشل الكسب غير المشروع عندما يكون المتبرع والمتلقي على خلفيات وراثية مختلفة ، ما لا يقل عن 6 ، ومن الناحية المثالية ، يوصى بأكثر من 10 أجيال من المعابر الخلفية لمنع التحديات التي يمكن أن تؤثر على تفسير النتائج. في 6 أجيال عبر الظهر ، فإن معظم الطعوم تنمو ، ولكن أقلية قد لا تزال تفشل. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها إعداد الخلايا المانحة كسبب لفشل الكسب غير المشروع، والنظر في ما إذا كان الهضم الأنزيمي قاسية جدا، تم الاحتفاظ الخلايا في درجات الحرارة عالية جدا أو منخفضة جدا، ومصادر التلوث، والتحسين من أرقام الخلايا المانحة المستخدمة للمسح ، أو انحرافات البروتوكول الأخرى التي تؤثر على استمرارية الخلية ونموها.

وقد تبين أن الخلايا الجذعية الثديية واحدة في الماوس لتكون قادرة على إعادة تشكيل الغدة الثديية وظيفية، مما يدل على أن إضافة الدعم الهرموني ليست ضرورية للنتيجة الأولية. إضافة تجانس الدماغ يحسن بشكل كبير من نتيجة زرع من خلال العمل كمصفوفة هيكلية للخلايا المانحة والحد من خطر هجرة زرع رفض3،34،35،36. عند دمجها مع تجانس الدماغ ، يتم تقليل الحد الأدنى من الخلايا الظهارية الثديية اللازمة للزرع أكثر من 10 أضعاف ، مقارنة بالبدائل3. الأهم من ذلك، لم يثبت أن خليط من تجانس الدماغ المتجانس يؤثر على النمط الظاهري للظهارة المزروعة، وقد أسفر عن نتائج متسقة في دراسات التسرطن الثديي والحساسية لأكثر من 40 عامًا.

قد يجادل البعض بأن وسادة الدهون البينية لا تمثل وسادة الدهون الثديية الذاتية بسبب الفروق التشريحية: قرب وسادة الدهون IS من الأنسجة الدهنية البنية ، والاختلافات المحتملة في كثافة الأوعية الدموية مما يؤدي إلى اختلافات في التعرض للهرمونات أو وجود الغدد الليمفاوية البارزة في وسادة الدهون البلعة والبطن ، والتي قد تعرض الظهارة لمستويات مختلفة من الخلايا. على الرغم من أن هذا لم يتم اختبارها على وجه التحديد في الفئران، كل من هذه المستودعات تحت الجلد وتطوير قبل الدهنية الحشوية37،38. في الدهنية البشرية ، توجد اختلافات جزيئية أكبر عبر المناطق الدهنية ، وعدم التجانس داخل المجموعات غير مفهومة تمامًا38،39. وثمة عامل إضافي للنظر هو أن الأبيض الانساب الانساب والدهون الثديية حصة Myf5+ mesenchymal النسب السلائف، ولكن تختلف في عدد الخلايا المستمدة من أن السكان40. على الرغم من ذلك، هناك أدلة كافية تشير إلى أن وسادة الدهون البينية البيضاء توفر بيئة صغيرة مماثلة لتلك الموجودة في الغدة الثديية السفلية. ظهارة ماممريم ة مع mesenchyme الخاصة بها تطور نمط مامري نموذجي20، وهو تأثير جيد الوثيقة في دراسات القوارض ويدعم الملاحظات في الأنسجة الدهنية البشرية19،20،24،41،42. قبل كل شيء ، فإن المحددات الرئيسية لنجاح زرع الظهارية الثديية في كل من الفئران والجرذان هي حجم وسلامة وسادة الدهون43،44. في استخدام هذه التقنية ، أثبتت العديد من دراسات الحساسية لسرطان الثدي أن الأنسجة الثديية الوظيفية يمكن توليدها بشكل فعال وروتيني عند زرعها في وسادة الدهون البينية البيضاء18،30،45.

بسبب التوافق العالي ، فإن النمو الظهاري قابل للعوامل المستقلة للخلايا الثديية وغير المستقلة ، وسوف يستجيب للتلاعب الهرموني للفئران المتلقية ، على سبيل المثال ، لتعزيز التمايز أو الإفراز الوظيفي للحليب. غالبًا ما يستخدم زرع الأعضاء لدراسة العوامل التي تؤثر على تطور الغدة الثديية و / أو التسرطن. يمكن هضم الأرغن إلى تعليق خلية واحدة لتسهيل التفسير الكمي للنتائج. في حين أن الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يمكن تكييفها لأجزاء سليمة من الكسب غير المشروع من أنسجة الغدة الثديية (كما هو شائع في الفئران) ، فإن خطوات الانفصام الأنزيمية تسمح بإجراء استنتاجات أكثر تفصيلاً. منذ preclearing الذاتية وسادة الدهون الثديية في الفئران ليست مجدية ، وهذا هو حاليا الطريقة الوحيدة التي تسمح لتطعيم ظهارة الثديية الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مركز هولينغس للسرطان مركز دعم السرطان منحة P30 CA138313 البحوث التجريبية التمويل من المعاهد الوطنية للصحة(https://www.nih.gov/)،والأموال من قسم علم الأمراض والطب المختبري في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية. ونود أن نشكر ماريجين سميث على تسجيل هاوية المقابلة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette - - transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use - - follow institutional protocol
Beta-dine or iodine - -
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus - -
Clean animal cages for recovery - - follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water - - for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA - - monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone - inactivation solution
Gauze - -
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO - monodispersion mixture
Heating pads - - follow institutional protocol
Ice buckets (x2) - -
Incubator with orbital rotation - - must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia - - follow institutional protocol
Light microscope or digital camera - - visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific - TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer - - follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes - -
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic - - Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver - - electric clippers, or other
Staining jars - - minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) - - autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) - - for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) - -
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
  2. Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
  3. Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
  4. Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
  5. Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
  6. Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
  7. Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
  12. Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
  13. Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
  14. Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
  15. Beuving, L. J., Faulkin, L. J. Jr, DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
  16. Russo, J., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. Rubin, E., Damjanov, I. , Humana Press. Totowa, NJ. 217-251 (1990).
  17. Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
  18. Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
  19. Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
  20. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
  21. Faulkin, L. J. Jr, Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
  22. Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
  23. Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
  24. Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
  25. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
  26. Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
  27. Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
  28. Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
  29. Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
  30. Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
  31. Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
  32. Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
  33. Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
  34. Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
  35. Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
  36. Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
  37. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  38. Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
  39. Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
  40. Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
  41. Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
  42. Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
  43. Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
  44. Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
  45. Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 157، الغدة الثديية الفئران، زرع الظهارية، الخلايا أحادية التشتت، القياس الكمي، تطور الغدة الثديية، سرطان الثدي، سرطان، الكسب غير المشروع
الجرذ ماماري زرع الخلايا الظهارية في وسادة الدهون البيضاء Interscapular
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D.,… More

Shunkwiler, L. B., Haag, J. D., Gould, M. N., Smits, B. M. G. Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad. J. Vis. Exp. (157), e60401, doi:10.3791/60401 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter