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Medicine

चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर कार्डियक फंक्शन का विट्रो मूल्यांकन

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/60427
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, 2Department of Physiology, Kilimanjaro Christian Medical University College
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके कार्डियक फ़ंक्शन के निष्कर्षण और मूल्यांकन की तकनीक का कदम-दर-कदम वर्णन करना है। यह पद्धति छोटे जमे हुए बायोप्सी का उपयोग करके माओफ्लामेंट फ़ंक्शन के माप और तीव्र मॉड्यूलेशन की अनुमति देती है जिसे चूहों से पुरुषों तक विभिन्न हृदय स्थानों से एकत्र किया जा सकता है।

Abstract

इस लेख में, हम एक ही परिग्रह ("चमड़ी") कार्डियोमायोसाइट को अलग करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करते हैं और इसे कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए एक बल-मापने वाले उपकरण और एक मोटर से जोड़ते हैं। इन अध्ययनों से कार्डियोमायोसाइट कठोरता (निष्क्रिय बल) और विभिन्न कैल्शियम (सीए2 +)के साथ इसकी सक्रियता की अनुमति मिलेगी- जिसमें अन्य लोगों के बीच निर्धारित करने के लिए समाधान शामिल हैं: अधिकतम बल विकास, माइलोफिलमेंट सीए2 +-संवेदनशीलता (पीसीए50),सहयोगशीलता (एनहिल) और बल पुनर्विकास की दर (केटीआर)। यह विधि कार्डियोमायोसाइट्स के सक्रिय और निष्क्रिय दोनों गुणों पर सीधे माइसोफिलामेंट्स और एक्सोजेनस रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर काम करने वाली दवाओं के प्रभावों के निर्धारण को भी सक्षम बनाती है। चिकित्सकीय रूप से, चमड़ी कार्डियोमायोसाइट अध्ययन कई मायोकार्डियल रोगों के रोगविज्ञान को उजागर करते हैं और माइफिलामेंट्स को लक्षित करने वाले चिकित्सीय हस्तक्षेपों के प्रभाव के इन विट्रो मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। कुल मिलाकर, यह तकनीक ओपन हार्ट या ट्रांसप्लांट सर्जरी के दौरान प्राप्त पशु मॉडल और मानव ऊतक में इन विट्रो और वीवो मापदंडों के बीच सहसंबंधों की जांच करके हृदय रोग विज्ञान के स्पष्टीकरण को सक्षम बनाती है।

Introduction

परंपरागत रूप से, मायोकार्डियल यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन ज्यादातर बहुकोशिकीय तैयारी में किया गया है, जैसे कि पेपिलरी मांसपेशियों और ट्राबेकुला1,2। बहुकोशिकीय हृदय की मांसपेशियों स्ट्रिप्स में कोशिकाओं की विषम आबादी शामिल है, जिसमें अभिविन्यास और बल उत्पादन, विद्युत गतिविधि और तनाव/तनाव वितरण के अज्ञात पैटर्न के साथ अनुबंध कार्डियोमायोसाइट्स के साथ-साथ आसपास के कनेक्टिव ऊतक मैट्रिक्स3,4शामिल हैं। कोलेजन के बिना तैयारी और एक ही कार्डियोमायोसाइट युक्त एक बहुत ही सटीक और नियंत्रित तरीके से सारकोमेरे लंबाई और क्रॉस-ब्रिज संकुचन गुणों की माप की अनुमति देगा5,6। इसलिए, पिछले चार दशकों में, कई पद्धतियों को विकसित किया गया था जिससे एक कार्डियोमायोसाइट6,7के यांत्रिक, संकुचन और विश्राम गुणों की जांच की अनुमति मिली। इन कोशिकाओं का अनुबंध कार्य सारकोमेरे लंबाई और क्रॉस-ब्रिज साइकिलिंग काइनेटिक्स3पर दृढ़ता से निर्भर करता है। इस प्रकार, एकल अलग हृदय कोशिकाओं में सीधे मांसपेशियों के कार्य की जांच करना वांछनीय है, यह देखते हुए कि यह सारकोमेरे लंबाई और प्रदर्शन के साथ-साथ क्रॉस-ब्रिज फ़ंक्शन और संकुचन गुणों का आकलन करने की अनुमति देता है। हालांकि , μN स्तर पर बल माप रिकॉर्ड करते समय एक उचित ऑप्टिकल सारकोमेरे संकल्प के साथ कार्यात्मक कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना और संलग्न करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है और3,6विकसित हो रहा है। अन्य चुनौतियां वे लॉजिस्टिक्स हैं जिन्हें कार्डियोमायोसाइट्स को हौसले से एकत्र बायोप्सी से अलग करने के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, मानव बायोप्सी संग्रह की अनिश्चितता प्रयोगों की व्यवहार्यता को ख़तरे में डालना हो सकता है।

इसके अलावा, वैज्ञानिक प्रक्रियाओं (3Rs के सिद्धांतों) के लिए पशु प्रयोग के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के बारे में नैतिक चिंताओं ने सेलुलर और ऊतक स्तर पर अध्ययन परिवर्तनों को बढ़ावा दिया है, अधिमानतः मानव बायोप्सी में, या छोटे पशु नमूनों में । वास्तव में जटिलता के छोटे स्तर पर विट्रो में हृदय कार्य का आकलन करने के लिए पद्धतियों का एक प्रगतिशील शोधन पूरे शरीर में परिणामों के उचित एकीकरण की अनुमति देता है और उन्हें नैदानिक परिदृश्य में अनुवाद करता है7. कुल मिलाकर, कार्डियोमायोसाइट्स निकालने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों का उपयोग करना एक आकर्षक विकल्प हो सकता है।

मायोकार्डियल ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है और मोर्टार और मूसल के साथ समरूप किया जाता है। इस समरूपता का परिणाम चमड़ी बंडल और अलग कोशिकाओं का निलंबन है जिसमें सर्कोलेमल क्षति की अलग-अलग डिग्री होती है, जिसमें मायोप्लाज्म स्नान माध्यम के संपर्क में आता है और सभी सेलुलर घटकों को धोया जाता है। सारकोलेम्मा से आगे दूर होने वाले माइफिब्रिल्स जैसी संरचनाएं संरक्षित हैं। इस प्रकार, मायोफिब्रिलर उपकरण से जुड़े सारकोमेरे छोटा और कार्यात्मक गुणों को अक्षुण्ण रखा जाता है और इसे8,9दर्ज किया जा सकता है।

कार्डियोमायोसाइट फोर्स मेजरमेंट सिस्टम में एक इलेक्ट्रोमैग्नेटिक मोटर होता है, जिसका इस्तेमाल कार्डियोमायोसाइट लंबाई और फोर्स ट्रांसड्यूसर को समायोजित करने के लिए किया जाता है, जो आइसोमेट्रिक कार्डियोमायोसाइट संकुचन को मापता है। एक परमीलित, या चमड़ी, कार्डियोमायोसाइट को एक प्रायोगिक कक्ष में रखा जाता है जिसमें आराम समाधान ([सीए2 +] और लेफ्टिनेंट; 10 एनएम) और सिलिकॉन-2 पतली सुइयों से चिपके हुए हैं: एक मोटर से जुड़ा हुआ है और दूसरा बल ट्रांसड्यूसर से। कार्डियोमायोसाइट आकृति विज्ञान और सारकोमेरे लंबाई निर्धारित करने के लिए एक ऑप्टिकल सिस्टम का उपयोग किया जाता है। प्रायोगिक प्रोटोकॉल में अक्सर विभिन्न सीए2 + सांद्रता वाले बफर समाधानों पर बल रिकॉर्डिंग की एक श्रृंखला होती है, जो ऐक्टिन-मायोसिन क्रॉस-ब्रिज काइनेटिक्स का निर्धारण और पूर्व-परिभाषित सारकोमेरे लंबाई(चित्र 1)पर घुड़सवार कार्डियोमायोसाइट्स के निष्क्रिय तनाव का मापन होता है। तरल नाइट्रोजन में जमे हुए मायोकार्डियल नमूनों से परमीवल कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव (और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) एक तकनीक है जो अधिकतम सीए2 +-सक्रिय (सक्रिय) बल प्रति क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र (टी-एक्टिव, केएन∙एम-2), सीए2 कोमापने के लिए सेलुलरयांत्रिकीऔर प्रोटीन बायोकेमिस्ट्री का उपयोग करती है। + स्वतंत्र (निष्क्रिय) तनाव (टीनिष्क्रिय,kn∙m-2), myofilaments Ca2 +-संवेदनशीलता (पीसीए50),myofilaments सहयोगशीलता (nHill), बल पुनर्विकास की दर (ktr) के साथ ही टीसक्रिय,टीनिष्क्रिय,पीसीए50,एनहिल और केटीआर की लंबी निर्भरता।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विभिन्न प्रजातियों से जमे हुए नमूनों से अलग एकल चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स के कार्यात्मक यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया के रूप में कार्डियोमायोसाइट फोर्स मेजरमेंट सिस्टम की क्षमता को स्पष्ट और संक्षेप में प्रस्तुत करना है।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के साथ पालन (NIH प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित २०११) और पशु कल्याण पर पुर्तगाली कानून (डीएल 129/92, डीएल 197/96; पी 1131/97) । सक्षम स्थानीय अधिकारियों ने इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल (018833) को मंजूरी दी।

1. स्टॉक समाधान तैयारी(तालिका 1)

  1. टेबल 2 में निर्देशों का पालन करके कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव (रिलैक्स-आईएसओ) के लिए 1,000मिलियन एमएल आराम समाधान तैयार करें। ≈500 एमएल में ऊपर अभिकर् ता को भंग करें और पीएच को कोह के साथ 7.0 में समायोजित करें। अंतिम वॉल्यूम को 1000 एमएल में एडजस्ट करें।
    1. 50 एमएल ट्यूब में रिलैक्स-आईएसओ वितरित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. तालिका 3में निर्देशों का पालन करके 250 एमएल सक्रिय समाधान तैयार करें। ऊपर के अभिकर् यों को अति-शुद्ध पानी के ≈100 एमएल में भंग करें। पीएच को 15 डिग्री सेल्सियस पर 5 एम कोह के साथ 7.1 पर समायोजित करें।
    नोट: आमतौर पर, वांछित पीएच तक पहुंचने के लिए कोह की एक महत्वपूर्ण राशि जोड़ना आवश्यक है। 15 डिग्री सेल्सियस के समाधान को ठंडा करने के लिए बर्फ के साथ एक बॉक्स में वॉल्यूमेट्रिक गुब्बारे रखो।
    1. अंतिम वॉल्यूम को 250 एमएल में एडजस्ट करें। इस समाधान को आराम के समाधान के साथ मिश्रण करने के क्षण तक एक चुंबकीय उभारने के साथ लगातार उत्तेजित करें।
  3. तालिका 4 में निर्देशों का पालन करके आराम समाधान के 100एमएल तैयार करें। ऊपर के अभिकर्णों को अति-शुद्ध पानी ≈50 एमएल में भंग करें। पीएच को 15 डिग्री सेल्सियस पर कोह 5 मीटर के साथ 7.1 पर समायोजित करें।
    नोट: आमतौर पर, 7.1 के पीएच तक पहुंचने के लिए कोह की एक महत्वपूर्ण राशि जोड़ना आवश्यक है। 15 डिग्री सेल्सियस के समाधान को ठंडा करने के लिए बर्फ से भरे बॉक्स में वॉल्यूमेट्रिक गुब्बारे रखें। माप के दौरान उपयोग किए जाने वाले समाधानों की आयनिक ताकत 180 mM की राशि थी।
    1. अंतिम वॉल्यूम को 100 एमएल में समायोजित करें। इस समाधान को सक्रिय समाधान के साथ मिश्रण करने के क्षण तक एक चुंबकीय उभारने के साथ लगातार उत्तेजित करें।
  4. 5.0 और 6.0 के बीच पीसीए समाधान प्राप्त करने के लिए तालिका 5 में प्रस्तुत अनुपात में सक्रिय और आराम समाधान मिलाएं।
    1. दोनों को मिलाते समय हमेशा आराम और सक्रिय समाधान आंदोलनकारी रखें।
    2. 2 एमएल माइक्रोट्यूब के लिए प्रत्येक मिश्रण Aliquot। सभी माइक्रोट्यूब को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए पीसीए समाधान (4.5 से 6.0) का एक अलग बैच तैयार करें।

2. बल ट्रांसड्यूसर का अंशांकन

नोट: बल ट्रांसड्यूसर का अंशांकन एक नियमित प्रक्रिया है जिसे हर दो महीने या जब भी इसे बिना कैलिब्रेटेड होने की आशंका हो तो किया जाना चाहिए। बल ट्रांसड्यूसर अत्यधिक संवेदनशील है और आसानी से टूट जाता है। इसे धीरे-धीरे इसके उपयोग के हर चरण में संभाला जाना चाहिए, जिसमें अंशांकन, कार्डियोमायोसाइट की ग्लूइंग और सफाई शामिल है।

  1. बाकी उपकरणों से बल ट्रांसड्यूसर को अलग करें।
  2. क्लैंप की मदद से, बल ट्रांसड्यूसर को क्षैतिज रूप से इस तरह से रखें कि सुई उसी अभिविन्यास में नीचे की ओर इशारा करती है कि कार्डियोमायोसाइट बल विकसित करेगा। यह ज्ञात वजन (लोचदार बैंड, सीवन या पिन) के साथ जनता की एक श्रृंखला को लटकाने की सुविधा प्रदान करेगा।
    नोट: पैमाने कारक [मिलीग्राम/वोल्ट] की जांच करने और ट्रांसड्यूसर पर अत्यधिक वजन से बचने के लिए इस कदम पर आगे बढ़ने से पहले बल ट्रांसड्यूसर की विशेषताओं की जांच करें। बल ट्रांसड्यूसर मॉडल के लिए, स्केल फैक्टर 50 (50 मिलीग्राम 1 वोल्ट के अनुरूप) है और हम 12.5 और 250 मिलीग्राम के बीच 5 वजन का उपयोग करते हैं।
  3. बल ट्रांसड्यूसर चालू करें और इसे 30 मिनट तक गर्म होने दें।
  4. फोर्स ट्रांसड्यूसर पर हल्का द्रव्यमान लटकाकर और फोर्स आउट में मापा गया इसी वोल्टेज दर्ज करके शुरू करें।
    1. इस प्रक्रिया को पांच वजन तक दोहराएं।
  5. प्लॉट फोर्स फोर्स ट्रांसड्यूसर (लोड) बनाम वोल्टेज पर लागू होता है और रैखिकता की जांच करता है।
  6. यदि कोई रैखिकता नहीं है, तो शून्य को समायोजित करें और ट्रांसड्यूसर के सर्किट बोर्ड में शक्तिशाली हासिल करें। अधिक जानकारी के लिए इसके विशिष्ट निर्देश की जांच करें।
    1. आउटपुट वोल्टेज 0.0 वी पढ़ता है जब तक शून्य शक्तिशाली चालू करें।
    2. ट्रांसड्यूसर सुई पर एक मध्यम वजन हाथ और इसी वोल्टेज को पढ़ने के लिए लाभ शक्तिशाली को समायोजित करें (उदाहरण के लिए, 50 मिलीग्राम 1 वी के अनुरूप है)। वजन निकालें और शून्य शक्तिशाली को 0.0 में फिर से समायोजित करें।
    3. वजन के साथ और बिना उत्पादन सही होने तक चरण 2.6.2 दोहराएं।
  7. बल को वापस उपकरण में स्थानांतरित करें।

3. प्रायोगिक तंत्र की स्थापना

  1. सक्रिय करने में से प्रत्येक की एक शीशी गल, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 और आराम समाधान और उन्हें बर्फ पर बनाए रखने।
    नोट: एटीपी और पीसीआर लैबिल यौगिक हैं जिन्हें ठंडे तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए।
  2. माइक्रोस्कोप, परीक्षण उपकरण और उपयोग के लिए संबद्ध कंप्यूटर तैयार करें(चित्रा 1)।
  3. तापमान को समायोजित करें ताकि इन-चैंबर थर्मामीटर 15 डिग्री सेल्सियस पढ़ता हो। किनेज़ और फॉस्फेटे इन्क्यूबेशन (20 डिग्री सेल्सियस) को छोड़कर इस तापमान पर सभी प्रयोग करें।
  4. फोर्स-ट्रांसड्यूसर और मोटर चालू करें।

4. चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का निष्कर्षण और पार

  1. रिलैक्स-आईएसओ सॉल्यूशन का 50 एमएल डिफ्रॉस्ट।
  2. सेंट्रलाइज चालू करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  3. एक पेट्री डिश में एक मायोकार्डियल नमूने के 3-5 माइक्रोन गल जिसमें रिलैक्स-आईएसओ समाधान का 2.5 एमएल होता है।
  4. एक स्केलपेल ब्लेड(चित्रा 2)के साथ छोटे टुकड़ों में ऊतक काटें। अनावश्यक कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए सटीक तरीके से नमूना काटें।
  5. एक कट पिपेट टिप का उपयोग करके एक पॉटर-एल्वेजेम ग्लास में ऊतक के साथ रिलैक्स-आईएसओ समाधान के 2.5 एमएल स्थानांतरित करें।
  6. यांत्रिक रूप से 30-40 आरपीएम की रोटेशन गति से एक ग्राइंडर के साथ ऊतक को बाधित करें। एक अच्छा सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊतक को 2 एस प्रत्येक के लिए 3 बार दबाएं।
  7. 15 एमएल ट्यूब में रिलैक्स-आईएसओ सॉल्यूशन (रिलैक्स-आईएसओ के 2.25 एमएल के साथ ट्राइटन के 250 माइक्रोन) में 10% ट्राइटन तैयार करें और इस समाधान को सेल सस्पेंशन में जोड़ें।
  8. धीरे-धीरे ट्यूब को 3 बार उलटा करके मिलाएं।
  9. 1 मिनट और बर्फ पर 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट ।
  10. 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर रिलैक्स-आईएसओ जोड़कर ट्राइटन को धोएं; धीरे मिश्रण (ट्यूब 3 बार उलटा) और अंत में एक कोण अपकेंद्रित्र (348 x ग्रामपर 1 मिनट) में कोशिकाओं को नीचे कताई। सेल पैलेट के ऊपर 3 एमएल तक सुपरनेट निकालें।
    नोट: सेल गोली परेशान करने से बचने के लिए धीरे से अधिनाट निकालें। फिर भी, सुपरनैंट में कुछ कोशिकाएं अनिवार्य रूप से खो जाएंगी।
  11. कम से कम 4 बार या ट्राइटन अवशेषों द्वारा उत्पादित कोई और बुलबुले नहीं देखे जाने तक चरण 4.10 दोहराएं।
    नोट: अधिक धोने के कदम किए जाते हैं, और अधिक कोशिकाओं को छोड़ दिया supernatant के साथ खो रहे हैं ।
  12. आखिरी वॉश-आउट में, सुपरनेट को सेल सस्पेंशन के 5-10 एमएल की मात्रा तक हटा दें।

5. चमड़ी कार्डियोमायोसाइट का चयन और चिपकाना

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड धारक(चित्रा 1)में एक ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर एक कवरस्लिप पर एक सेल निलंबन ड्रॉप रखो ।
  2. एक अच्छे स्ट्रिटेशन पैटर्न और आकार(चित्रा 2)के साथ एक छड़ी के आकार का कार्डियोमायोसाइट चुनें।
  3. उल्टे माइक्रोस्कोप के सबसे कम आवर्धन का उपयोग कर बल-ट्रांसड्यूसर और मोटर की सुई युक्तियां खोजें।
  4. चयनित कार्डियोमायोसाइट को क्षैतिज रूप से स्थान देने के लिए कवरस्लिप को घुमाएं ताकि इसके सिरों को फोर्स ट्रांसड्यूसर और मोटर(चित्रा 2)की सुई के साथ गठबंधन किया जा सके।
  5. एक झाड़ू टिप(चित्रा 2)की मदद से कवरस्लिप के किनारे गोंद की एक पतली रेखा रखें।
  6. दोनों युक्तियों के चारों ओर एक गोंद प्रभामंडल बनाने के लिए गोंद लाइन में बल ट्रांसड्यूसर और मोटर की सुई युक्तियों विसर्जित कर दिया।
    नोट: मोटरचालित माइक्रोपोजिशनर्स के सावधानीपूर्वक उपयोग के माध्यम से चरण 5.6 - 5.10 पूरा किए जाते हैं।
  7. कार्डियोमायोसाइट के फोकल प्लेन के करीब सुई युक्तियों को जल्दी से ले जाएं।
  8. बल ट्रांसड्यूसर की सुई टिप को नीचे ले जाएं ताकि यह कार्डियोमायोसाइट के एक किनारे पर चिपक जाए।
  9. मोटर की नोक और सेल के अन्य चरम के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: इस प्रक्रिया को 2-3 मिनट से कम लेना चाहिए क्योंकि गोंद बहुत तेजी से इलाज करना शुरू कर देता है।
  10. 5-8 मिनट के बाद, कोशिका को कवर्लिप में चिपकाने से बचने के लिए सुइयों को ≈15 माइक्रोन उठाएं। यह दोनों माइक्रोमैनीपुलेटर्स को एक साथ ऊपर ले जाकर किया जाता है।
  11. गोंद का इलाज करते हैं। गोंद के प्रकार के आधार पर यह प्रक्रिया 15 से 45 मिनट तक चल सकती है। हमारे मामले में, कार्डियोमायोसाइट पर्याप्त रूप से ≈15 मिनट के बाद चिपका हुआ है।

6. सक्रिय, निष्क्रिय और Ca2 + संवेदनशीलता के बल माप रिकॉर्डिंग

  1. पहले प्रायोगिक को आराम के समाधान (प्रायोगिक तंत्र में 55-100 माइक्रोन) और दूसरा प्रयोगात्मक समाधान को सक्रिय करने के साथ अच्छी तरह से भरें।
  2. कैमरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को कार्डियोमायोसाइट के क्षेत्र में स्ट्राइशन के स्पष्ट पैटर्न के साथ रखें।
    नोट: कार्डियक मायोसाइट्स के लिए, ऑपरेटिंग सारकोमेरे लंबाई 1.8 और 2.2 माइक्रोन के बीच भिन्न होती है, और इष्टतम सारकोमेरे लंबाई लगभग 2.15 माइक्रोन होती है।
  3. इष्टतम सारकोमेरे लंबाई (2.2माइक्रोन) सेट किए जाने के बाद कार्डियोमायोसाइट (मोटर से ट्रांसड्यूसर गोंद हेलो, चित्रा 3) के दो चरम सीमाओं के बीच की दूरी को मापें। सॉफ्टवेयर में मायोसाइट लंबाई के रूप में मूल्य रिकॉर्ड करें।
  4. कार्डियोमायोसाइट चौड़ाई और गहराई को मापें, एक चश्मे दर्पण की सहायता से बाद में कोशिका के लंबवत रखा जाता है।
    नोट: चश्मे के माध्यम से सेल की कल्पना करने के लिए एक शक्तिशाली, बाहरी प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होगी। यदि कोई चश्मे नहीं है, और यह मानते हुए कि हृदय कोशिकाओं में एक अंडाकार आकार होता है, कार्डियोमायोसाइट गहराई को कार्डियोमायोसाइट चौड़ाई के 70% के रूप में अनुमानित किया जा सकता है।
  5. कार्डियोमायोसाइट के अण्डाकार आकार को मानते हुए क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र (सीएसए, एमएम2)की गणना करें।
    Equation 1
  6. धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करें ताकि कोशिका कवरस्लिप से अच्छी तरह से चरण के पीछे आराम समाधान तक ले जाए।
    नोट: यह प्रक्रिया आसानी से सेल को नुकसान पहुंचा सकती है। कोशिका को स्थानांतरित करने से पहले, धीरे-धीरे सुइयों को थोड़ा और ऊपर ले जाएं। कोशिका को समाधान से बाहर निकालने से बचें।
  7. सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल का चयन करें जिसमें दो सेल छोटा (इसकी प्रारंभिक लंबाई का 80%) शामिल है, जो तब होगा जब सेल सीए2 + समाधान में और आराम समाधान में उभरा है, क्रमशः(चित्रा 1,अनुपूरक फ़ाइल)।
    नोट: सेल का पहला "सुस्त" समाधान को सक्रिय करने के भीतर और दूसरा "सुस्त" आराम समाधान के भीतर किया जाएगा। ऐसा करने से यूजर सेल के टोटल फोर्स (एफटोटल) की गणना 1 से और 2 से सेल के पैसिव फोर्स (एफपैसिव)से करसकेंगे। सक्रिय बल की गणना करने के लिए सूत्र का उपयोग करें, एफसक्रिय = एफकुल - एफनिष्क्रिय। सभी क्रॉस-ब्रिज रिकॉर्ड बल को अलग करने के लिए सेल को 80% छोटा किया जाता है।
  8. माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करके आइसोमेट्रिक संकुचन को प्रकाश में लाना ताकि कार्डियोमायोसाइट आराम से सक्रिय समाधान (पीसीए = 4.5 (1)) तक ले जाए।
    नोट: यदि सेल कार्यात्मक है, तो यह तुरंत अनुबंध करेगा।
  9. बल पठार तक पहुंचने पर, बल डेटा रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
    नोट: परीक्षण व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है । सॉफ्टवेयर के आधार पर परीक्षणों का एक अनुक्रम बनाने की संभावना है जो सीए2 + -संवेदनशीलता प्रोटोकॉल(चित्रा 1,अनुपूरक फ़ाइल)के भीतर विभिन्न सीए2 +समाधानों के अनुरूप होगा।
  10. ~ 10 एस रुको और फिर समाधान को सक्रिय करने में डूबे सेल स्विच करें।
    नोट: आराम समाधान में सेल को विसर्जित करने से पहले 10 एस इंतजार करना महत्वपूर्ण है। यदि सेल बहुत जल्दी ले जाया जाता है, तो सेल (केटीआर मूल्य) के पुनर्विकास बल की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण डेटा खो सकता है।
  11. जल्दी से मंच ले जाएं ताकि कार्डियोमायोसाइट आराम के समाधान में विसर्जित हो जाए।
  12. परीक्षण बंद होने तक प्रतीक्षा करें।
  13. चरण 6.8 - 6.12 दोहराएं ताकि सेल को सक्रिय समाधान (पीसीए = 4.5 (2)) में दो बार सक्रिय किया जा सके।
    नोट: आमतौर पर, पहली सक्रियण के बाद, कार्डियोमायोसाइट समाप्त होता है सुई युक्तियों से थोड़ा अलग कर सकते हैं, कार्डियोमायोसाइट लंबाई, सीएसए और/ वांछित सारकोमेरे लंबाई को पुनः समायोजित करें और सॉफ्टवेयर में सही आयामों को पेश करें।
    1. सीए2 + संवेदनशीलता प्रोटोकॉल के लिए 6.13.2 कदम जारी रखें या डेटा को बचाएं, यदि सेल के निष्क्रिय और सक्रिय बल के मूल्य केवल पैरामीटर हैं और कोशिका को सुइयों से अलग करते हैं और गोंद को हटाने के लिए एसीटोन से साफ करते हैं।
    2. यदि आवश्यक हो तो इसे फिर से थोड़ा खींचकर कोशिका की सारकोमर लंबाई को 2.2 माइक्रोन में समायोजित करें।
    3. अगले सीए2+ समाधान (55-100 μL यहां) द्वारा सक्रिय समाधान को बदलें। चरण 6.8 - 6.12 दोहराएं।
    4. अगले सीए2 + समाधान (55-100 μL यहां) द्वारा सक्रिय समाधान को बदलें और सभी समाधानों का परीक्षण किए जाने तक चरण 6.8 - 6.12 दोहराएं (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0)।
    5. अंत में, सक्रिय समाधान (पीसीए 4.5 (3)) के साथ सेल को फिर से सक्रिय करें। कदम दोहराएं 6.8- 6.12।

7. इनक्यूबेशन के साथ कानेस और फॉस्फेट्स

  1. चयनित बेसलाइन प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के बाद, अनुशंसित एकाग्रता पर आराम समाधान में काइनेज/फॉस्फेट को पतला करें।
    नोट: प्रयोग से पहले खुराक-प्रतिक्रिया वक्र करने की सिफारिश की जाती है।
  2. प्रायोगिक कुओं का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  3. प्रयोगात्मक कुओं को काइनेज/फॉस्फेट, आराम समाधान और सक्रिय समाधान (55-100 माइक्रोन) के साथ भरें।
  4. धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करें ताकि कोशिका कुएं में डूब जाए जिसमें काइनेज/फॉस्फेटेस हो।
  5. कम से कम 30 मिनट के लिए या निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार किनेस/फॉस्फेटे के साथ कार्डियोमायोसाइट को इनक्यूबेट करें।
  6. चयनित बेसलाइन प्रोटोकॉल दोहराएं।

8. प्रयोग को अंतिम रूप देना

  1. सेल को स्ट्रेच करके फोर्स ट्रांसड्यूसर और मोटर के टिप्स से कार्डियोमायोसाइट को अनग्लू करें।
  2. एसीटोन में भिगोए गए सूती झाड़ू का उपयोग करके सुई युक्तियों से गोंद प्रभामंडल को सावधानी से हटा दें।
  3. उपकरण बंद कर दिए।

9. आंकड़ों का विश्लेषण

  1. प्रत्येक कार्डियोमायोसाइट परीक्षण से सभी फ़ाइलों को इकट्ठा करें।
    नोट: प्रत्येक परीक्षण एक फ़ाइल के अनुरूप होगा। इसका मतलब यह है कि प्रत्येक Ca2 + समाधान या सारकोमेरे लंबाई के लिए, एक संबंधित फ़ाइल होगी।
  2. एक ही कार्डियोमायोसाइट के सक्रिय और निष्क्रिय बलों की गणना करें।
    1. स्प्रेडशीट (चित्रा 3ए, सप्लीमेंट्री फाइल में परिशिष्ट ए)का उपयोग करके पहले सक्रियण (पीसीए =4.5 (1))के अनुरूप फाइल खोलें।
      नोट: हमने विश्लेषण करने के लिए कस्टम-मेड प्रोग्राम का इस्तेमाल किया। कृपया अनुपूरक फाइलमें परिशिष्ट ए देखें ।
    2. सेल के 1सेंट सुस्त (जब सेल सीए 2 + समाधान में डूब जाता है) के बाद औसत ≈60 मान पहले और औसत≈60 मान) होते हैं। ये 2 मान क्रमशः ए और बी के अनुरूप होते हैं।
    3. सेल के 2nd सुस्त के लिए एक ही विश्लेषण दोहराएं (जब सेल आराम समाधान में डूब जाता है)। ये 2 मान क्रमशः सी और डी के अनुरूप हैं।
    4. ए और बी (कुल बल, एफकुल)के बीच अंतर की गणना करें।
    5. सी और डी (निष्क्रिय बल, एफनिष्क्रिय)के बीच अंतर की गणना करें।
    6. सक्रिय बल की गणना करें, एफसक्रिय = एफकुल - एफनिष्क्रिय।
    7. कुल तनाव (टीकुल),निष्क्रिय तनाव (टीनिष्क्रिय)और सक्रिय तनाव (टीसक्रिय)प्राप्त करने के लिए सीएसए (ऊपर फार्मूला देखें) के लिए सभी बल मूल्यों को सामान्य करें।
    8. 2सक्रियण (पीसीए = 4.5 (2)) के लिए 9.2.1 से 9.2.5 तक दोहराएं।
    9. विश्लेषण के तहत कार्डियोमायोसाइट के टीटोटल,टीएक्टिव और टीनिष्क्रिय का प्रतिनिधित्व करने वालों के रूप में इन मूल्यों पर विचार करें।
      नोट: पीसीए 4.5 (1) के साथ सेल की पहली सक्रियता आमतौर पर सेल आयामों में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है। इस कारण से, पीसीए 4.5 के साथ दूसरा सक्रियण अधिक सटीक है और इसका उपयोग किया जाना है।
    10. प्रत्येक फाइल/पीसी परीक्षण समाधान (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5 (3)) के लिए चरण 9.2.1 से 9.2.5 तक दोहराएं।
  3. एक कार्डियोमायोसाइट के पीसीए50 और एनहिल की गणना करें।
    नोट: इस विश्लेषण के लिए, फ़ाइलों से गैर-सामान्यीकृत एफसक्रिय मूल्यों का उपयोग 4.5 (2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 और 4.5 (3)।
    1. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में रखें प्रत्येक सीए2 + समाधान परीक्षण (4.5 (2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5 (3)) के लिएसक्रिय एफ के सभी गैर-सामान्यीकृत मूल्य।
    2. सुधार कारक की गणना करें = एफसक्रिय [4.5 (2)] - एफसक्रिय [4.5 (3)] /
    3. एफएक्टिव - करेक्शन फैक्टर को घटाकर प्रत्येक सीए2 + समाधान (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) के लिएसक्रिय एफ के सही मूल्यों की गणना करें।
    4. संबंधित सही मूल्य द्वारा प्रत्येक एफसक्रिय मूल्यों को सामान्य करके प्रत्येक सीए2 + समाधानों के लिए सापेक्ष बल (एफसापेक्ष)की गणना करें।
      नोट: एफरिश्तेदार [4.5 (3)] 1 बराबर होना चाहिए । प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुरू होता है और सीए2 + एकाग्रता (पीसीए 4.5 (2) और 4.5 (3)) संतृप्त पर एक नियंत्रण सक्रियण के साथ समाप्त होता है। यह अधिकतम Ca2 +-सक्रिय बल (एफ मैक्स) में परिवर्तन की तुलना के माध्यम से तैयारी के ठहरनेवाला को सामान्य बनाने और मूल्यांकन करने की अनुमतिदेता है। यदि प्रायोगिक प्रोटोकॉल के अंत में, कार्डियोमायोसाइट पहले संकुचन के अधिकतम बल का कम से ७०% से कम उत्पादन करता है, कि सेल/माप विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए ।
    5. एफरिश्तेदार और इसी पीसीए मूल्यों का उपयोग करें निम्नलिखित समीकरण एफ (सीए) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill)के साथ एक सिग्मॉयडल वक्र के लिए फिट करने के लिए।
    6. ऊपर उल्लिखित समीकरण से पीसीए और एनहिल मूल्यों को एक्सट्रपलेट करें।
  4. एक ही कार्डियोमायोसाइट के बल पुनर्विकास (केटीआर) की दर की गणना करें।
    1. 1 सेंट सेल सुस्त के तुरंत बाद मूल्यों से मेल खाती है कि वक्र के लिए एक फिट प्रदर्शन करतेहैं।
    2. वक्र की ढलान की गणना करें और यह मूल्य बल पुनर्विकास की दर के अनुरूप होगा।
    3. प्रत्येक सीए 2 + समाधान के लिए 9.4.1 और9.4.2 दोहराएं।
      नोट: एक गरीब वक्र फिट सबसे कम सीए समाधान (आर चुकता≤०.९०) के लिए प्राप्त किया जाएगा ।

Representative Results

कार्यात्मक परिधीय कार्डियोमायोसाइट्स पूरे प्रयोग में एक समान और एक सुसंगत स्ट्रेशन पैटर्न के साथ दिखाई देना चाहिए। यद्यपि लंबे प्रयोगों के बाद कुछ हद तक गिरावट और बल में कमी की उम्मीद है, सक्रिय तनाव के मूल्य अपेक्षाकृत स्थिर होने चाहिए। स्ट्रेंशन लॉस या महत्वपूर्ण बल कमी (< 15kn∙m-2 या <80% अपने प्रारंभिक सक्रिय बल के स्पष्ट संकेत दिखाने वाली कोशिकाओं को बाहर रखा जाना चाहिए। तालिका 6 कृंतक, सूअरों और मानव नमूनों से प्राप्त सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों के लिए अपेक्षित सामान्य मूल्यों को प्रदर्शित करता है।

प्राप्त पैरामीटर मुख्य रूप से चुने गए प्रोटोकॉल पर निर्भर करते हैं। चित्रा 5 3 के प्रतिनिधि बल निशान से पता चलता है, 8 में से, बल रिकॉर्डिंग के लिए बाहर myofilaments Ca2 +-संवेदनशीलताका एक प्रोटोकॉल ले जाने की जरूरत है । कोशिका को सक्रिय समाधान युक्त अच्छी तरह से स्थानांतरित करके, कार्डियोमायोसाइट तब तक बल विकसित करना शुरू कर देता है जब तक कि यह एक पठार तक नहीं पहुंच जाता। एक त्वरित सुस्त परीक्षण (1 एमएस की अवधि) के बाद, जिससे कार्डियोमायोसाइट अपनी लंबाई के 80% तक छोटा हो जाता है, हम शून्य बल के आधारभूत मूल्यों को प्राप्त करते हैं। सुस्त परीक्षण के बाद, सेल को सक्रिय समाधान में डूबे हुए के रूप में बल विकसित करने के लिए जारी है । कुल बल (एफकुल)की गणना न्यूनतम मूल्य से पठार मूल्य को घटाकर की जाती है। इस वक्र के पिछले भाग की ढलान हमें बल पुनर्विकास (केटीआर)(चित्रा 6)की दर का मूल्य देती है, जो क्रॉस-ब्रिज अटैचमेंट और टुकड़ी (एफऐप और जीआप)10की स्पष्ट दर का एक उपाय है। जब केटीआर आर2 मूल्य & 0.90 है तो केटीआर मूल्य को बाहर रखा जाना चाहिए और आमतौर पर यह कम सीए2 + सांद्रता (पीसीए 5.6, 5.8 और 6.0) पर होता है। कोशिका को आराम समाधान युक्त अच्छी तरह से वापस स्थानांतरित करने के बाद, सेल आराम करता है और इसके बल गिरता है। निष्क्रिय बल (एफनिष्क्रिय)की गणना बल के इस नए मूल्य के लिए न्यूनतम मूल्य (लंबे समय तक सेल छोटा होने के बाद प्राप्त) को घटाकर की जाती है। एफकुल और एफनिष्क्रियके बीच अंतर से सक्रिय बल परिणाम ।

कार्डियोमायोसाइट की विशेषता वाले अधिकतम सक्रिय और निष्क्रिय बल एक संतृप्त सीए2 +-समाधान (पीसीए = 4.5) के साथ दूसरी सेल सक्रियण से प्राप्त होता है। पहली सक्रियता को आमतौर पर छोड़ दिया जाता है क्योंकि सारकोमेरे लंबाई को अक्सर पुन: समायोजित करने की आवश्यकता होती है।

एक myofilament Ca2 +-संवेदनशीलताप्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए, कम से कम 9 सक्रियण परीक्षण (4.5; 4.5; 5.2; 56; 6.0; 5.0; 5.4; 5.8 और 4.5) करना आवश्यक है। यह अनुक्रम केवल उदाहरण है, लेकिन हमेशा 4.5 (दो बार) के साथ शुरू करना चाहिए और 4.5 के साथ समाप्त होना चाहिए। एक myofilament Ca2 +-संवेदनशीलता प्रोटोकॉल के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की प्रोग्रामिंग अनुपूरक फ़ाइलके चित्र 1 में चित्रित किया गया है ।

इन सभी सक्रियता समाधानों के लिए सक्रिय बल की गणना करने के बाद, जांचें कि क्या अंतिम सक्रियता प्रारंभिक अधिकतम बल का 80% से अधिक उत्पीक हुई है (अन्यथा इस सेल परिणामों को खारिज कर दिया जाना चाहिए, जैसा कि ऊपर बताया गया है)। प्रायोगिक श्रृंखला के दौरान एफमैक्स में गिरावट के लिए सही करने के लिए, डेटा बिंदुओं को सामान्य करने के लिए इंटरपोलेटेड एफअधिकतम मूल्यों का उपयोग किया जा सकता है। सामान्यीकृत डेटा निम्नलिखित समीकरण एफ (सीए) = सीएएनहिल/(Ca50nHill + CanHill)के साथ एक सिग्मोइडल वक्र के लिए फिट किया जा सकता है । प्राप्त पैरामीटर मान कैल्शियम संवेदनशीलता (सीए50)का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसे पीसीए50 और सहयोगशीलता (एनहिल) में परिवर्तित किया जा सकता है। पार अनुभागीय क्षेत्र में सामान्यीकरण के बाद सभी बल मूल्यों को तनाव मूल्यों में परिवर्तित किया जा सकता है। माइलॉयमेंट सीए2 +-संवेदनशीलता और लंबाई पर निर्भर सक्रियण प्रोटोकॉल के अलावा, अन्य परीक्षण किए जा सकते हैं। टीएक्टिव,टीपैसिव (फिगर 7)और कार्डियोमायोसाइट अवशिष्ट बल की सारकोमेरे लंबाई निर्भरता का मामला ऐसा ही है। अवशिष्ट बल रिकॉर्डिंग की गणना सेल (80%) की लंबाई परिवर्तन के बाद पहुंचने वाली प्रारंभिक बल वसूली (पीसीए 4.5) से की जाती है और प्रत्येक कुल स्थिर राज्य बल के लिए सामान्यीकृत लंबाई परिवर्तन11से पहले पहुंच गया . अवशिष्ट बल में वृद्धि आमतौर पर धीमी टुकड़ी कीइनेटिक्स और उच्च कठोरता के साथ क्रॉस-ब्रिज का संकेत देती है।

अंत में, हमें इस बात पर जोर देना चाहिए कि इस तकनीक को जमे हुए या हौसले से एकत्र किए गए नमूनों से यांत्रिक रूप से निकाले गए चमड़ी वाले कार्डियोमायोसाइट्स में किया जा सकता है, साथ ही साथ इसकी झिल्ली के पारमेबिलाइजेशन के बाद अलग-थलग किया जा सकता है। जिस तरह से कार्डियोमायोसाइट्स अलग प्रभावों को काफी इस तकनीक से प्राप्त परिणाम हैं। चित्रा 8 तीन अलगाव प्रक्रियाओं के बीच मनाया मतभेदों को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: परीक्षण तंत्र की एकीकृत योजना। परीक्षण उपकरण में माइक्रोस्कोप, माइक्रोमैनीपुलेटर और संबंधित कंप्यूटर शामिल हैं। आंकड़े के नीचे मोटर और बल ट्रांसड्यूसर के बीच चिपके एक चमड़ी कार्डियोमायोसाइट से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल अलगाव, पारमेबिलाइजेशन और ग्लूइंग के प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट। ऊपरी बाएं कोने की छवि 4 छवियों से बना है जो रिलैक्स-आईएसओ समाधान(ए)में पेट्री डिश में दिल के नमूने के टुकड़े दिखाते हैं,(बी)ऊतक के यांत्रिक समरूपीकरण के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूब में,(सी)होमोजेनाइजर,(डी)समरूपता के तुरंत बाद ऊतक और(ई)जब यह ट्राइटन परमीबिलाइजेशन के लिए एक ट्यूब में होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एक चमड़ी कार्डियोमायोसाइट की लंबाई और सारकोमेरे लंबाई का निर्धारण। ≈2.2 माइक्रोन की एक सारकोमेरे लंबाई पर सेल की लंबाई और चौड़ाई निर्धारण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लंबाई पर निर्भर सक्रियण प्रोटोकॉल (विट्रो में फ्रैंक-स्टारलिंग तंत्र की नकल करता है)। प्रतिनिधि बल के निशान और पैरामीटर मायोफिलमेंट्स सीए2 + संवेदनशीलता प्रोटोकॉल से प्राप्त पहले(ए,1.8 माइक्रोन) और कार्डियोमायोसाइट को 2.2 माइक्रोन(बी)तक खींचने के बाद किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Myofilaments Ca2 +-संवेदनशीलता प्रोटोकॉल। प्रतिनिधि बल निशान और व्युत्पन्न मापदंडों। सादगी की खातिर, 8 में से केवल 3 बल घटता चित्रित कर रहे हैं। अर्थात् एक कार्डियोमायोसाइट संतृप्त, एक मध्यवर्ती और सबसे कम सीए2 +युक्त समाधान (क्रमशः 4.5, 5,6 और 6.0) के साथ सक्रिय होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: विभिन्न कैल्शियम समाधान और संबंधित केटीआर फिट वक्र पर सक्रिय चूहों कार्डियक सेल से प्रतिनिधि निशान। (A)पीसीए 4.5; (ख)पीसीए 5.0; (C)पीसीए 5.2; (घ)पीसीए 5.4; (ई)पीसीए 5.6; (एफ)पीसीए 6.0 और कुल के लिए ई मान, निष्क्रिय और सक्रिय तनाव, केटीआर मूल्य और केटीआर फिट के लिए Rsquare। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: टीनिष्क्रिय (ए) और टीसक्रिय (बी) की सारकोमेरे लंबाई निर्भरता के प्रोटोकॉल। निष्क्रिय तनाव और सक्रिय तनाव की गणना एक ही कार्डियोमायोसाइट में 1.8 माइक्रोन से 2.3 माइक्रोन की सरकोम की लंबाई में की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: कार्डियोमायोसाइट्स के लिए प्रतिनिधि परिणाम यांत्रिक रूप से ताजा ("ताजा") और जमे हुए मायोकार्डियल नमूनों ("फ्रोजन") के साथ-साथ ट्राइटन ("कोलैग+ ट्राइटन") के साथ पीछे के पार होने के साथ कोलेजन पचाने वाले दिल (संशोधित लैंगगेनडोर्फ तकनीक) से अलग हो जाते हैं। (A)कुल तनाव,(बी)सक्रिय तनाव और(C)कार्डियोमायोसाइट्स से Pasisve तनाव ≈२.२ माइक्रोन की एक सारकोमेरे लंबाई पर पीसीए ४.५ समाधान के साथ सक्रिय (D)कैल्शियम संवेदनशीलता वक्र और(ई)pCa50 और(एफ)nHill के लिए संबंधित मूल्यों । (जी)अवशिष्ट बल और(एच)केटीआर मूल्यों की गणना अधिकतम सक्रियण समाधान (पीसीए 4.5) पर की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पर स्टोर स्टॉक समाधान [एम] अंतिम मात्रा (एमएल) वजन/मात्रा नोट्स
4 डिग्री सेल्सियस पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) 1 100 5.611 ग्राम पीएच को समायोजित करने के लिए
4 डिग्री सेल्सियस पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) 5 50 14.03 ग्राम पीएच को समायोजित करने के लिए
4 डिग्री सेल्सियस बीईएस 1 50 10.66 ग्राम
4 डिग्री सेल्सियस प्रोपियोनिक एसिड 1 100 7.483 एमएल पीएच को 5M या 1M KOH के साथ 7.0 पर समायोजित करें
4 डिग्री सेल्सियस CaEGTA से बना: 0.1 100 1 घंटे से अधिक समय तक समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस तक मिलाएं और गर्म करें। पीएच को 1M KOH के साथ 5-6 पर समायोजित करें।
- CaCO3 0.1 1.001 ग्राम
- टिट्रिप्लेक्स (ईजीटीए) 0.1 3.804

तालिका 1: स्टॉक समाधान तैयार करने के निर्देश।

आराम-आईएसओ (कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए) [एमएमए] वजन
एनए 2एटीपी 5.95 3.28 ग्राम
एमजीसीएल2.6H2O 6.04 1.23 ग्राम
ट्राइटिपेक्स (ईजीटीए) 2 0.76 ग्राम
केसीएल 139.6 10.41 ग्राम
इमिडाजोल 10 0.68 ग्राम

तालिका 2: आराम-आईएसओ समाधान तैयारी के लिए निर्देश।

समाधान को सक्रिय करना (माप के लिए) [एमएमए] वजन/मात्रा
एनए 2एटीपी 5.97 0.823 ग्राम
एमजीसीएल 1M 6.28 1.57 एमएल
प्रोपियोनिक एसिड 40.64 10.16 एमएल
बीईएस 100 25 एमएल
CaEGTA (स्टॉक समाधान पहले से तैयार) 7 17.5 एमएल
एनए 2पीसीआर 14.5 0.925 ग्राम

तालिका 3: समाधान तैयार करने को सक्रिय करने के निर्देश।

आराम समाधान (माप के लिए) [एमएमए] वजन/मात्रा
एनए 2एटीपी 5.89 0.325 ग्राम
एमजीसीएल 1M 6.48 0.65 एमएल
प्रोपियोनिक एसिड 40.76 4.08 एमएल
बीईएस 100 10 एमएल
टिट्रिप्लेक्स (ईजीटीए) 6.97 0.265 ग्राम
एनए 2पीसीआर 14.5 0.370 ग्राम

तालिका 4: समाधान तैयार करने में ढील देने के निर्देश।

पीसीए = -लॉग [Ca2+] आराम (पीसीए = 9.0)
मिलिलिटर		 अतिवाटिंग (पीसीए = 4.5)
मिलिलिटर
5 0.86 39.14
5.1 1.2 38.80
5.2 1.54 38.46
5.3 2 38.00
5.4 2.51 37.49
5.5 3.14 36.86
5.6 3.89 36.11
5.7 4.8 35.20
5.8 5.89 34.11
5.9 7.14 32.86
6 8.57 31.43

तालिका 5: पीसीए समाधान तैयार करने के निर्देश।

प्राचल कृंतक सुअर मनुष्‍य
सक्रिय तनाव, केएन.m-2 (2.2 माइक्रोन पर) 17 – 28 19 – 40 19 – 36
निष्क्रिय तनाव, केएन.m-2 (2.2 माइक्रोन पर) 3.6 – 5.5 1.9 – 6.8 1.8 – 2.3
पीसीए50 5.58 – 5.64 5.40 – 5.50 5.43 – 5.82
नहिल 2.60 – 2.76 2.95 – 3.36 2.99 – 3.10
केटीआर, एस-1 4.00 – 8.00 1.00 – 3.00 0.90 – 2.00

तालिका 6: कृंतक, सूअरों और मनुष्यों से एकल परमीबिलाइज्ड कार्डियोमायोसाइट्स से प्राप्त विशिष्ट पैरामीटर और सूचकांक। 12से अनुकूलित ।

समस्या संभावित कारण विलयन
अधिकतम सक्रियण के दौरान कार्डियोमायोसाइट डिटैश अपर्याप्त चिपकाने का समय; गोंद पुराना है और सूख गया है ग्लूइंग स्टेप के समय को बढ़ाएं; एक नई गोंद ट्यूब खोलने पर विचार करें।
सेल निलंबन समाधान में ट्राइटन® है, जिसे अब हटाया नहीं जा सकता है एक या दो अतिरिक्त ट्राइटन के साथ निष्कर्षण प्रक्रिया दोहराएं® कदम धोएं
कार्डियोमायोसाइट नियंत्रण की स्थिति में कम बल है निष्कर्षण गलत हो गया और कम गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को दिया नमूना आकार बढ़ाएं और एक नया निष्कर्षण करें। यदि समस्या बनी रहती है शायद अनुचित नमूना संग्रह के कारण है - इस नमूने को त्यागें
सेल करार दिख रहा है लेकिन कोई बल दर्ज नहीं किया जाता है; सेल असामान्य बल मूल्यों है फोर्स ट्रांसड्यूसर बंद है इसे चालू करें
बल ट्रांसड्यूसर अच्छी तरह से कैलिब्रेट नहीं है ज्ञात वजन के एक सेट का उपयोग करके बल ट्रांसड्यूसर को कैलिब्रेट करें (निर्माता के अनुदेश मैनुअल की जांच करें)।
बल ट्रांसड्यूसर सुई ढीली है सुई फिर से क्रिस्टल बांड 509 या जौहरी मोम का उपयोग कर गोंद।
स्ट्रेशन पैटर्न सारकोमेरे लंबाई निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है अपर्याप्त प्रकाश माइक्रोस्कोप प्रकाश बढ़ाएं या सेल को कवरस्लिप में वापस ले जाएं और फिर से सारकोमर लंबाई का आकलन करें (कुओं में कम प्रकाश तीव्रता होती है)
निष्कर्षण गलत हो गया और कम गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को दिया नमूना आकार बढ़ाएं और एक नया निष्कर्षण करें
सुई के सुझाव एक ही विमान में नहीं हैं माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके, एक केंद्रित सारकोमर्स खोजने तक सुइयों के सुझावों को ऊपर या नीचे समायोजित करें
अधिग्रहण के दौरान कोई लंबाई और/या बल भिन्नता नहीं मोटर या बल ट्रांसड्यूसर बंद हैं उन्हें चालू करें
मोटर टूट गया है और सेल छोटा उत्पादन नहीं इसे बदलें या एक समारोह जनरेटर का उपयोग करके इसे कैलिब्रेट करने की कोशिश करें
अधिग्रहण रिकॉर्डिंग पर बहुत ज्यादा शोर उपकरणों के चारों ओर बहुत अधिक हवा का प्रवाह उपकरणों को सीधे हवा के प्रवाह से बचाें
उपकरण के आसपास भी कई कंपन स्थिरीकरण तालिका की सलाह दी जाती है। फिर भी, किसी भी उपकरण को हटाने की सिफारिश की जाती है जिसमें कंप्रेसर हो सकता है या कंपन उत्सर्जित हो सकता है (फ्रीजर, फ्रिज)
Ca2 +-संवेदनशीलता वक्र में अजीब मूल्य होते हैं और बल मूल्य [सीए2 +] के साथ नहीं बढ़ते हैं। सक्रिय करने और आराम समाधान का मिश्रण ठीक से नहीं किया गया था (संभवतः अपर्याप्त मिश्रण के कारण, तरीकों अनुभाग के 3.10 से 3.14 की जांच करें) एक ही एकाग्रता के साथ शीशियों को डिफ्रॉस्ट करें, एक ही बीकर में सभी शीशी की सामग्री एकत्र करें, एक उभार के साथ मिलाएं और उन्हें फिर से विभाजित करें। इन समाधानों को फिर से एक नई सेल में परीक्षण करें। यदि यह समस्या का समाधान करता है, Ca2 +युक्त समाधान का एक नया बैच तैयार

तालिका 7: समस्या निवारण तालिका।

Discussion

चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके कार्डियक फ़ंक्शन का इन विट्रो मूल्यांकन शारीरिक (जैसे, खिंचाव) और पैथोलॉजिकल संदर्भ (जैसे, इस्केमिया) में कार्डियोमायोसाइट स्तर पर होने वाले संशोधनों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। इस पद्धति के कई फायदे हैं जैसे कि डिफ्रॉस्टेड नमूनों से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स में कार्य का आकलन करने के लिए मायोकार्डियम की न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता होती है; प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला (चूहों13,चूहा 1,14, 15,खरगोश16,सुअर17,कुत्ता18,गिनी पिग19 और मानव20)और अटरिया, बाएं और दाएं वेंट्रिकल्स या अवर्णित दिल के एक विशिष्ट क्षेत्र सहित विभिन्न हृदय स्थानों से कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करना। इसके अलावा, यह तकनीक अपने मूल विन्यास में नियामक और अनुबंधित संरचनाओं के कार्य को मापने के दौरान सीए2 + और ऊर्जा (एटीपी) की विशिष्ट सांद्रता देने की अनुमति देती है।

इस तकनीक की सादगी के बावजूद, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। नमूना संग्रह सहित शुरू से ही प्रत्येक चरण की गुणवत्ता की गारंटी देना आवश्यक है। मायोफिलमेंट प्रोटीन21को प्रोटीज के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस प्रकार इसके संग्रह के तुरंत बाद तरल नाइट्रोजन में नमूनों को स्टोर करना अनिवार्य है। ताजा नमूने, जो पहले जमे हुए नहीं थे, काफी उच्च बलों का विकास होगा, इसलिए एक ही प्रोटोकॉल में ताजा और जमे हुए नमूनों में किए गए माप को मिलाना उचित नहीं है। दूसरा सबसे महत्वपूर्ण कदम कार्डियोमायोसाइट्स की निष्कर्षण है। इस प्रक्रिया के दौरान, अधिकांश समय बर्फ पर नमूने को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक्सट्रेक्शन/परमीलाइजेशन22के दौरान प्रोटीन के क्षरण के जोखिम को कम करने के लिए प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल का उपयोग किया जा सकता है । तीसरे, नमूनों को सटीक स्केलपेल आंदोलनों का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में काटा जाना चाहिए क्योंकि हमने कम गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स को नोट किया था जब इस कदम की अवहेलना की गई थी। एक और महत्वपूर्ण कदम कार्डियोमायोसाइट्स को धोना है क्योंकि ट्राइटन को धोने के बीच सही संतुलन होना मुश्किल है (कोशिका को पार करता है लेकिन इसकी अनग्लूइंग को बढ़ावा देता है) और यथासंभव सुपरनैंट में कई कोशिकाओं को रखते हुए। प्रत्येक नमूने, प्रजातियों या प्रोटोकॉल के लिए पहले निकासी और वॉशआउट की संख्या का प्रयास करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, हमारे हाथों में, हमने कहा कि ZSF1 मोटापे से ग्रस्त चूहा ऊतक निष्कर्षण एक "फैटी" पहलू है, जो इन कोशिकाओं को ग्लूइंग के दौरान और अधिक फिसलन बना दिया है, लेकिन अधिक मुश्किल को मापने के लिए नहीं है । जिस तरह से हम इस समस्या को दरकिनार करने के लिए और अधिक प्रयोगों प्रदर्शन के लिए पशु प्रति कोशिकाओं की एक उचित संख्या है । इसके अलावा, गोंद के लिए एक अच्छी कोशिका का चयन करना महत्वपूर्ण है, अर्थात् अच्छी स्ट्रेशन और उचित लंबाई के साथ। यदि कार्डियोमायोसाइट में ये विशेषताएं नहीं हैं, तो यह ज्यादातर सुई युक्तियों से अलग हो जाएगा या कोई/कम बल विकसित नहीं करेगा। यह भी कार्डियोमायोसाइट लगाव के लिए सही गोंद का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, चिपकाने के समय और उसकी प्रभावकारिता को ध्यान में रखते हुए सुई के लिए सेल गोंद । हमारे हाथों में, सिलिकॉन गोंद(सामग्री की तालिका)तेजी से (10-15 मिनट) और काफी मजबूत इलाज करता है। अंत में, अंतिम महत्वपूर्ण कदम कोशिका को चिपकाने के बाद कार्डियोमायोसाइट 5 मिनट को सावधानीपूर्वक उठाने से संबंधित है (सेल को कवर्लिपी में चिपकाने से बचने के लिए) और इसे कुओं में ले जाने से पहले (माइक्रोस्कोप चरण द्वारा खींचे जाने के लिए कोशिका से बचने के लिए)। तालिका 7 इस तकनीक से जुड़े समस्या निवारण, इसके अंतर्निहित कारणों और लगातार समस्याओं को दूर करने के लिए संभावित समाधानों का सारांश देती है।

इस विधि की प्रमुख सीमा यह है कि यह माइलोफिलमेंट अनुबंध से संबंधित सभी प्रश्नों का उत्तर नहीं दे सकता है, जैसे कि मायोफिलमेंट कितनी तेजी से सक्रिय/निष्क्रिय हो जाते हैं । वीवो सेटिंग में, झिल्ली डीपोलराइजेशन, इंट्रासेलुलर सीए2 + वृद्धि और मायोफ्लामेंट्स के लिए इसके प्रसार को अनुबंध करने के लिए मायोसाइट्स के लिए होने की आवश्यकता होती है, जबकि चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स सीए2 + फैलन में माइसोफिलामेंट्स के लिए तुरंत होता है जब सेल सीए2 + समाधान में डूब जाता है। सीए2 + प्रसार की यह तेज दर 23 को कमि़ों की सक्रियता/निष्क्रियता विश्लेषण23को पूर्वाग्रह देगी ।

ये प्रयोग विभिन्न कारकों से प्रभावित होते हैं, जिनमें तापमान, समाधान पीएच, यांत्रिक क्षोभ (सुस्त-पुनः खिंचाव बनाम सुस्त) और सेल अटैचमेंट प्रक्रियाएं (पिन टाई बनाम गोंद), ये सभी चर केटीआर के संदर्भ में साहित्य विसंगतियों के लिए लेखांकन और बल4,12में सारकोमरे लंबाई-निर्भर वृद्धि शामिल हैं।

तकनीक की भविष्य की प्रगति में पारियबिलीकृत कार्डियोमायोसाइट्स के बजाय अक्षुण्ण में कार्यात्मक अध्ययन करना शामिल है। इस तकनीक में कार्डियोमायोसाइट्स पर भरोसा करने का नुकसान है हौसले से अलग (पहले जमे हुए नहीं)। एक और महत्वपूर्ण मुद्दा सीधे इस पद्धति से संबंधित नहीं है, लेकिन यह काफी प्रभाव हो सकता है यह नमूना जमे हुए भंडारण की अधिकतम अवधि से संबंधित है । विशेष रूप से, पूरे भंडारण समय में माइलोफिलमेंट क्षरण की डिग्री स्थापित करना अनिवार्य है (यानी, निकाले गए कार्डियोमायोसाइट्स से प्राप्त अच्छी गुणवत्ता वाले कार्यात्मक डेटा को आश्वस्त करने के लिए कितने समय तक जमे हुए नमूनों को संग्रहीत किया जा सकता है)।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने पुर्तगाली फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी (एफसीटी), यूरोपीय संघ, क्वाड्रो डी रेफरेन्सिया एस्ट्राटेगिको नैसिनल (क्यूआरएन), फंडो यूरोपु डी डेसेवोल्विमेंटो क्षेत्रीय (फेडरर) और प्रोग्रामा ओपेरासिनल फैक्टर्स डी प्रतिस्पर्धी (प्रतिस्पर्धा) को यूआईसी (यूआईडी/आईसी/00051/2013) अनुसंधान इकाई के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद दिया । इस परियोजना को एफिलिव 2020 - प्रोग्रामा ऑपरेसिओनल प्रतिस्पर्धी ई इंटरनसिओनलिज़ाकाओ (पीओसीआई), परियोजना DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), पुर्तगाल 2020 साझेदारी समझौते के तहत Norte पुर्तगाल क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम (NORTE 2020) द्वारा समर्थित के माध्यम से फेडरर द्वारा समर्थित है, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) के माध्यम से, परियोजना NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), यूरोपीय संरचनात्मक और निवेश कोष, लिस्बन के क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम २०२० द्वारा समर्थित । पैट्रिसिया रॉड्रिग्स को एफसीटी (एसएफआरएच/बीडी/96026/2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और जोआओ अल्मेडा-कोएल्हो को यूनीवर्सिडा डो पोर्टो/एफएमयूपी और एफएसई-फंडो सोशल यूरोपू द्वारा वित्त पोषित किया गया था, NORTE 2020-Programa Operacional क्षेत्रीय क्या Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 34580
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) Sigma A2383
Calcium carbonate (CaCO3) Merck 1.02067.0500
Imidazole VWR 24720.157
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) Merck 1.05833.0250
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) Sigma M1028
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) Sigma B9879
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) Sigma P7936
Potassium chloride (KCl) Merck 1.04936.1000
Potassium hydroxide (KOH) Merck 8.14353.1000
Propionic acid (C3H6O2) Merck 8.00605.0500
Silicone Squeeze Tube Marineland 31003
Tritiplex (EGTA) Merck 1.08435.0025
Triton® X-100 10% Merck 648463
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) Terre Haute Glas-col
Length Controller (Model 315C-I) Aurora Scientific
Force Transducer (Model 403 A) Aurora Scientific
Software ASI 600A Aurora Scientific
Sotware VSL (Model 900B) Aurora Scientific
Inverted Microscope (IX51) Olympus

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References

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मेडिसिन अंक 160 चमड़ी वाले मायोसाइट्स चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स मायोकार्डियम बायोप्सी परमीबिलाइज्ड कार्डियोमायोसाइट्स कार्डियक फ़ंक्शन माइलोफिलामेंट्स
चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग कर कार्डियक फंक्शन का विट्रो मूल्यांकन
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Gonçalves-Rodrigues, P.,… More

Gonçalves-Rodrigues, P., Almeida-Coelho, J., Gonçalves, A., Amorim, F., Leite-Moreira, A. F., Stienen, G. J. M., Falcão-Pires, I. In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (160), e60427, doi:10.3791/60427 (2020).

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